影響因子：3.8

在航天飛行過(guò)程中炼蛤，宇航員的骨密度(BMD)在負(fù)重部位明顯下降妖爷。破骨細(xì)胞似乎會(huì)受到重力變化的影響，然而理朋，其分子機(jī)制尚不清楚赠涮。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)TRAP-GFP/Osterix-DsRed雙轉(zhuǎn)基因青鳉魚(yú)在國(guó)際空間站飼養(yǎng)56天后暗挑，其咽骨和牙齒區(qū)域的礦物質(zhì)密度降低笋除，破骨細(xì)胞被激活。電鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)炸裆，破骨細(xì)胞線(xiàn)粒體圓度較低垃它。在全轉(zhuǎn)錄組分析中，fkbp5和ddit4基因在飛行組中顯著上調(diào)烹看。這些魚(yú)的異常行為被拍攝下來(lái)国拇，有趣的是，青鳉魚(yú)在暴露的后期往往變得不動(dòng)惯殊。這些結(jié)果揭示了微重力下機(jī)械力的變化導(dǎo)致的生理功能受損酱吝，這種損傷伴隨著破骨細(xì)胞的激活。

目前認(rèn)為重力是影響骨組織構(gòu)建和重塑的關(guān)鍵因素土思。微重力環(huán)境的性質(zhì)使我們認(rèn)為务热，外力的改變會(huì)導(dǎo)致靜態(tài)感覺(jué)、細(xì)胞活動(dòng)和生理的失衡己儒。事實(shí)上崎岂，已知宇航員的骨密度會(huì)下降，這表明破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞會(huì)受到重力變化的影響闪湾。最近有報(bào)道稱(chēng)冲甘，雙膦酸鹽治療聯(lián)合運(yùn)動(dòng)對(duì)長(zhǎng)時(shí)間太空飛行期間的人類(lèi)骨丟失有保護(hù)作用，這表明破骨細(xì)胞在微重力下被激活途样。然而江醇，其機(jī)制尚不清楚;大多數(shù)體內(nèi)研究沒(méi)有顯示出太空飛行期間破骨細(xì)胞數(shù)量或活性的明顯變化。

為了研究微重力環(huán)境下動(dòng)物生長(zhǎng)過(guò)程中與骨形成和骨吸收相關(guān)的細(xì)胞活動(dòng)何暇，在本研究中陶夜，我們利用轉(zhuǎn)基因青鳉魚(yú)從幼年期到成年期的骨生長(zhǎng)進(jìn)行了太空實(shí)驗(yàn)。我們主要檢查了咽區(qū)赖晶，那里有很多破骨細(xì)胞律适，這個(gè)區(qū)域在成年魚(yú)中含有數(shù)百顆牙齒辐烂，因?yàn)檫@個(gè)區(qū)域的牙齒密度很高，所以對(duì)重力高度敏感捂贿。

在60天的微重力系統(tǒng)飼養(yǎng)中纠修，這些魚(yú)的異常行為被拍攝了下來(lái)。我們發(fā)現(xiàn)青鳉魚(yú)在國(guó)際空間站飼養(yǎng)56天后厂僧，其咽骨和牙齒的礦物質(zhì)密度下降扣草，破骨細(xì)胞被激活。在國(guó)際空間站飼養(yǎng)60天的青鳉魚(yú)頜骨組織的全轉(zhuǎn)錄組分析中颜屠，糖皮質(zhì)激素受體(GR)下游的幾個(gè)基因在飛行組中顯著上調(diào)辰妙。此外，我們發(fā)現(xiàn)15個(gè)線(xiàn)粒體相關(guān)基因表達(dá)增強(qiáng)甫窟，電鏡下可見(jiàn)破骨細(xì)胞線(xiàn)粒體圓度較低密浑。因此，我們的研究為微重力下骨丟失的調(diào)控提供了新的見(jiàn)解粗井。

材料與方法

本研究使用的是青鳉魚(yú)(O. latipes)的自交系野生型Cab尔破。實(shí)驗(yàn)按照日本宇宙航空研究開(kāi)發(fā)機(jī)構(gòu)(JAXA)機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)的政策和方案進(jìn)行。將魚(yú)置于28℃光照14 h /黑暗10 h的光照條件下飼養(yǎng)浇衬。采用隨機(jī)雜交法獲得魚(yú)卵懒构，并保持上述溫度不變。胚胎采集后在28℃孵育耘擂。孵化后置于室溫下孵育胆剧。早前，我們通過(guò)將用于顯示破骨細(xì)胞的TRAP-GFP系與用于顯示成骨細(xì)胞的Osterix-DsRed系交配醉冤，建立了雙轉(zhuǎn)基因青鳉魚(yú)秩霍，并利用了這雙轉(zhuǎn)基因系中的雜合子青鳉魚(yú)。

青鳉魚(yú)于1994年搭乘航天飛機(jī)升空冤灾，在第二個(gè)國(guó)際微重力實(shí)驗(yàn)室交配并維持了15天前域。至于青鳉魚(yú)的破骨細(xì)胞，我們之前報(bào)道了多核破骨細(xì)胞位于咽齒區(qū)域韵吨，通過(guò)使用TRAP啟動(dòng)子-GFP轉(zhuǎn)基因系來(lái)觀(guān)察破骨細(xì)胞，以研究骨重建過(guò)程中的骨吸收移宅。此外归粉，通過(guò)使用Osterix啟動(dòng)子-DsRed轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，成骨細(xì)胞被可視化漏峰。

將312條生長(zhǎng)水平相近的TRAP-GFP/Osterix-DsRed雙轉(zhuǎn)基因青鳉(參照鱗生長(zhǎng)確定)帶至貝Baikonur空間站糠悼，飼養(yǎng)至從頭尖到尾鰭尖的總長(zhǎng)度為16 mm。在此期間浅乔，以總長(zhǎng)度為指標(biāo)檢查青鳉的生長(zhǎng)水平倔喂，并將生長(zhǎng)水平較高的青鳉作為一組在同一水箱中飼養(yǎng)铝条。最后，采用旋轉(zhuǎn)儀對(duì)青鳉視力進(jìn)行檢查席噩，由4名裁判員對(duì)青鳉視力進(jìn)行評(píng)定班缰，并將青鳉分為4個(gè)等級(jí)。其中悼枢，16條魚(yú)(孵化6周后)被選擇在國(guó)際空間站(ISS)長(zhǎng)期飼養(yǎng)埠忘，另外8條魚(yú)在抵達(dá)ISS后被選擇作為mRNA來(lái)源。2012年10月23日馒索，聯(lián)盟號(hào)(編號(hào)32S)于10:51(格林尼治時(shí)間)從Baikonur發(fā)射莹妒。

視覺(jué)測(cè)試是根據(jù)早期使用青鳉進(jìn)行的飛行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的。這些魚(yú)被放在一個(gè)圓形的魚(yú)缸里绰上，魚(yú)缸的旋轉(zhuǎn)墻壁上畫(huà)著黑白相間的垂直條紋旨怠。當(dāng)墻旋轉(zhuǎn)時(shí)，魚(yú)有一種跟隨條紋游動(dòng)的傾向蜈块，從而在魚(yú)缸周?chē)蝿?dòng)运吓。有良好視力的魚(yú)會(huì)在魚(yú)缸周?chē)蝸?lái)游去，即使魚(yú)缸的墻壁旋轉(zhuǎn)得很快疯趟，而視力差的魚(yú)很快就會(huì)看到旋轉(zhuǎn)的條紋變得模糊而停止移動(dòng)拘哨。

水生棲息地是由JAXA根據(jù)用于航天飛機(jī)的水生動(dòng)物設(shè)施開(kāi)發(fā)的。這個(gè)水生棲息地被用來(lái)飼養(yǎng)小型淡水魚(yú)信峻，如青鳉或斑馬魚(yú)倦青，它們可以在太空中生活90天。該棲息地由一個(gè)封閉的水循環(huán)系統(tǒng)組成盹舞，該系統(tǒng)包括一個(gè)水循環(huán)單元产镐、用于交換循環(huán)水中溶解氣體的氣體交換器、一個(gè)用于水凈化的生物過(guò)濾器和2個(gè)作為魚(yú)類(lèi)棲息地的水族箱踢步。水循環(huán)裝置包括水泵癣亚、流量傳感器、溫度控制器和用于控制魚(yú)類(lèi)居住環(huán)境的蓄能器获印。水循環(huán)系統(tǒng)總水量為3.2 L述雾，每個(gè)水族箱水量為0.7 L。水族館有一個(gè)自動(dòng)喂食器兼丰，為魚(yú)提供人工粉狀食物玻孟。此外，每個(gè)水族館都配備了一個(gè)LED燈鳍征，用于產(chǎn)生晝夜周期黍翎，以及一個(gè)用于觀(guān)察魚(yú)類(lèi)的CCD相機(jī)。在JAXA的主頁(yè)上顯示了水生棲息地的輪廓和流動(dòng)示意圖艳丛。這些組件在國(guó)際空間站的日本實(shí)驗(yàn)艙(JEM)的多用途小有效載荷架(MSPR)中組裝匣掸。

魚(yú)類(lèi)在水生棲息地生活期間趟紊，水溫保持在25.5 ~ 26℃，每個(gè)水族箱的水量控制在0.1 L / min碰酝。通過(guò)與艙室氣體交換霎匈，使溶解氧飽和度保持在90%以上，采用硝化菌生物過(guò)濾器控制水質(zhì)砰粹。宇航員每周用試紙檢查水質(zhì)1 ~ 2次唧躲，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有氨或亞硝酸鹽的積累。使用白色LED燈獲得晝夜周期碱璃，控制在光照14小時(shí)(380 lux)和暗光照10小時(shí)(10 lux;這種昏暗的光被用于魚(yú)類(lèi)的背光反應(yīng))弄痹。通過(guò)水族箱內(nèi)的自動(dòng)喂食器，每天2次或3次給魚(yú)喂食Otohime B-1和Kyowa N250和N400三種粉狀食物嵌器。

青鳉魚(yú)被放置在“載魚(yú)器”中肛真，并乘坐聯(lián)盟號(hào)TMA-06M(俄羅斯聯(lián)邦航空公司)飛行。抵達(dá)國(guó)際空間站(ISS)的日本空間實(shí)驗(yàn)室KIBO后爽航，青鳉被運(yùn)送到“多用途小有效載荷架(MSPR)”的“水生棲息地(AQH)”進(jìn)行機(jī)載飼養(yǎng)蚓让。考慮到魚(yú)類(lèi)的背光響應(yīng)讥珍，從魚(yú)缸的上方照明历极。從儲(chǔ)罐底部自動(dòng)分配進(jìn)料。使用過(guò)濾器來(lái)自動(dòng)澄清水衷佃。隨后趟卸，在選定的時(shí)間，魚(yú)被“捕魚(yú)器”捕獲并運(yùn)輸?shù)健棒~(yú)固定裝置”氏义，用于分析組織學(xué)或mRNA表達(dá)锄列。

最初，每個(gè)水族箱飼養(yǎng)8條魚(yú)惯悠。飼養(yǎng)14 d后邻邮，用3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(三卡因)麻醉6條魚(yú)，用多聚甲醛(PFA)固定克婶，3 d后洗滌筒严，4℃保存在ISS的冰箱中。這6條魚(yú)樣本是2012年11月19日由聯(lián)盟號(hào)帶到地球的鸠补。在開(kāi)始飼養(yǎng)56天后萝风，另采集6條魚(yú)用于PFA固定，4天后洗滌紫岩，然后在4℃保存。此外睬塌，飼養(yǎng)開(kāi)始后60天泉蝌，剩余4條魚(yú)使用RNAlater (Sigma-Aldrich, MO, USA)處理歇万，并在ISS中保存在- 95℃。返回地球后勋陪，PFA固定的標(biāo)本被沖洗幾次贪磺，并儲(chǔ)存在鈣酸鹽緩沖液中。這些標(biāo)本在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間保持在4℃或- 95℃诅愚，并從莫斯科轉(zhuǎn)運(yùn)到日本寒锚。在飼養(yǎng)條件下，在相同的時(shí)間過(guò)程實(shí)驗(yàn)中违孝，在地面上采樣相同數(shù)量的魚(yú)類(lèi)作為對(duì)照刹前。對(duì)照組除航天飛行外，其余條件與飛行組相同雌桑。

為了比較地面組和飛行組青鳉魚(yú)的行為喇喉，在60d的實(shí)驗(yàn)中，每天用CCD攝像機(jī)記錄2 ~ 3次視頻校坑。

對(duì)整條青鳉進(jìn)行軟X射線(xiàn)成像(Sofron sro-M50, Sofron Co.拣技， ltd.東京，日本)耍目。采用ImageJ軟件測(cè)量白信號(hào)強(qiáng)度膏斤。咽骨區(qū)域的灰度值通過(guò)頭內(nèi)區(qū)域的背景進(jìn)行校正。

應(yīng)用圖像分析軟件(TRI/3D-view, Ratoc System Engineering, Tokyo, Japan)獲得咽骨和椎骨的三維重建圖像邪驮，分析微焦計(jì)算機(jī)斷層掃描(μ-CT;ScanXmate-E090 [147 μA, 48 kV];Comscan莫辨，神奈川，日本)耕捞。部分咽骨樣本采用SCANCO Medical μCT 35系統(tǒng)(145 μA, 55 kV, Nippon densi - SCANCO Medical, Brüttisellen, Switzerland)進(jìn)行高分辨率圖像分析衔掸，該系統(tǒng)具有3.5 μm的各向質(zhì)體素大小。采用日本denshio -Scanco Medical公司的Scanco μCT Version 6.1軟件對(duì)圖像進(jìn)行重建和分析俺抽，獲得病灶平均厚度敞映。采用外周定量ct (peripheral quantitative computed tomography, pQCT;XCT Research SA+;準(zhǔn)直器B，戰(zhàn)略醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司磷斧，普福爾茨海姆振愿，德國(guó))。由于青鳉魚(yú)脊椎的礦物質(zhì)含量遠(yuǎn)低于嚙齒動(dòng)物的骨骼弛饭，我們建立了新的骨密度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)冕末。因此，不能采用690 mg/cm³作為骨皮質(zhì)與骨小梁分離的標(biāo)準(zhǔn)侣颂。骨密度被認(rèn)為是局部骨密度超過(guò)100 mg/cm³的骨段档桃。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示憔晒。采用非配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較藻肄。被認(rèn)為是顯著的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p < 0.05)蔑舞。

用PFA固定的標(biāo)本用80%的甘油平衡。采用激光共聚焦顯微鏡(Olympus, Center Valley, PA;FV1000)嘹屯。所有連續(xù)圖像在咽骨和椎骨的間隔均為2 μm攻询。對(duì)每個(gè)組織的范圍進(jìn)行足夠的調(diào)整以包含組織的熒光。第56天上咽骨覆蓋130片州弟，下咽牙和骨覆蓋140片钧栖。第56天的椎骨被90個(gè)切片覆蓋。通過(guò)Volocity Demo (Perkin Elmer)軟件計(jì)算GFP和DsRed表達(dá)細(xì)胞的體積婆翔。我們避免了顏料熒光信號(hào)作為背景拯杠。

完成CLSM檢查后，從每只青鳉魚(yú)采集一對(duì)附著牙齒的下咽骨浙滤，分為左阴挣、右兩半。這些標(biāo)本通過(guò)一系列上升的乙醇脫水纺腊，嵌入Technovit 7100 (Heraeus Kulzer GmBH, wehheim /Ts畔咧，德國(guó))，并在低溫下聚合揖膜。將下咽骨和牙齒的Technovit固化塊連續(xù)切成4 μm厚的切片誓沸，并進(jìn)行von Kossa染色。在pH 5.8(37℃30 ~ 45 min)條件下壹粟，偶氮染色法檢測(cè)抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性拜隧。收集連續(xù)切片的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)字顯微照片，采用計(jì)算機(jī)軟件(Photoshop 7.0或CS5 Extended, Adobe, USA)分別統(tǒng)計(jì)von Kossa陽(yáng)性結(jié)構(gòu)(Kossa區(qū))和TRAP陽(yáng)性結(jié)構(gòu)(TRAP區(qū))的表面積(像素?cái)?shù))趁仙。計(jì)算飼養(yǎng)56 d組的Kossa/TRAP區(qū)域像素比洪添。飼養(yǎng)14 d組，計(jì)算TRAP面積/整個(gè)單位面積的像素比雀费。正常青鳉魚(yú)的咽骨和牙齒在相同的時(shí)間和正常重力下的攝食條件下被同樣處理和檢查干奢，并作為對(duì)照。利用計(jì)算機(jī)軟件DeltaViewer對(duì)von kossa陽(yáng)性礦化結(jié)構(gòu)和TRAP陽(yáng)性破骨細(xì)胞進(jìn)行三維重建盏袄。

每條魚(yú)的一對(duì)上咽骨和牙齒的一半在中和10%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液中脫鈣1周忿峻，然后石蠟包埋和切片。

對(duì)于免疫組織化學(xué)辕羽，我們使用了以下一抗:1∶1000的山羊抗gfp抗體(fitc標(biāo)記)(abcam, ab6662)逛尚、1∶1000的兔抗dsred抗體(Living Colors, 632496)和1∶200的兔抗pfak抗體(Invitrogen, 44624G)。二抗為1:1000的山羊抗兔Cy-3抗體(Jackson ImmunoResearch 711-165-152)刁愿。

在防止與2% BSA/TBS非特異性結(jié)合后绰寞，將切片與初級(jí)抗體在4℃反應(yīng)過(guò)夜，然后與二級(jí)抗體和DAPI在室溫下孵育30分鐘。采用激光共聚焦顯微鏡(Olympus, Center Valley, PA;FV1000)克握。

收集咽骨和牙齒連續(xù)切片的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)字顯微照片蕾管，使用計(jì)算機(jī)軟件(Photoshop CS4或ImageJ)分別測(cè)定抗gfp枷踏、抗dsred和抗pfak抗體反應(yīng)區(qū)域的熒光面積(像素?cái)?shù))和熒光強(qiáng)度(平均值)菩暗。我們從總DsRed信號(hào)中剔除了牙芽中的DsRed陽(yáng)性信號(hào)，因此我們只在56天飼養(yǎng)組的咽骨中使用DsRed信號(hào)旭蠕。

為了顯示膠原基質(zhì)停团，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明，使用Azan染色試劑盒(Muto Pure Chemicals Co.掏熬，ltd)的試劑對(duì)石蠟切片進(jìn)行染色佑稠。隨機(jī)選取牙胚，用計(jì)算機(jī)軟件(Photoshop CS4)確定藍(lán)色區(qū)域旗芬。

cDNA測(cè)序用于全轉(zhuǎn)錄組分析(Takara bio)舌胶。使用TruSeq RNA Sample Preparation Kit v2 (illuminakk.co.jp)構(gòu)建cDNA文庫(kù)。以PolyA+RNA片段為模板合成雙鏈cDNA疮丛。序列數(shù)據(jù)使用HiSeq系統(tǒng)(illuminakk.co.jp)和序列庫(kù)進(jìn)行分析幔嫂。

從用RNAlater保存的頜骨中提取總RNA，用PrimeScript RT試劑盒合成cdna并進(jìn)行g(shù)DNA Erase (TaKaRa)處理誊薄。RT-PCR檢測(cè)按照說(shuō)明書(shū)使用EX Taq (TAKARA)進(jìn)行履恩。引物序列如下:fkbp5f、tgtccagggtttgatgtggga;fkbp5r GTTCTTTGCGTTCCCGACTG;ddit4f GTCCAACAATGGCAGCAGAA;ddit4r TTCCTCCAGTGGGTCAAAGAA;gapdhf CTTGGATACACAGAGGACCAGG;gapdhr呢蔫、GCCAAACTCATTATCGTACCAT切心。

結(jié)果

首先，我們建立了TRAP啟動(dòng)子-GFP /Osterix啟動(dòng)子-Dsred雙轉(zhuǎn)基因青鳉魚(yú)片吊，因?yàn)樵谠撧D(zhuǎn)基因系中绽昏，咽部除牙芽外的破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞被2個(gè)熒光信號(hào)分隔。從312尾魚(yú)中俏脊，按照無(wú)病全谤、大小與生長(zhǎng)發(fā)育一致、視力良好3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)联予，篩選出24尾總長(zhǎng)16 mm(孵化后6周)的候選魚(yú)啼县。這24條候選魚(yú)類(lèi)被運(yùn)送到太空，并在國(guó)際空間站“Kibo”部分的AQH(水生棲息地)飼養(yǎng)了2個(gè)月沸久。在A(yíng)QH中開(kāi)始飼養(yǎng)后季眷，在第0天和第60天分別從8條魚(yú)和4條魚(yú)中分離出RNA，在國(guó)際空間站的宇航員的幫助下卷胯，在第14天和第56天分別用PFA固定了6條魚(yú)(補(bǔ)充表1)子刮。 

為了觀(guān)察青鳉魚(yú)對(duì)微重力環(huán)境的適應(yīng)，我們?cè)趦蓚€(gè)月的時(shí)間里拍攝了青鳉魚(yú)的獨(dú)特行為(圖1A)挺峡。在第0天的觀(guān)察中葵孤，即運(yùn)輸?shù)紸QH后的第1天，觀(guān)察到魚(yú)在水中緩慢游動(dòng)橱赠，很少出現(xiàn)“繞圈行為”尤仍，即在水中緊密地繞圈游動(dòng)，這表明魚(yú)有能力適應(yīng)微重力環(huán)境(補(bǔ)充視頻1)狭姨。在第14天宰啦，在被PFA固定之前，魚(yú)垂直和繞圈游動(dòng)饼拍，表現(xiàn)出倒立的行為赡模，似乎表明它們?cè)噲D在微重力下以適當(dāng)?shù)淖藙?shì)進(jìn)食或游泳(補(bǔ)充視頻2)。第27天师抄，在微重力條件下成功誘導(dǎo)魚(yú)交配(補(bǔ)充視頻3)漓柑。有趣的是，青鳉在第47天變得不動(dòng)叨吮，這表明它們表現(xiàn)得像運(yùn)動(dòng)功能低下的動(dòng)物(補(bǔ)充視頻4)辆布。這些視頻展示了為適應(yīng)微重力而特定的異常行為，表明飛行魚(yú)和宇航員一樣發(fā)生了生理變化挤安。

為了檢查骨組織谚殊，在第14天和第56天，將青鳉魚(yú)用4%多聚甲醛固定(圖1B)蛤铜。地面組和飛行組的總長(zhǎng)度測(cè)量(飼養(yǎng)前5天嫩絮，飼養(yǎng)開(kāi)始后14天和56天)顯示出相同的生長(zhǎng)趨勢(shì)(圖1C)。在咽部牙齒的發(fā)育方面围肥，微重力暴露的青鳉在第14天的牙齒數(shù)量略低于地面組剿干，但在第56天的牙齒數(shù)量幾乎與地面組相同(補(bǔ)充圖1)，這表明從牙胚形成的角度來(lái)看穆刻，飛行組的牙齒發(fā)育是正常的置尔。 

為了評(píng)價(jià)微重力下的礦化氢伟，我們對(duì)整魚(yú)進(jìn)行了軟x射線(xiàn)分析(圖2A)榜轿。飛行魚(yú)組第56天，與地面對(duì)照相比朵锣，咽骨區(qū)域的鈣化區(qū)域(白色信號(hào))減少(圖2B谬盐、C)，而第14天的鈣化無(wú)顯著差異(補(bǔ)充圖2)诚些。上咽骨和牙齒區(qū)域的礦物質(zhì)密度接近飞傀。與地面組相比，pQCT分析降低了24%(圖2D，地面組:129.417±13.904 mg/cm3 n = 6砸烦，飛行組:98.14±19.265 mg/cm3 n = 5, p < 0.05)弃鸦。此外，μCT成像顯示飛行組青鳉魚(yú)的骨骼較薄(圖2E)幢痘。對(duì)于椎體骨唬格，其骨密度略有下降(補(bǔ)充圖3)。此外雪隧，在另一個(gè)鈣化區(qū)域西轩，耳石的骨密度在飛行樣本和對(duì)照樣本之間沒(méi)有顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。

由于TRAP是破骨細(xì)胞的標(biāo)記物马僻，osterix是成骨細(xì)胞的標(biāo)記物庄拇，因此我們采用激光共聚焦掃描顯微鏡對(duì)第56天的整個(gè)上、下咽骨進(jìn)行成像(圖3A韭邓、B)措近。由于細(xì)胞體積是除吸收表面積外反映骨吸收能力的重要參數(shù)，根據(jù)理論計(jì)算細(xì)胞融合和骨吸收能力女淑，利用軟件測(cè)量熒光TRAP-GFP和Osterix-DsRed的體積瞭郑。通過(guò)對(duì)GFP(圖3C,D)和DsRed(圖3E,F)體積的定量分析，飛行組的GFP體積增加尤為明顯鸭你。由于咽骨的大小不同屈张，破骨細(xì)胞的體積被成骨細(xì)胞的體積歸一化，結(jié)果是GFP體積除以DsRed體積的相對(duì)比率在飛行過(guò)程中增加(圖3G,H)袱巨。這一發(fā)現(xiàn)表明阁谆，飛行組青鳉魚(yú)的破骨細(xì)胞體積比表達(dá)osterix的成骨細(xì)胞體積增大。然而愉老，椎體的熒光成像顯示只有輕微但沒(méi)有顯著的破骨細(xì)胞增大(補(bǔ)充圖4)场绿。接下來(lái)，為了檢測(cè)上咽骨中破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的熒光強(qiáng)度和面積嫉入，我們使用抗GFP和抗DsRed抗體進(jìn)行了雙重免疫染色(圖3I)焰盗。飛行組第56天的破骨細(xì)胞信號(hào)除以成骨細(xì)胞信號(hào)的比值計(jì)算出的相對(duì)熒光強(qiáng)度比地面組增加了50.4%(圖3J)，飛行組的破骨細(xì)胞區(qū)域除以成骨細(xì)胞信號(hào)計(jì)算出的相對(duì)熒光面積比地面組增加了23.8%(圖3K)咒林。另一方面熬拒，只有飛行組的熒光強(qiáng)度在第14天增加(補(bǔ)充圖5)。連續(xù)切片的全三維重建顯示映九，飛行組青鳉魚(yú)的GFP信號(hào)增強(qiáng)(補(bǔ)充視頻5)梦湘。由于破骨細(xì)胞是通過(guò)細(xì)胞融合而成熟的，我們確定了幾種具有不同核數(shù)的GFP陽(yáng)性破骨細(xì)胞的數(shù)量，例如捌议，1個(gè)核(單個(gè)核)哼拔，每個(gè)細(xì)胞2個(gè)核(圖3L)，每個(gè)細(xì)胞10個(gè)細(xì)胞核(圖3M)等瓣颅，并統(tǒng)計(jì)了含有這些細(xì)胞核數(shù)量的trap - gfp陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量(圖3N和補(bǔ)充表2)倦逐。這一結(jié)果表明，雖然核總數(shù)在地面組和飛行組之間沒(méi)有顯著差異(圖3O)宫补，但在微重力條件下檬姥，多核增加了。三維成像顯示飛行組上粉怕、下咽骨全區(qū)域破骨細(xì)胞熒光信號(hào)增強(qiáng)(補(bǔ)充視頻6)健民。

接下來(lái)豹障，為了檢測(cè)負(fù)責(zé)骨吸收的酶活性廷粒，我們?cè)诘?4天對(duì)下咽骨進(jìn)行了TRAP染色(補(bǔ)充圖6A-H)力麸。以單位面積表示的TRAP陽(yáng)性面積在飛行組中增加(補(bǔ)充圖6I)豹休。TRAP染色標(biāo)本的3D成像顯示了飛行組的動(dòng)態(tài)骨吸收(補(bǔ)充圖7)远搪。此外近尚，第56天的下咽骨被切片并染色以檢測(cè)TRAP活性爵憎，并使用Von Kossa檢查骨吸收與骨礦化面積的比例(圖4A)客燕。結(jié)果顯示該相對(duì)比率的增加(圖4B);飛行組的三維成像顯示trap陽(yáng)性區(qū)域的聚集鸳劳，表明那里存在大的破骨細(xì)胞(圖4C;補(bǔ)充視頻7)。這一發(fā)現(xiàn)與3D成像發(fā)現(xiàn)的飛行組下咽骨中GFP陽(yáng)性細(xì)胞的面積增加一致(補(bǔ)充圖8)也搓。因此赏廓，von Kossa染色中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)缺口，表明礦物質(zhì)可能從骨中溶解(圖4C)还绘。接下來(lái)楚昭，我們進(jìn)行了電子顯微鏡分析，以檢測(cè)破骨細(xì)胞細(xì)胞器的形態(tài)變化拍顷。我們的結(jié)果顯示抚太，在飛行組頜骨中，破骨細(xì)胞中的線(xiàn)粒體呈低圓度(圖4D和補(bǔ)充圖9)昔案。

為了研究飛行期間骨質(zhì)流失的分子機(jī)制，我們從第60天的青鳉魚(yú)頜骨中提取RNA踏揣，cDNA測(cè)序后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析庆亡。不幸的是，由于難以使用RNAlater保存喉后部的組織捞稿，從咽骨中提取的RNA似乎已發(fā)生降解又谋。頜骨和牙齒的骨被破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞重塑拼缝，類(lèi)似于咽骨的重塑(補(bǔ)充圖10)。根據(jù)我們的結(jié)果彰亥，成骨細(xì)胞基因的表達(dá)減少咧七，包括osterix和1型膠原蛋白的表達(dá)(補(bǔ)充表3)。azan染色顯示飛行組基質(zhì)中膠原蛋白的量有減少的趨勢(shì)(補(bǔ)充圖11)任斋，盡管通過(guò)電子顯微鏡檢查的成骨細(xì)胞形態(tài)在地面組青鳉魚(yú)和飛行組青鳉魚(yú)之間沒(méi)有差異(補(bǔ)充圖12)继阻。此外，RANKL和NFATc1的表達(dá)水平?jīng)]有顯著增加(數(shù)據(jù)未顯示)废酷，表明飛行組青鳉魚(yú)的破骨細(xì)胞沒(méi)有在成骨細(xì)胞的支持下被激活瘟檩。

為了發(fā)現(xiàn)異常線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)對(duì)破骨細(xì)胞的影響，我們檢測(cè)了線(xiàn)粒體相關(guān)分子澈蟆，包括糖皮質(zhì)激素受體(GR)通路墨辛。在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中，fkbp5和ddit4被發(fā)現(xiàn)是飛行組中轉(zhuǎn)錄水平升高最高的基因丰介。有趣的是背蟆，fkbp5在許多器官如鱗片、軀干的一部分哮幢、腦、肝志珍、卵巢和腸(Mitani博士橙垢，個(gè)人交流)以及飛行組的頜骨中被強(qiáng)烈和廣泛地誘導(dǎo)，通過(guò)RT-PCR分析證實(shí)了fkbp5的轉(zhuǎn)錄水平升高(補(bǔ)充表3和圖5A,B)伦糯。fkbp5和ddit4被認(rèn)為是GR下游的分子柜某，據(jù)報(bào)道GR可被剪切應(yīng)力激活。由于剪切應(yīng)力上調(diào)FAK的磷酸化敛纲，我們使用抗磷酸化FAK (pFAK)檢測(cè)其在破骨細(xì)胞中的磷酸化狀態(tài)喂击，并使用抗GFP抗體測(cè)定破骨細(xì)胞面積(圖5C)。pFAK信號(hào)通過(guò)除以GFP陽(yáng)性面積進(jìn)行歸一化(圖5D,E)淤翔，結(jié)果表明pFAK信號(hào)在飛行期間增強(qiáng)翰绊。這一結(jié)果表明，微重力對(duì)飛行組產(chǎn)生了應(yīng)力旁壮。此外监嗜，與地面對(duì)照組相比，15個(gè)線(xiàn)粒體相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)至少1.2倍(P < 0.05;補(bǔ)充表3)抡谐，破骨細(xì)胞相關(guān)基因cebpb裁奇、fosl1、fosB麦撵、c-fos和junb-b的表達(dá)較地面對(duì)照組增加至少1.5倍(P < 0.05;補(bǔ)充表3)刽肠。這些結(jié)果表明溃肪，在飛行組青鳉魚(yú)中，活化的破骨細(xì)胞中線(xiàn)粒體生物發(fā)生增強(qiáng)音五。

通過(guò)破骨細(xì)胞內(nèi)綠色熒光信號(hào)計(jì)算破骨細(xì)胞體積惫撰，免疫染色法檢測(cè)抗GFP抗體陽(yáng)性面積，TRAP染色法檢測(cè)酶活性放仗，觀(guān)察飛行組和地面對(duì)照組破骨細(xì)胞活性的變化润绎。所有這3種方法都顯示了咽骨區(qū)域的破骨細(xì)胞激活。飛行組第56天的多核破骨細(xì)胞數(shù)量增加诞挨，但GFP陽(yáng)性細(xì)胞核總數(shù)無(wú)明顯變化莉撇，表明在第56天的微重力環(huán)境下，破骨細(xì)胞分化并未增強(qiáng)惶傻，但促進(jìn)了破骨細(xì)胞融合過(guò)程棍郎。這些結(jié)果表明，在航天飛行中银室，已經(jīng)定位于骨表面的破骨細(xì)胞被激活涂佃，這與報(bào)道中宇航員負(fù)重部位的BMD特異性降低，更多的局部重塑部位受破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)一致蜈敢。

雖然有報(bào)告顯示辜荠，在太空飛行期間，人類(lèi)淋巴細(xì)胞系的線(xiàn)粒體發(fā)生了改變抓狭，但沒(méi)有報(bào)告表明在體內(nèi)或破骨細(xì)胞中發(fā)生這種影響的結(jié)果伯病。目前，我們?cè)陲w行組的頜骨組織中發(fā)現(xiàn)了線(xiàn)粒體異常否过，包括線(xiàn)粒體基因上調(diào)和破骨細(xì)胞線(xiàn)粒體圓度降低(細(xì)胞器形態(tài)的改變)午笛。最近研究發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞線(xiàn)粒體中的ATP協(xié)同調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞存活和骨吸收苗桂。飛行組的表型一致表明药磺，在微重力條件下，破骨細(xì)胞的活化可能受線(xiàn)粒體反應(yīng)的調(diào)節(jié)煤伟。如前所述癌佩，航天飛行會(huì)導(dǎo)致成骨細(xì)胞數(shù)量和活性的下降。在我們的結(jié)果中持偏，成骨細(xì)胞也輕度失活驼卖，盡管成骨細(xì)胞線(xiàn)粒體的圓度沒(méi)有顯著變化(數(shù)據(jù)未顯示)，這表明破骨細(xì)胞比成骨細(xì)胞受重力變化的影響更大鸿秆。

在轉(zhuǎn)錄組分析中酌畜，我們發(fā)現(xiàn)在糖皮質(zhì)激素受體(GR)下游的fkbp5和ddit4基因表達(dá)上調(diào)。此前有報(bào)道稱(chēng)卿叽，剪切應(yīng)力可激活GR及其轉(zhuǎn)錄信號(hào)通路桥胞。我們的結(jié)果一致地顯示了pFAK水平的增強(qiáng)恳守，而已知剪切力通過(guò)整合素信號(hào)通路在破骨細(xì)胞中增加了pFAK水平，這表明破骨細(xì)胞受微重力下指定的剪切應(yīng)力的調(diào)節(jié)贩虾。雖然遺傳學(xué)研究主要確定了FKBP5在抑郁癥中發(fā)揮作用催烘，并且體外研究表明，破骨細(xì)胞中FKBP5的過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)骨吸收上調(diào)缎罢，并且糖皮質(zhì)激素治療可增加破骨細(xì)胞中FKBP5的基因表達(dá)水平伊群。關(guān)于DDIT4在骨生物學(xué)中的作用，有報(bào)道稱(chēng)包括DDIT4在內(nèi)的缺氧誘導(dǎo)因子調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收策精，在破骨細(xì)胞對(duì)骨基質(zhì)相關(guān)的骨吸收的研究中舰始，發(fā)現(xiàn)fkbp9和ddit4的基因表達(dá)水平在破骨細(xì)胞中上調(diào)。此外咽袜，各種形式的應(yīng)激誘導(dǎo)FKBP5或DDIT4丸卷。綜上所述，我們的結(jié)果表明询刹，在太空的微重力環(huán)境下谜嫉，破骨細(xì)胞靠近的骨周?chē)h(huán)境的改變導(dǎo)致了破骨細(xì)胞線(xiàn)粒體的形態(tài)改變，從而激活了控制FKBP5和DDIT4表達(dá)的GR通路凹联，從而增強(qiáng)了破骨細(xì)胞的多核形成沐兰。未來(lái)，我們希望再次進(jìn)行空間實(shí)驗(yàn)蔽挠，以更詳細(xì)地闡明機(jī)制僧鲁。

為了考慮微重力下的生理變化，對(duì)青鳉魚(yú)的異常行為進(jìn)行了拍攝象泵。從視頻中可以看出，這種魚(yú)通過(guò)倒立斟叼、垂直偶惠、繞圈等獨(dú)特的行為習(xí)慣了微重力下的生活。此外朗涩，我們發(fā)現(xiàn)青鳉魚(yú)在微重力環(huán)境下33天的交配行為與在地球上沒(méi)有什么不同忽孽，表明青鳉魚(yú)已經(jīng)適應(yīng)了微重力環(huán)境。我們?cè)诘?7天發(fā)現(xiàn)了靜止的行為谢床，這是微重力下適應(yīng)的一種有趣的表型兄一。事實(shí)上，太空飛行給動(dòng)物造成了慢性應(yīng)激识腿，損害了生理功能出革，它減少了機(jī)械使用，導(dǎo)致動(dòng)力減退和運(yùn)動(dòng)減退渡讼。這種效應(yīng)表明骂束，在微重力環(huán)境下存在一些導(dǎo)致骨質(zhì)流失的主要因素耳璧，其情況類(lèi)似于地面上的廢用性骨質(zhì)疏松癥。

綜上所述展箱，我們的結(jié)果表明旨枯，在微重力條件下，破骨細(xì)胞的生理功能受損混驰，機(jī)械使用減少攀隔，以及在微重力條件下的應(yīng)力作用下，破骨細(xì)胞的活化栖榨。我們目前的研究結(jié)果提供了更好的理解骨對(duì)失重的反應(yīng)昆汹，并揭示了微重力下調(diào)節(jié)骨生理的潛在機(jī)制。

原文地址：https://www.nature.com/articles/srep14172#MOESM1