影響因子：4.7

摘要

采用磁場輔助三相分配-凝膠滲透色譜法從金針菇子實體中分離純化了一種新型雜多糖FVPT1婚惫。利用單糖組成氛赐、甲基化分析、紅外光譜和核磁共振(NMR)對其結構進行了表征先舷。FVPT1 (~1.64 × 10⁴ Da)由L-聚焦物艰管、D-半乳糖、D-葡萄糖和D-甘露糖組成蒋川，摩爾比為1.0:3.5:1.0:1.4牲芋。通過甲基化分析和核磁共振譜分析確定了FVPT1的多糖重復單元。此外，斑馬魚幼魚高脂血癥模型試驗表明缸浦，F(xiàn)VPT1具有明顯的降脂作用夕冲。此外，F(xiàn)VPT1通過增加巨噬細胞中一氧化氮裂逐、白細胞介素(IL)-1β和IL-1的分泌歹鱼，表現(xiàn)出顯著的免疫調節(jié)活性。因此卜高，這些結果表明FVPT1具有開發(fā)成為一種新的免疫或降血脂保健產品的潛力弥姻。

金針菇(Flammulina velutipes)，在食用菌的產量和消費量方面位居世界第四掺涛。金針菇富含碳水化合物庭敦、蛋白質和維生素，因此受到亞洲消費者的歡迎薪缆，尤其是中國和日本螺捐。從金針菇中分離得到的多糖、糖蛋白矮燎、酚類和倍半萜具有多種藥理活性定血，如抗腫瘤、抗炎诞外、抗氧化澜沟、降血脂、調節(jié)免疫等促進健康的作用峡谊。金針菇多糖作為金針菇最重要的活性成分之一茫虽，已被研究多年。不同方法提取的金針菇多糖具有顯著的治療效果和未被發(fā)現(xiàn)的毒性既们，引起了廣泛的關注濒析。許多研究表明，不同的提取方法會影響提取的產量啥纸、結構特征和生物活性号杏。如Guo et al.所述，微波輔助提取多糖比熱水和超聲輔助提取具有更明顯的抗氧化活性斯棒。另一項研究表明盾致，微波提取冬蟲夏草菌絲體多糖的產率和抗腫瘤活性最高，大分子多糖比例也最大荣暮。目前庭惜，金針菇多糖的提取方法有多種，主要包括熱水微波輔助提取法穗酥、超聲輔助提取法和酶輔助提取法护赊，已被廣泛應用于研究中惠遏。例如，Zhang et al.研究發(fā)現(xiàn)骏啰，金針菇多糖在45℃爽哎、620 W、20 min條件下的最大提取率達到8.33%器一。傳統(tǒng)的提取方法雖然相對簡單课锌，但其處理耗時、分離純化步驟復雜等缺點也不容忽視祈秕。三相分配法(TPP)作為一種新型的多糖提取方法渺贤，因其高效、半純化的特點而得到越來越廣泛的應用请毛。

三相分配技術(TPP)是一種新型的志鞍、安全的、綠色的分離純化蛋白質和油脂的方法方仿，它包括用正丁醇和硫酸銨溶液依次鹽析固棚、等電點沉淀和溶劑沉淀，得到界面沉淀的上部有機相仙蚜、中間蛋白相和下層水相此洲。目前，TPP作為一種更高效委粉、快速的提取技術呜师，也被廣泛應用于提取河蜆多糖、從海洋芽孢桿菌SJ3株分離的木聚糖酶和蘆薈的多糖]贾节。此外汁汗，被稱為“綠色分離技術”的磁場增強萃取方法利用其磁場增強化學分離過程。它可以利用磁場產生的特殊能量栗涂，通過改變抗磁性物質的微觀結構來改變其性質知牌。在Palyska發(fā)表的一篇關于磁場輔助溶劑萃取的研究論文中，使用D-2EHPA (di-2-乙基己基磷酸)萃取Cu²⁺斤程，萃取劑磁化后銅的分配比提高了160倍角寸。另一篇文章發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)的提取方法相比暖释，在50Hz的頻率下袭厂，可變磁場輔助提取技術可以從干紅茶和綠茶中提取更多的礦物質成分墨吓、咖啡因和多酚球匕。因此，本研究采用磁場輔助三相分配法分離金針菇多糖帖烘，以期獲得更高產量和純度的新型金針菇多糖亮曹。

本研究利用磁場輔助TPP和凝膠滲透層析法提取金針菇多糖FVPTI，并通過單糖組成和甲基化分析以及NMR分析了其結構。此外照卦，還對FVPT1的降脂和免疫活性進行了討論式矫。本研究將為該多糖的大規(guī)模工業(yè)化生產以及用于醫(yī)藥、食品等行業(yè)的活性多糖材料提供理論依據役耕。

新鮮金針菇子實體采自江蘇中綠生物科技有限公司(宿遷)采转。標準單糖購自Sigma-Aldrich化學公司(St. Louis, MO, USA)。使用斑馬魚幼魚AB株(南京YSY生物技術有限公司(中國南京))瞬痘、蛋黃粉(山東西唐公司(中國濟南))和細胞因子ELISA試劑盒(Becton, Dickinson and Company (New York, NY, USA))故慈。

將金針菇子實體洗滌、干燥框全、粉碎察绷，100目過篩。將金針菇粉末懸浮于500 mL 95%乙醇中津辩，用SB25-12D超聲儀(寧波科倫茨生物技術有限公司拆撼，中國寧波)以40 kHz頻率提取3次，熱水提取3次喘沿，每次提取2 h闸度。室溫下在水提液中加入一定量的固體硫酸銨(質量分數(shù)10-60%)和叔丁醇(5-30 mL)。將提取管置于磁場下蚜印，以100 rpm的轉速攪拌30 min筋岛，然后以2500 rpm的轉速攪拌5 min，形成三個清晰的相晒哄。對較低的水相進行透析睁宰、濃縮、干燥寝凌，得到純化的提取金針菇多糖(圖1)柒傻。

使用凝膠滲透色譜(GPC)(高分辨率Sephacryl S-300柱)(XK16 × 100 cm) (GE Healthcare (Cardiff, UK))進行進一步純化，并且使用過濾的蒸餾水作為洗脫劑较木。使用折射率檢測器(RID-10A, Shimadzu Corporation (Kyoto, Japan))檢測到兩個峰红符，收集第一個峰并將其命名為FVPT1。

使用2 M TFA(三氟乙酸)在110℃下完全水解樣品(2 mg) 4 h伐债。配備CarboPac Dionex LC30?PA20色譜柱(3 mm × 150 mm) (Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA, USA))的高效陰離子交換層析(HPAEC)预侯，用2 mm NaOH和0.05-0.2 M NaAc (0.45 mL/min)洗脫，以單糖為標準峰锁，用脈沖安培檢測器(Dionex)檢測糖的組成萎馅。

采用配備折射率檢測器(RI)的高效液相排阻色譜(HPSEC)和TSK PWXL 6000和3000凝膠過濾柱分析樣品的純度和相對分子質量，用PB緩沖液以0.5 mL/min洗脫;并在35℃下使用P5 (6200 Da)虹蒋、P10 (10,000 Da)糜芳、P20 (21,700 Da)飒货、P100 (113,000 Da)和P200 (200,000 Da)的普魯蘭標準進行校準。

將FVPT1與KBr粉末研磨峭竣，均勻混合后制成KBr片塘辅，用于在Perkin-Elmer 599B FTIR分光光度計(Waltham, MA, USA)中，在4000-400 cm^-1的波數(shù)區(qū)域皆撩，以4 cm^-1分辨率進行轉換紅外光譜分析扣墩，為32個樣本掃描。

FVPT1 (2 mg)的甲基化分析根據之前的研究進行扛吞。然后沮榜，通過水解、氘化硼鈉還原和乙跤鞔猓化蟆融，將甲基化多糖轉化為部分甲基化的乙酸醛糖醇(PMAAs)。采用DB-5 MS色譜柱(30 m × 0.25 mm, 0.25μm, 0.2 mm膜厚)的GC-MS (Thermo Finnigan TRACE 2000/MS) (Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA, USA))進行糖苷連鎖分析守呜。以20℃/min將溫度設定為180℃到270℃并且在270℃下保持25 min型酥。利用2011年NIST GC-MS數(shù)據庫中PMAA的質譜和相對保留時間對PMAA和碎片化模式進行鑒定。甲基化糖的百分比估計為峰面積的比值查乒。

將FVPT1用D₂O溶解弥喉，在真空冷凍干燥器中凍干，以促進氘交換玛迄。將氘交換的FVPT1 (40 mg)溶解于0.5 mL 99.96% D2O中用于NMR由境。在27℃在Bruker Avance III 600 MHz NMR譜儀(Bruker Corporation (Billerica, MA, USA))上記錄¹H，¹³C蓖议，核奧氏效應光譜(NOESY)虏杰，異核多量子相干(HMQC)和1H檢測的異核多鍵相關(HMBC) NMR譜。以殘余HDO為參照勒虾，δ 4.78 ppm(27℃)為內標纺阔。在外部校準的DSS (δ 0.00 ppm)中測定13C化學位移。采用1h-1h相關光譜(COSY)和HMQC對信號進行賦值修然。HMBC和NOESY用于分配殘基間的鏈接和序列笛钝。

取對數(shù)生長期的RAW264.7小鼠巨噬細胞，用無色培養(yǎng)基DMEM稀釋成2 × 105個/孔，每孔細胞數(shù)盡量相近。在培養(yǎng)箱中放置4 h后煞肾，向細胞中加入樣品，顯微鏡下觀察細胞的黏附情況囤捻，并丟棄上清液。將5 mg/mL金針菇多糖溶液用RPMI-1640稀釋至100雄妥、200最蕾、500 μg/mL依溯。然后老厌，將96孔板加入每孔200 μL瘟则。陰性對照和陽性對照培養(yǎng)基分別含5% pbs和10 μg/mL lps，每組設6個重復枝秤。在5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)環(huán)境下孵育48 h后醋拧，取100 μL上清液，采用Griess實驗檢測NO水平淀弹，如前所述丹壕。

ELISA試劑盒檢測巨噬細胞釋放的IL-1和IL-1β。將巨噬細胞懸液稀釋至2×106個/mL薇溃，用每孔濃度為200 μg/mL的FVPT1溶液培養(yǎng)于96孔板中菌赖。以含0.5% PBS和10 μg/mL LPS的RPMI-1640培養(yǎng)基分別作為陰性對照組和陽性對照組，設置3個重復沐序。分別于37℃琉用、5% CO2條件下培養(yǎng)4、8策幼、10 d邑时，參照試劑盒說明書操作步驟，采用ELISA法測定上清液中IL-1和IL-1β的含量特姐。

FVPT1的降脂活性

AB株斑馬魚胚胎取自南京YSY生物技術有限公司(中國南京)晶丘，在含氧的清潔魚水中28℃孵育48 h。以卵黃粉作為高膽固醇飼料(HCD)連續(xù)6 d喂養(yǎng)斑馬魚幼魚唐含，建立高脂血癥模型浅浮。將斑馬魚幼魚按每組10條斑馬魚的密度分為對照組、高膽固醇組和樣本組(FVPT1濃度分別為100捷枯、200和400 μg/mL)脑题，置于每孔含2 mL魚水的12孔板中處理。高膽固醇組使用蛋黃粉作為斑馬魚幼魚的HCD飼料铜靶，終濃度為0.1%叔遂，而對照組不喂養(yǎng)。從高膽固醇蛋黃飼料喂養(yǎng)斑馬魚幼魚12 h開始争剿，斑馬魚幼魚體內的脂質開始迅速積累已艰。蛋黃粉浸泡斑馬魚幼魚48 h可誘導幼魚體內大量脂質蓄積，建立高脂血癥模型蚕苇。高膽固醇多糖組在魚水中加入多糖和蛋黃粉哩掺，浸泡斑馬魚幼魚48 h，采用油紅染色觀察幼魚體內脂質蓄積情況涩笤。

根據說明書配置油紅o染料溶液并且用定性濾紙緩慢過濾嚼吞。將斑馬魚幼魚用4%的聚甲醛固定1 h盒件，用PBS洗滌2 ~ 3次，然后用25%舱禽、50%炒刁、75%、100%梯度的甲醇溶劑脫水誊稚。油紅o染色2 h后翔始，分別用100%、75%里伯、50%城瞎、25%梯度甲醇溶劑梯度洗脫，PBS洗滌疾瓮。最后用熒光顯微鏡觀察并拍照脖镀。

經油紅o染色后，在斑馬魚幼魚的血管和胃中可以清晰地觀察到脂質沉積狼电。采用Image-Pro Plus (IPP) 6.0分析軟件測定斑馬魚體內染色脂質的積分光密度(IOD)值蜒灰，定量評估體內脂質蓄積水平，進而分析多糖樣品對幼魚脂質蓄積的抑制活性漫萄。體內脂質標準化蓄積程度(%)=(碘多糖組?碘控制組)/(碘高脂血癥組?碘控制組)卷员。

所有實驗均重復3次，數(shù)據以均數(shù)±標準差(SDs)表示腾务。組間比較采用單因素方差分析和LSD檢驗毕骡。對所有變量進行Levene′s正態(tài)性檢驗和齊次方差分析。必要時進行Tamhane 's T2檢驗岩瘦。P < 0.05和P < 0.01分別為顯著和非常顯著未巫。

結果

磁場輔助三相分配法獲得金針菇多糖的得率、多糖含量和蛋白質含量分別為2.3%启昧、55.53%和12.19%叙凡。凝膠滲透層析純化后獲得的FVPT1多糖含量達90.1%，水分含量為2.91%密末。

FVPT1的總多糖含量為90.1%握爷，總蛋白含量為5.20%。在HPSEC圖譜中严里，一個對稱的單峰(圖2a)表明FVPT1是一種均質多糖新啼，約1.64 × 104 Da，半乳糖(Gal)刹碾，甘露糖(Man)燥撞，焦點(Fuc)和葡萄糖(Glc)的摩爾比為3.5:1.4:1:1。在之前的研究中，利用傳統(tǒng)的提取物舒、分離和純化方法從金針菇中獲得了FVPA1色洞、FVPA2和FVPB2。3種多糖的分子量不同冠胯，且不含蛋白質火诸。FVPA2的單糖成分中不含葡萄糖。

圖2b顯示FVPT1在3416割粮、1651和1453 cm^-1處有三個主要吸收峰。3416 cm ^-1峰表明多糖的羥基伸縮振動媚污。1615 cm^-1處的強吸收峰和1453 cm^-1處的弱吸收峰說明了多糖的特性舀瓢。由于1730 cm^-1處無峰，因此不存在糖醛酸耗美。

在表1和圖2c京髓、d中，GC-MS數(shù)據表明FVPT1末端具有支鏈結構商架，包括甘露吡喃糖殘基和葡萄糖吡喃糖殘基堰怨，包含1,2-二取代焦點、1,4,6-三取代半乳糖蛇摸、1,3,6-三取代半乳糖备图、1,2-二取代焦點、1,4-二取代半乳糖和1,3-二取代葡萄糖的主鏈結構赶袄，還有在另一個終端的焦點殘留揽涮。

由圖3可知，F(xiàn)VPT1的多糖結構包括6個糖殘基饿肺，分別位于δ 5.26(單峰)蒋困、δ 5.12(單峰)、δ 5.07(單峰)敬辣、δ 5.03(單峰)雪标、5.01(單峰)和δ 4.55(雙峰，J_{H-1溉跃，H-2} = 6 Hz)村刨，分別對應于δ 101.55、105.29喊积、100.73烹困、100.81、104.20和105.87處的信號乾吻，命名為A-F髓梅。在1.24 (J_{H-5拟蜻，H-6}= 6.42 Hz)處出現(xiàn)Fuc ¹H信號的CH₃-C基團，對應于Fuc δ 18.81處C-6的信號枯饿。

根據FVPT1結構中6個糖殘基的化學位移和異位構型酝锅，通過核磁共振來確定單糖殘基A-F的歸屬。

表2顯示了三種具有半乳糖構型的糖殘基的自旋系統(tǒng)奢方，A, B和D搔扁，使用H-1/H-2到H-4和H-6/H-5, H-4相關性在¹H-¹H COSY和TOCSY光譜中發(fā)現(xiàn)。C-4的前場位移(δ 79.33)表明A為1,4-α-D-Galp蟋字。C-4 (δ 84.70)和C-6 (δ 67.48)表明殘基B為1,4,6-α-D-Galp稿蹲。C-3 (δ 78.49)和C-6 (δ 69.32)表明殘基D為(1,3,6)-α-D-Galp。

殘基C在1.24 (1H NMR)和δ 18.81 (1C NMR)處有特殊信號鹊奖，表明其J_{H-1苛聘，H-2}值和GC-MS數(shù)據均較小，且與δ 5.07具有α-焦點殘基醚忠聚。C-2 (δ 87.43)碳信號與標準值比較设哗，表明殘基C為1,2 -α-L-Fucp。

經J_{H-1两蟀，H-2}和J_{H-2网梢，H-3}的小值，J_{H-4赂毯，H-5}的大值和J_{H-1战虏，H-2}的小值鑒定，殘留物E為D-甘露糖基欢瞪。J_{C-1, H-1}= 170 Hz表明HMBC中存在α-甘露糖構型活烙。除C-1 (δ 104.20)外，在δ 76-88范圍內沒有明顯的碳信號遣鼓，表明E為末端α-D-甘露吡喃糖啸盏。

δ 4.55處出現(xiàn)異位信號，J_{H-1骑祟，H-2}值較大回懦，表明F為β連接殘基。從COSY和HMQC光譜確定了H-2到H-6的質子化學位移次企。J_{H-2怯晕，H-3}和J_H-3，H-4 (9 Hz)的較大值以及NOESY光譜中典型的H-1缸棵、H-2和H-4內相關關系表明殘留物F為D-葡萄糖吡喃糖[8]舟茶。C-3 (δ 81.66)碳表明F為1,3 -link β-D Glcp。

從NOESY研究中確定了糖基殘基的序列，然后用HMBC實驗進行了確認(表3和表4)吧凉。根據上述數(shù)據隧出，多糖FVPT1有以下重復單元(圖4):

NO作為免疫系統(tǒng)中關鍵的信號分子和重要的轉導因子，由于其與RNI代謝物性質相對穩(wěn)定阀捅，可以在樣本RNI水平中評估其含量胀瞪。如圖5所示，與陰性對照組相比饲鄙，在50~500 μg/mL的濃度下凄诞，F(xiàn)VPT1可以劑量依賴性地刺激NO水平。此外忍级，500 μg/mL FVPT1具有明顯的NO生成激活能力帆谍。 

活化的巨噬細胞不僅能產生炎癥介質，還能分泌IL-1颤练、IL-1β等細胞因子既忆，調節(jié)局部微環(huán)境驱负，抵抗不利因素的侵襲嗦玖。ELISA試劑盒檢測FVPT1促進巨噬細胞產生上述4種細胞因子的效果，結果顯示FVPT1共培養(yǎng)可刺激巨噬細胞分泌IL-1β和IL-1細胞因子跃脊。500 μg/mL的FVPT1可以顯著促進IL-1β和IL-1細胞因子的水平(圖6)宇挫。結果顯示，F(xiàn)VPT1可以激活巨噬細胞并大量分泌IL-1和IL-1β細胞因子酪术。在之前的研究中器瘪，利用傳統(tǒng)的提取、分離和純化方法從金針菇中獲得了FVPA1绘雁、FVPA2和FVPB2橡疼。與FVPT1的體外免疫效應相似，F(xiàn)VPA1可刺激Raw264.7巨噬細胞分泌NO庐舟。然而欣除，F(xiàn)VPA2和FVPB2在體外作用于B細胞或NK細胞，而不是巨噬細胞挪略。 

近年來历帚，斑馬魚常被用作闡明藥理作用機制的模型。既往研究表明杠娱，從雙孢蘑菇和刺芹菇中分離的多糖在斑馬魚模型中具有顯著的降血脂活性挽牢。顯然，F(xiàn)VPT1在我們的高脂血癥模型中降低了斑馬魚幼魚的脂質含量摊求。100禽拔、200、400 μg/mL FVPT1將斑馬魚的脂質含量分別降低到53.89%、73.76%睹栖、83.89%寥闪，而以蛋黃粉作為高膽固醇飼料喂養(yǎng)的模型組的脂質含量為100%(圖7)。體內實驗結果表明磨淌，F(xiàn)VPT1對脂質積累具有良好的抑制作用疲憋。