摘要

二甲雙胍不僅在糖尿病治療中具有良好的作用焚虱，而且由于其抗氧化能力，它作為一種治療炎癥相關(guān)疾病的有前景的藥物而受到關(guān)注懂版。然而鹃栽，這種效應(yīng)的機(jī)制基礎(chǔ)仍然難以捉摸。利用斑馬魚體內(nèi)炎癥模型定续，我們探索了二甲雙胍對中性粒細(xì)胞募集的影響及其潛在機(jī)制谍咆。我們的數(shù)據(jù)表明，二甲雙胍降低組蛋白(H3K18)乳酸化私股，導(dǎo)致活性氧(ROS)的產(chǎn)生減少摹察，中性粒細(xì)胞對尾鰭損傷和耳囊泡炎癥的反應(yīng)減弱。為了研究二甲雙胍通過ROS和H3K18乳酸化調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞遷移的確切機(jī)制倡鲸，我們精心建立了二甲雙胍誘導(dǎo)的H3K18乳酸化抑制與ROS水平之間的相關(guān)性供嚎。通過乳酸和ROS恢復(fù)的補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)，我們的研究結(jié)果表明，乳酸和ROS水平的升高顯著促進(jìn)了斑馬魚的炎癥反應(yīng)克滴”普總的來說，我們的研究闡明了二甲雙胍通過下調(diào)H3K18乳酸化和ROS產(chǎn)生的抗氧化和抗炎作用的先前未被探索的途徑劝赔，強(qiáng)調(diào)了表觀遺傳調(diào)節(jié)在炎癥中的關(guān)鍵作用誓焦，并指出二甲雙胍在治療炎癥相關(guān)疾病方面的潛力。

炎癥是免疫系統(tǒng)對損傷或致病性威脅的先天反應(yīng)着帽，目的是防止疾病擴(kuò)散杂伟，促進(jìn)組織修復(fù)。中性粒細(xì)胞是免疫反應(yīng)的前線衛(wèi)士仍翰，在消除外部威脅方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用赫粥。它們不僅吞噬壞死細(xì)胞，抑制免疫細(xì)胞的進(jìn)一步募集予借，還分泌介質(zhì)刺激生長和血管生成越平，同時產(chǎn)生裂解酶和保護(hù)酶，加速組織修復(fù)灵迫。深入了解中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥的調(diào)節(jié)機(jī)制可以為以中性粒細(xì)胞異城嘏眩活化為特征的疾病提供新的治療途徑。

二甲雙胍(Metformin, Met)是一種著名的口服降糖藥龟再，它不僅能降低胰島素抵抗和肝臟葡萄糖的產(chǎn)生书闸，還能調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。它抑制巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生并抑制NF-κB信號通路利凑。此外浆劲，二甲雙胍促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增殖，這對于調(diào)節(jié)過度活躍的免疫反應(yīng)至關(guān)重要哀澈。盡管有這些已知的作用牌借，二甲雙胍對中性粒細(xì)胞炎癥行為的具體影響尚未得到充分探討。由于斑馬魚在胚胎和幼魚階段表現(xiàn)出的光學(xué)透明性割按，它們是研究先天免疫的理想模型膨报。我們的目標(biāo)是利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型Tg (lyz: EGFP）來利用斑馬魚幼魚的這一優(yōu)勢 。該模型使我們能夠研究二甲雙胍是否影響中性粒細(xì)胞向生物體炎癥部位的募集适荣。

二甲雙胍調(diào)節(jié)活性氧(ROS)的能力已經(jīng)確立;它通過抑制線粒體復(fù)合體I和活化amp活化的蛋白激酶(AMPK)來抑制ROS的產(chǎn)生现柠，同時增強(qiáng)抗氧化防御。據(jù)報(bào)道弛矛，過量的ROS會誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞在炎癥部位異常聚集够吩，從而加劇炎癥過程。為了進(jìn)一步研究二甲雙胍丈氓、炎癥和ROS之間的關(guān)系周循，我們計(jì)劃使用炎癥誘導(dǎo)的斑馬魚模型進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)强法。通過監(jiān)測二甲雙胍治療后ROS水平的動態(tài)變化，我們旨在闡明二甲雙胍調(diào)節(jié)ROS的具體機(jī)制湾笛。本研究對二甲雙胍在中性粒細(xì)胞遷移和炎癥過程中的作用提供了更全面的了解饮怯。這些見解將有助于揭示二甲雙胍的精確免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，有助于闡明相關(guān)炎癥性疾病的治療嚎研。

二甲雙胍作為治療糖尿病的一線藥物蓖墅，可能通過其血糖控制機(jī)制影響機(jī)體糖酵解代謝及糖酵解相關(guān)基因。乳酸在糖酵解過程中起著至關(guān)重要的作用嘉赎，作為代謝副產(chǎn)物顯著調(diào)節(jié)組蛋白乳酸化水平置媳。組蛋白乳酸化是最近發(fā)現(xiàn)的一種與多種生物過程相關(guān)的翻譯修飾，包括腫瘤發(fā)生公条、神經(jīng)發(fā)育和炎癥。我們研究了二甲雙胍是否影響組蛋白乳酸化迂曲，從而調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞遷移并影響體內(nèi)的炎癥和免疫反應(yīng)靶橱。總之路捧，我們的研究采用斑馬魚成像來探索二甲雙胍如何影響中性粒細(xì)胞募集关霸。我們首次揭示了組蛋白乳酸化在調(diào)節(jié)ROS產(chǎn)生中的作用，從而影響二甲雙胍對中性粒細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)作用杰扫。我們的發(fā)現(xiàn)引入了一種新的ROS調(diào)控機(jī)制队寇，豐富了目前對ROS生物學(xué)領(lǐng)域的理解，并擴(kuò)展了我們對二甲雙胍如何調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的見解章姓。

成年野生型(WT/AB)和轉(zhuǎn)基因Tg(lyz: EGFP)品系在28.5°C的自動循環(huán)水系統(tǒng)中培養(yǎng)佳遣，光照周期為14 h，暗循環(huán)為10 h凡伊。系統(tǒng)自動監(jiān)測和調(diào)節(jié)水的pH值和鹽離子濃度零渐，使其保持在pH 7.0-7.5，鹽離子濃度約為500 - 550mg /mL系忙。野生型(WT)和轉(zhuǎn)基因Tg( lyz: EGFP)品系自然交配獲得胚胎诵盼。將斑馬魚胚胎置于Hank’s溶液中，溫度28.5℃银还，pH 6.5-7.5风宁，培養(yǎng)3-5天。N-phenylthiourea (PTU;Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)用于防止幼魚形成色素蛹疯。我們嚴(yán)格遵循安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物資源中心SYXK(安徽)2016-007的指導(dǎo)方針和規(guī)定戒财。

二甲雙胍(Met) (Aladdin, Shanghai, China)在ddH₂O中溶解，制備原液(10mM)苍苞。為了評估Met對斑馬魚發(fā)育的毒性固翰，使用不同濃度的二甲雙胍(0μM, 50μM, 100μM, 400μM和800μM)進(jìn)行連續(xù)浸泡處理狼纬。通過對斑馬魚的孵化率、體長和流動性進(jìn)行毒性評價(jià)后骂际，選擇50μM的Met進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)疗琉，10μM的濃度處理細(xì)胞8h。通過顯微注射將LPS (0.15mg/mL, 50nL) (Sigma, L2630)注射到斑馬魚的耳囊中歉铝，建立全身性炎癥模型盈简。LPS (2.5μg/mL)作用2h誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥。5dpf(受精d)時太示，用乳酸(50mM) (Macklin柠贤，中國)處理10h，并用乳酸(25mM)處理6h类缤，以提高細(xì)胞的乳酸化水平臼勉。H₂O₂用(200μM)在5 dpf下處理斑馬魚2h，以增加體內(nèi)活性氧水平餐弱，同時用25mM濃度處理細(xì)胞0.5h宴霸。

使用Viewpoint儀器(Viewpoint, Lyon, France)的Photomotor Response (PMR)模型對斑馬魚幼體(5dpf)的短期運(yùn)動行為進(jìn)行了評估。簡單地說膏蚓，將斑馬魚幼魚置于48孔板中進(jìn)行測試瓢谢，每組10只幼魚。實(shí)驗(yàn)流程為:30min黑暗驮瞧，5min光照氓扛，5min黑暗，三個周期论笔。儀器置于恒溫28.5℃的培養(yǎng)箱中采郎。采用自動視頻跟蹤系統(tǒng)(ViewPoint, Lyon, France)監(jiān)測幼魚運(yùn)動30 min，并用Zebralab 3.11軟件(ViewPoint, Lyon, France)記錄幼魚運(yùn)動情況翅楼。

體視顯微鏡下觀察30hpf時的搖尾率(時間/1 min)尉剩、48hpf和72hpf時的心率(時間/20s)、96hpf時的體長(cm)和96hpf時的存活率毅臊。每次實(shí)驗(yàn)大約使用30只斑馬魚理茎。

用0.1 g/mL MS-222溶液(Sigma, E10521)麻醉Tg(lyz:EGFP)幼魚(5 dpf)呜舒。在體視顯微鏡下用葉片對尾鰭進(jìn)行手術(shù)損傷。傷后3h笨奠，用熒光顯微鏡觀察尾鰭中性粒細(xì)胞的遷移情況阴绢，用ImageJ軟件(1.6.0版)分析中性粒細(xì)胞數(shù)量。每組共20尾斑馬魚艰躺。

斑馬魚Tg( lyz: EGFP)品系用0.1g/mL MS-222溶液(Sigma, E10521)麻醉，并在斑馬魚幼魚耳囊內(nèi)注射約50nL LPS (0.2 μg/L, Sigma)眨八。注射LPS 3h后腺兴，用熒光顯微鏡觀察中性粒細(xì)胞向耳小泡募集情況，用ImageJ軟件(1.6.0版)分析中性粒細(xì)胞數(shù)量廉侧。每個實(shí)驗(yàn)組共選用斑馬魚幼魚20只页响。

DCFH-DA (Beyotime, China)用于檢測細(xì)胞和斑馬魚中ROS的產(chǎn)生。檢測細(xì)胞時段誊，先將NIH/3T3細(xì)胞接種于12孔板闰蚕，接種密度為2.5 × 10⁴個/孔。藥物處理后连舍，細(xì)胞與約500 μL DCFH-DA (10μM)在37℃下孵育30 min没陡。孵育后，用1倍PBS洗滌細(xì)胞2次索赏，去除未穿透的DCFH-DA盼玄。然后使用多功能微孔板讀卡器(VICTOR Nivo, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)在FITC檢測模式(488/525nm)下測量熒光，使用熒光顯微鏡(Carl Zeiss, Jena潜腻，德國)捕獲圖像埃儿。將斑馬魚幼魚與DCFH-DA (10μM)在28℃下孵育25 min，然后用PBS洗滌2次以去除未穿透的DCFH-DA融涣。最后在熒光顯微鏡下采集圖像童番，使用ImageJ軟件(1.6.0版本)對幼魚的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析精钮。

使用乳酸測定試劑盒(Abbkine，中國武漢)測定斑馬魚幼魚和細(xì)胞的乳酸含量剃斧。簡而言之轨香，經(jīng)藥物處理后，共采集幼魚30只悯衬，收集到約5 × 10⁶個細(xì)胞弹沽。將樣品加入萃取液中，混合均勻筋粗，在12,000× g下離心10 min策橘。將上清液置于565nm的分光光度計(jì)中測量吸光度。

小鼠巨噬細(xì)胞系(RAW264.7)購自Pricella(中國武漢)娜亿。RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于α-MEM(Hyclone, Logan, UT, USA)添加10%胎牛血清(FBS;康源生物丽已，天津，中國)买决，然后放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱(5% CO₂沛婴，37℃)。所有實(shí)驗(yàn)均采用3-7代細(xì)胞進(jìn)行督赤。

分析不同藥物治療后各組蛋白泌乳水平嘁灯。藥物處理后，收集各組斑馬魚幼魚和細(xì)胞躲舌，離心丑婿，在RIPA緩沖液(Servicebio, Wuhan, China)中裂解，進(jìn)行Western blotting没卸。將收集的樣品煮沸5分鐘羹奉，在12.5% SDS-PAGE凝膠上電泳。用5%牛奶阻斷硝化纖維素膜约计，用抗H3K18la (1:1000, PTM-1406, PTMBIO)诀拭、組蛋白H3 (1:1000, PTM-7093, PTMBIO)或pan-Kla (1:1000, PTM-1401, PTMBIO)抗體孵育過夜。清洗后煤蚌，切片用酶標(biāo)二抗(Sangon, Shanghai, China)室溫孵育2小時耕挨，并用化學(xué)發(fā)光溶液成像。

結(jié)果

為了確定二甲雙胍治療斑馬魚幼魚的最佳濃度盛卡，我們將24hpf斑馬魚幼魚浸泡在含有不同濃度二甲雙胍的溶液中。通過連續(xù)監(jiān)測96hpf以上斑馬魚的存活率筑凫、心率滑沧、甩尾、體長和活動巍实，我們評估了二甲雙胍對斑馬魚幼魚生長發(fā)育的影響滓技。與對照組相比，50μM Met對斑馬魚幼魚的存活率(96hpf)棚潦、甩尾頻率(30hpf)令漂、心率(24hpf、48hpf丸边、72hpf)和體長(96hpf)均無顯著影響(圖1b-h)叠必。在體內(nèi)顯微鏡下，二甲雙胍處理后妹窖，幼魚的整體形態(tài)與對照組沒有顯著差異(圖1g)纬朝。此外，我們還利用行為探測器對斑馬魚幼魚進(jìn)行了PMR實(shí)驗(yàn)骄呼。與對照組相比玄组，在光照和黑暗條件下，50μM Met對斑馬魚幼魚的活性沒有顯著影響(圖1i–l)谒麦。綜上所述，50 μM Met對斑馬魚幼體的基本生理功能和生長發(fā)育無顯著影響哆致。

隨后，使用轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（lyz: EGFP)用熒光中性粒細(xì)胞標(biāo)記摊阀，建立兩種急性炎癥模型:尾鰭損傷和耳囊注射耻蛇。我們通過體內(nèi)成像評估二甲雙胍治療是否會影響中性粒細(xì)胞向炎癥部位的遷移。結(jié)果顯示胞此，在尾鰭損傷模型中臣咖，二甲雙胍處理可顯著抑制中性粒細(xì)胞向損傷部位的遷移( 圖2a、b)漱牵。這在耳泡模型中也得到了類似的驗(yàn)證( 圖2c, d)夺蛇。促炎細(xì)胞因子是機(jī)體免疫細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中分泌的一組蛋白質(zhì)。Tnf-α酣胀， il-1β刁赦， il-6和 cxcl8a都在這些因素之中娶聘。它們在免疫反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，通常用于評估體內(nèi)的炎癥水平甚脉。每只幼魚微注射LPS后丸升，用50μM二甲雙胍處理3h，提取RNA檢測細(xì)胞因子表達(dá)牺氨。結(jié)果顯示狡耻，與對照組相比，LPS處理組促炎細(xì)胞因子的表達(dá)顯著升高( 圖2e猴凹、h)夷狰。但與LPS組相比，二甲雙胍預(yù)處理組的表達(dá)明顯降低精堕。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中孵淘，我們也檢測了基因的表達(dá) Tnf-α， il-1β歹篓， il-6和 cxcl8a ( 圖2i,l)瘫证。與先前的研究結(jié)果一致，二甲雙胍降低了促炎細(xì)胞因子的水平庄撮，表明其對細(xì)胞內(nèi)免疫的影響背捌。

總之，我們證明了二甲雙胍通過下調(diào)中性粒細(xì)胞遷移和降低促炎細(xì)胞因子水平來減輕炎癥反應(yīng)洞斯。

研究表明毡庆，二甲雙胍的抗炎作用可能與其阻斷線粒體DNA合成和激活A(yù)MPK信號通路有關(guān)。我們假設(shè)二甲雙胍可能會降低體內(nèi)活性氧(ROS)的水平烙如。在這項(xiàng)研究中么抗，我們通過斑馬魚實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞分析探討了二甲雙胍對ROS水平的影響。首先亚铁，在斑馬魚實(shí)驗(yàn)中蝇刀，我們將斑馬魚暴露在過氧化氫中以誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生。然后徘溢，另一組斑馬魚用二甲雙胍治療吞琐，以評估其對活性氧水平的影響。結(jié)果顯示然爆，二甲雙胍處理組站粟，ROS水平顯著降低(圖3a、b)曾雕。我們還檢測了關(guān)鍵基因的表達(dá)奴烙，如 duox， sod1發(fā)現(xiàn)二甲雙胍顯著下調(diào)了這些基因( 圖3c–f)。這些基因在調(diào)節(jié)活性氧水平中起著關(guān)鍵作用缸沃，表明二甲雙胍有效地減弱了生物體的氧化應(yīng)激反應(yīng)恰起。其次，通過細(xì)胞檢測趾牧，我們測量了二甲雙胍對ROS濃度的影響检盼，并觀察到二甲雙胍顯著降低了細(xì)胞內(nèi)ROS水平。我們研究了關(guān)鍵基因的表達(dá)譜翘单，包括 duox, sod1, cat吨枉，在ROS調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。將細(xì)胞暴露于過氧化氫后哄芜，我們給予二甲雙胍并監(jiān)測其對這些基因表達(dá)的影響貌亭。值得注意的是，二甲雙胍處理顯著抑制了 duox(一種產(chǎn)生ROS的重要酶)认臊，并下調(diào)抗氧化基因的表達(dá)圃庭，如 cat和 sod1．

這些結(jié)果進(jìn)一步支持二甲雙胍在減少ROS介導(dǎo)的細(xì)胞損傷中的保護(hù)作用。通過這兩個角度的驗(yàn)證失晴，我們得出結(jié)論:二甲雙胍可以有效降低過氧化氫誘導(dǎo)的ROS水平剧腻。這些發(fā)現(xiàn)突出了二甲雙胍作為一種潛在的治療藥物減輕氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的潛力，并值得進(jìn)一步研究其減輕氧化損傷的作用機(jī)制涂屁。

在我們之前的實(shí)驗(yàn)中书在，我們測量了斑馬魚體內(nèi)活性氧的水平以及相關(guān)基因的表達(dá)duox sod1,和 cat。研究結(jié)果表明拆又，過氧化氫處理顯著提高了斑馬魚體內(nèi)的活性氧水平儒旬，并導(dǎo)致 duox基因的表達(dá)。這一發(fā)現(xiàn)表明過氧化氫處理可能通過激活Duox復(fù)合物來增加活性氧的產(chǎn)生帖族，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)的增加栈源。

在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，我們故意增加細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平竖般，以研究它們對中性粒細(xì)胞遷移和免疫功能的潛在影響凉翻。我們采用兩種急性炎癥模型，尾鰭損傷和耳石囊損傷來評估過氧化氫處理對中性粒細(xì)胞遷移的影響捻激。令人驚訝的是，在活性氧濃度升高的條件下前计，中性粒細(xì)胞的遷移顯著增強(qiáng)( 圖4a–d)胞谭。此外，過氧化氫處理誘導(dǎo)這些促炎細(xì)胞因子的表達(dá)上調(diào)(Tnf-α男杈， iL-1β丈屹， iL-6，和 cxcl8a） ( 圖4E-h)，免疫應(yīng)答也增強(qiáng)旺垒。這一發(fā)現(xiàn)與之前活性氧水平升高和促炎因子表達(dá)上調(diào)的結(jié)果一致彩库，提示過氧化氫可能通過上調(diào)活性氧水平和促炎因子表達(dá)來影響中性粒細(xì)胞遷移。然而先蒋，當(dāng)我們引入二甲雙胍作為干預(yù)措施時骇钦，這種效果被顯著抑制。雖然活性氧水平仍然很高竞漾，但在二甲雙胍的影響下眯搭，中性粒細(xì)胞的遷移能力和免疫反應(yīng)都比未治療組明顯減弱。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中业岁，我們還評估了二甲雙胍對活性氧水平的影響鳞仙。同樣，二甲雙胍顯著降低了促炎因子( 圖4i–l)笔时。這些發(fā)現(xiàn)提示過氧化氫處理可能通過激活氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)促炎因子的表達(dá)棍好，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，而二甲雙胍可以抑制這一現(xiàn)象允耿。

在我們的研究中借笙，我們對二甲雙胍的功能進(jìn)行了深入的研究，特別是它在調(diào)節(jié)細(xì)胞乳酸生成中的作用右犹。在斑馬魚實(shí)驗(yàn)中提澎，我們徹底檢查了乳酸含量和基因表達(dá)，如hdac3念链，pkma, gapdh．

結(jié)果表明盼忌，經(jīng)二甲雙胍處理后，乳酸濃度顯著降低( 圖5a)掂墓，表明二甲雙胍對乳酸水平有調(diào)節(jié)作用谦纱。此外，我們觀察到hdac3君编、pkma和gapdh基因表達(dá)水平的變化跨嘉，二甲雙胍治療下調(diào)了它們的表達(dá)(圖5b-d)。這些基因在乳酸代謝中起著至關(guān)重要的作用吃嘿，它們的下調(diào)暗示著對乳酸代謝率的潛在影響祠乃。這些發(fā)現(xiàn)提示二甲雙胍可能通過影響這些乳酸酶相關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)乳酸代謝。在蛋白水平上兑燥，我們檢測了斑馬魚組蛋白的泌乳水平亮瓷，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍顯著下調(diào)了H3組蛋白的泌乳修飾，尤其是H3K18位點(diǎn)( 圖5e–g)降瞳。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中嘱支，我們還測量了乳酸水平和基因表達(dá)蚓胸，如 hdac3, pkma, gapdh。與斑馬魚實(shí)驗(yàn)一樣除师，二甲雙胍處理導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)乳酸濃度顯著降低沛膳，表明其對細(xì)胞乳酸代謝的影響( 圖5h)。此外汛聚， hdac3, pkma, gapdh也改變了( 圖5i–k)锹安。這些結(jié)果支持二甲雙胍通過調(diào)節(jié)乳酸酶相關(guān)基因影響細(xì)胞內(nèi)組蛋白乳酸化的觀點(diǎn)。結(jié)合斑馬魚和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果贞岭，我們得出結(jié)論八毯，二甲雙胍影響斑馬魚/免疫細(xì)胞中乳酸酶相關(guān)基因，并下調(diào)組蛋白乳酸化瞄桨。

這些發(fā)現(xiàn)為二甲雙胍調(diào)節(jié)新陳代謝的機(jī)制提供了重要的見解话速。

在我們之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對降低組蛋白乳酸化有顯著的作用芯侥〔唇唬基于這一發(fā)現(xiàn)，我們進(jìn)一步探討了乳酸對乳酸化和H3K18乳酸化的影響柱查，并考察了二甲雙胍在這一背景下的作用廓俭。Western blot結(jié)果清楚地顯示，與Con組相比唉工，乳酸組總體乳酸化水平和H3K18乳酸化水平顯著升高(圖6a-c)研乒。然而，當(dāng)乳酸和二甲雙胍聯(lián)合使用時淋硝，乳酸誘導(dǎo)的上調(diào)被有效抑制雹熬。此外，乳酸顯著提高了 pkma和 gapdh基因( 圖6d, e)谣膳。然而竿报，在同時使用乳酸和二甲雙胍的組中，這些基因的表達(dá)明顯受到抑制继谚，進(jìn)一步證明了二甲雙胍調(diào)節(jié)乳酸化修飾的能力烈菌。關(guān)于活性氧，我們注意到乳酸不僅增加了斑馬魚體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生( 圖6f,g)花履，也顯著上調(diào)氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá) duox和 sod1芽世。這些結(jié)果表明，乳酸可能通過激活氧化應(yīng)激途徑來調(diào)節(jié)活性氧的產(chǎn)生诡壁。最后济瓢，我們采用尾鰭損傷和耳石囊損傷兩種急性炎癥模型，研究乳酸處理對中性粒細(xì)胞遷移的影響欢峰。我們觀察到，在斑馬魚的乳酸處理后，無論是割尾還是耳石囊損傷實(shí)驗(yàn)中纽帖，乳酸組均表現(xiàn)出中性粒細(xì)胞的顯著增加宠漩。二甲雙胍的加入削弱了中性粒細(xì)胞的遷移，從而減少了體內(nèi)的炎癥反應(yīng)( 圖6j-q)懊直。這些發(fā)現(xiàn)與之前活性氧水平升高的研究結(jié)果一致扒吁，表明乳酸可能通過上調(diào)活性氧水平來影響中性粒細(xì)胞的遷移行為。

總的來說室囊，我們的研究結(jié)果表明雕崩，乳酸通過提高活性氧的水平來影響中性粒細(xì)胞的遷移。二甲雙胍可減輕乳酸升高引起的氧化應(yīng)激和炎癥融撞。這些發(fā)現(xiàn)為乳酸鹽在免疫調(diào)節(jié)和炎癥中的作用提供了重要的見解盼铁。盡管如此，需要進(jìn)一步的研究來闡明乳酸和活性氧之間的調(diào)節(jié)相互作用尝偎，并發(fā)掘其在治療炎癥相關(guān)疾病中的潛在應(yīng)用饶火。

總之，我們的研究強(qiáng)調(diào)過氧化氫通過上調(diào)活性氧水平來影響中性粒細(xì)胞的遷移致扯，并可能在此過程中誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)肤寝。這為深入了解氧化應(yīng)激在免疫調(diào)節(jié)和炎癥過程中的作用提供了重要線索。這些發(fā)現(xiàn)清楚地表明抖僵，雖然活性氧可以調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的遷移和免疫功能鲤看，但二甲雙胍具有潛在的調(diào)節(jié)作用，可以有效減輕活性氧過量產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)耍群。這一發(fā)現(xiàn)為二甲雙胍在細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)中的潛在應(yīng)用提供了新的見解义桂。然而，二甲雙胍與活性氧之間的調(diào)節(jié)機(jī)制世吨，以及其在炎癥相關(guān)疾病中的潛在治療價(jià)值澡刹，仍需要進(jìn)一步的研究來闡明。我們的研究為該領(lǐng)域提供了有價(jià)值的信息耘婚，為今后相關(guān)領(lǐng)域的研究奠定了基礎(chǔ)罢浇。

我們的研究提供了對二甲雙胍更細(xì)致入微的理解，二甲雙胍通常以其抗糖尿病能力而聞名沐祷，并表明其作為一種多功能治療工具的潛力嚷闭。具體來說，我們發(fā)現(xiàn)二甲雙胍通過H3K18乳酸化/ROS軸調(diào)節(jié)炎癥赖临，開辟了一條令人興奮的新研究路線胞锰。這種表觀遺傳控制機(jī)制為針對以未抑制ROS和炎癥為典型的疾病的新療法提供了有希望的途徑。

雖然二甲雙胍的抗炎和抗氧化作用已被廣泛證實(shí)兢榨，但其潛在的分子機(jī)制仍然復(fù)雜且具有挑戰(zhàn)性嗅榕。最近的研究發(fā)現(xiàn)顺饮，PEN2是二甲雙胍的直接分子靶點(diǎn)，闡明了分子相互作用介導(dǎo)的溶酶體途徑和AMPK的特異性激活凌那。這一澄清強(qiáng)調(diào)了ampk相關(guān)通路在二甲雙胍多種功能中的關(guān)鍵作用兼雄，包括葡萄糖降低、延長壽命和抗衰老作用帽蝶。此外赦肋，二甲雙胍的抗炎作用也逐漸受到重視。研究表明二甲雙胍可以顯著降低il-1β和 il-6但不抑制炎癥通路NF-κB的激活励稳。在免疫調(diào)節(jié)方面佃乘，二甲雙胍已被證明可能調(diào)節(jié)人體內(nèi)的免疫活性，包括抑制t細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)驹尼。此外趣避，二甲雙胍通過保守的PMK-1/p38 MAPK通路促進(jìn)小鼠先天免疫。我們的研究結(jié)果與這些觀察結(jié)果一致扶欣，因?yàn)槲覀円沧C實(shí)了二甲雙胍治療斑馬魚的促炎因子(TNF-α鹅巍，IL-1β，IL-6和IL-8)的減少料祠。這些發(fā)現(xiàn)與先前關(guān)于二甲雙胍抗炎作用的研究一致(Jing et al.骆捧， 2018;Xian et al.， 2021)髓绽，進(jìn)一步證實(shí)了二甲雙胍在抑制炎癥反應(yīng)中的作用敛苇。

二甲雙胍調(diào)控活性氧的多種作用機(jī)制引起了廣泛關(guān)注。研究表明顺呕，二甲雙胍可以通過多種途徑調(diào)節(jié)ROS枫攀。值得注意的是，研究報(bào)告強(qiáng)調(diào)了二甲雙胍在NLRP3激活后減輕巨噬細(xì)胞線粒體ROS (mtROS)積累的能力株茶。因此来涨，二甲雙胍已被證實(shí)通過激活A(yù)MPK通路或直接影響線粒體來減少ROS的產(chǎn)生。與這些發(fā)現(xiàn)一致启盛，我們的研究結(jié)果與Sekar等人的研究結(jié)果一致蹦掐，他們證明了過氧化氫在斑馬魚和巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)的高ROS生成顯著減少。這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步鞏固了對二甲雙胍在調(diào)節(jié)ROS水平方面的有效性的理解僵闯，為揭示其調(diào)節(jié)細(xì)胞活動能力的其他細(xì)節(jié)提供了關(guān)鍵線索卧抗。

ROS在中性粒細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。早期研究表明鳖粟，ROS水平的增加會引發(fā)一系列細(xì)胞反應(yīng)社裆，包括中性粒細(xì)胞的遷移。此外向图，氧化應(yīng)激升高可能引起炎癥微環(huán)境的改變泳秀，破壞組織酸堿平衡标沪。值得注意的是，我們的研究表明嗜傅，當(dāng)身體處于炎癥狀態(tài)時谨娜，二甲雙胍的添加會導(dǎo)致乳酸水平的降低。研究表明磺陡，高濃度乳酸可使免疫細(xì)胞進(jìn)入免疫抑制狀態(tài)，影響炎癥調(diào)節(jié)漠畜。乳酸也可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞信號通路如NF-κB通路影響炎癥介質(zhì)的表達(dá)水平币他。隨著乳酸濃度的增加，體內(nèi)的乳酸化水平也會增加憔狞。先前的研究表明H3K18乳酸化與某些細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)蝴悉。然而，我們的研究清楚地證明了乳酸和活性氧水平之間的關(guān)系瘾敢。我們的數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了ROS在炎癥中的核心作用拍冠，并將ROS與H3K18乳酸化聯(lián)系起來，揭示了一個復(fù)雜的反饋回路簇抵，其中細(xì)微的分子變化深刻影響細(xì)胞行為和整體健康庆杜。這一發(fā)現(xiàn)不僅擴(kuò)大了我們對活性氧與代謝產(chǎn)物之間相互作用的理解，而且為更深入地理解炎癥調(diào)節(jié)的分子機(jī)制提供了新的視角碟摆。

有趣的是晃财，我們的研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以降低組蛋白H3K18和乳酸化基因的表達(dá)，表明二甲雙胍可以降低乳酸化水平典蜕。這是一項(xiàng)新發(fā)現(xiàn)断盛，之前沒有文獻(xiàn)報(bào)道二甲雙胍會影響乳酸化，這為深入研究二甲雙胍抗炎作用的分子機(jī)制開辟了新的途徑愉舔。更重要的是钢猛，我們的研究揭示了乳酸化和活性氧的產(chǎn)生之間的潛在聯(lián)系。我們觀察到乳酸的添加可以增加ROS水平轩缤，隨后影響中性粒細(xì)胞遷移命迈，而二甲雙胍可以減輕這種影響。這一發(fā)現(xiàn)表明典奉，乳酸化可能通過影響ROS的產(chǎn)生來影響中性粒細(xì)胞的功能躺翻，二甲雙胍可能通過調(diào)節(jié)這一過程發(fā)揮抗炎作用。最后卫玖，我們的工作表明公你，過氧化氫處理提高了斑馬魚的促炎因子表達(dá)，放大了中性粒細(xì)胞的遷移假瞬，并強(qiáng)調(diào)了ROS在炎癥中的關(guān)鍵作用陕靠。

總之迂尝，隨著我們繼續(xù)解開免疫、炎癥和代謝之間復(fù)雜的相互作用剪芥，二甲雙胍等影響這些途徑的藥物可能成為新治療方法的基石垄开。未來的工作應(yīng)該探索H3K18乙酰化的確切機(jī)制和潛在應(yīng)用税肪，從而豐富這一新興的研究領(lǐng)域溉躲。

綜上所述，二甲雙胍通過抑制組蛋白(H3K18)乳酸化益兄，導(dǎo)致隨后的活性氧(ROS)水平下降锻梳，有效地減少斑馬魚炎癥模型中的中性粒細(xì)胞募集。組蛋白乳酸化和ROS生成之間的直接聯(lián)系揭示了有希望的抗炎靶點(diǎn)净捅，強(qiáng)調(diào)了二甲雙胍在免疫相關(guān)疾病中的潛在治療意義疑枯。

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