文獻(xiàn)：Philip AM, Wang Y, Mauro A, El-Rass S, Marshall JC, Lee WL, Slutsky AS, dosSantos CC, Wen XY. Development of a zebrafish sepsis model for high-throughput drug discovery. Mol Med. 2017 Jul;23:134-148. doi: 10.2119/molmed.2016.00188. Epub 2017 Jun 7. PMID: 28598490; PMCID: PMC5522968.

雜志：MOLECULAR MEDICINE

摘要

膿毒癥是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要原因伴郁。目前的治療方式在很大程度上是支持性的耿战。由于對(duì)先天免疫反應(yīng)的復(fù)雜性和異質(zhì)性認(rèn)識(shí)不足，專注于抑制炎癥宿主反應(yīng)特異性介質(zhì)的干預(yù)策略在很大程度上是不成功的焊傅。此外剂陡，傳統(tǒng)的藥物開發(fā)管道耗時(shí)且昂貴，并且與基于細(xì)胞的篩選相關(guān)的低成功率強(qiáng)調(diào)了對(duì)整個(gè)生物體篩選策略的需求狐胎，特別是對(duì)于復(fù)雜的病理過程鸭栖。在這里，我們建立了脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的斑馬魚內(nèi)毒素血癥模型握巢，該模型表現(xiàn)出人類膿毒癥的主要特征晕鹊，包括水腫和組織/器官損傷，血管通透性增加和血管滲漏，伴隨著細(xì)胞連接蛋白表達(dá)改變捏题，細(xì)胞因子表達(dá)增加，免疫細(xì)胞活化和活性氧(ROS)產(chǎn)生肉渴，循環(huán)減少和血小板聚集增加公荧。我們使用三個(gè)主要讀數(shù):死亡率、血管滲漏和ROS產(chǎn)生同规，測(cè)試了該模型用于基于表型的藥物篩選的適用性循狰。初步篩選確定法舒地爾，一種在小鼠模型中防止血管泄漏的藥物券勺，作為先導(dǎo)打擊绪钥，從而驗(yàn)證了我們的模型在敗血癥藥物篩選中的實(shí)用性。該斑馬魚膿毒癥模型具有快速分析整個(gè)生物體中膿毒癥相關(guān)病理和細(xì)胞過程的潛力关炼，以及篩選和驗(yàn)證許多可以在體內(nèi)改變膿毒癥病理的化合物程腹。

介紹

敗血癥被定義為由宿主對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)引起的危及生命的器官功能障礙。對(duì)感染的全身反應(yīng)在生物學(xué)上是復(fù)雜的儒拂、冗余的寸潦，可由感染性和非感染性觸發(fā)因素激活，對(duì)人類的了解很少社痛。此外见转，由于某些組織或細(xì)胞類型無法進(jìn)入，許多免疫生物學(xué)不能在人體中進(jìn)行生理學(xué)檢查蒜哀。依賴先驗(yàn)的生物學(xué)知識(shí)和干預(yù)措施的可用性來改變臨床前模型的結(jié)果在轉(zhuǎn)化為臨床時(shí)失敗了斩箫。

雖然對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的研究已經(jīng)帶來了新的見解，但對(duì)假定的候選者的更深入了解需要開發(fā)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)撵儿，以便在更相關(guān)的器官背景下分析細(xì)胞間通信和組織-組織相互作用乘客。盡管“芯片上的器官”等替代方法為研究不同細(xì)胞類型之間的相互作用提供了獨(dú)特的機(jī)會(huì)，但這些方法與整個(gè)動(dòng)物的相關(guān)性仍然不足淀歇，在整個(gè)動(dòng)物中寨典，先天免疫功能障礙的影響可以在生物體水平上進(jìn)行研究。

傳統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)的方法是緩慢的房匆，通常需要幾年的時(shí)間耸成。可能的靶點(diǎn)列表是巨大的浴鸿，而瞄準(zhǔn)其中任何一個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)致生存率顯著提高的機(jī)會(huì)很小井氢。因此，需要更好的方法來加快藥物發(fā)現(xiàn)的管道岳链。在整個(gè)生物體中基于表型的篩選允許對(duì)新化合物進(jìn)行測(cè)試花竞，同時(shí)以無監(jiān)督和系統(tǒng)的方式在整個(gè)生物體水平上評(píng)估復(fù)雜的生物過程，從而增強(qiáng)了為臨床前和機(jī)制研究檢測(cè)更合理靶點(diǎn)的潛力。雖然小鼠在臨床前研究中仍然不可或缺约急，但小鼠生物學(xué)的幾個(gè)方面零远，如藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)階段所需的成本、時(shí)間和藥物數(shù)量厌蔽，限制了其在藥物發(fā)現(xiàn)的大規(guī)模遺傳和治療篩選中的常規(guī)使用牵辣。

斑馬魚最近成為研究人類病理的強(qiáng)大脊椎動(dòng)物模型。通過基因組測(cè)序奴饮，斑馬魚為疾病建模提供了獨(dú)特而強(qiáng)大的原型纬向，因?yàn)?其在基本細(xì)胞生物學(xué)過程中與人類具有顯著的生理相似性和功能保守程度，相對(duì)容易的胚胎操作和全身成像戴卜，高繁殖力逾条，低成本和透明度，各種分子工具的可用性投剥，用于正向反向遺傳學(xué)和基因組編輯师脂。斑馬魚和人類參考基因組之間的比較表明，大約70%的人類基因至少有一個(gè)明顯的斑馬魚同源基因江锨。在藥物研究中危彩，斑馬魚胚胎是高通量體內(nèi)藥物篩選的理想選擇，并且易于自動(dòng)化泳桦。斑馬魚結(jié)合了體內(nèi)模型的生物復(fù)雜性汤徽，以及高通量篩選和快速評(píng)估潛在毒性和脫靶效應(yīng)的便捷性。預(yù)計(jì)從這種針對(duì)整個(gè)疾病途徑的體內(nèi)篩選中鑒定出的先導(dǎo)化合物將比基于細(xì)胞的體外篩選具有更高的成功率灸撰。

在過去的十年中谒府，斑馬魚作為研究傳染病、炎癥性疾病浮毯、癌癥和其他免疫相關(guān)疾病的優(yōu)秀模型被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域完疫。斑馬魚擁有與哺乳動(dòng)物相同的主要血統(tǒng)。它們的先天免疫系統(tǒng)在發(fā)育過程中變得活躍债蓝，在受精后16小時(shí)(HPF)和26小時(shí)(HPF)分別出現(xiàn)功能齊全的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞壳鹤。此外，它們的先天免疫反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄特征類似于在哺乳動(dòng)物和細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中看到的饰迹。斑馬魚的適應(yīng)性免疫反應(yīng)直到發(fā)育大約三周后才變得活躍芳誓，這意味著在沒有T細(xì)胞和b細(xì)胞反應(yīng)的早期幼魚階段可以對(duì)其進(jìn)行分離研究。主要病原體識(shí)別受體(PRRs)及其下游信號(hào)通路和先天效應(yīng)機(jī)制在人和斑馬魚之間是保守的啊鸭，這使得斑馬魚成為研究先天免疫系統(tǒng)疾病的絕佳模型锹淌。然而，關(guān)于魚類內(nèi)毒素識(shí)別的機(jī)制一直存在爭議赠制。盡管脂多糖(LPS)在魚類研究中是一種公認(rèn)的免疫刺激劑赂摆，但有報(bào)道稱，與人類不同，魚類對(duì)LPS的識(shí)別并不通過TLR4進(jìn)行烟号。事實(shí)上绊谭，大多數(shù)魚類(斑馬魚除外)缺乏TLR4，因此硬骨魚模型中涉及LPS信號(hào)傳導(dǎo)的分子機(jī)制尚不清楚汪拥。然而达传，下游信號(hào)分子如NFκB和MyD88的激活以及由此產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子的釋放似乎是硬骨魚和哺乳動(dòng)物之間的保守反應(yīng)。

膿毒癥包括一系列反應(yīng)喷楣，從全身炎癥反應(yīng)到器官功能障礙趟大，再到多器官系統(tǒng)衰竭鹤树，最終死亡铣焊。在疾病的最初階段，患者對(duì)感染表現(xiàn)出壓倒性的炎癥反應(yīng)罕伯。這主要是由于免疫細(xì)胞的激活和促炎細(xì)胞因子(IL-1曲伊、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)和IL-8)在這一階段的釋放追他。這種系統(tǒng)性炎癥級(jí)聯(lián)是由各種細(xì)菌產(chǎn)物引發(fā)的坟募，如內(nèi)毒素。這些反過來又在微血管和細(xì)胞水平上帶來許多變化邑狸，包括炎癥和凝血級(jí)聯(lián)的彌漫性激活懈糯、血管舒張、毛細(xì)血管內(nèi)皮滲漏单雾、血管分布失調(diào)以及由此導(dǎo)致的細(xì)胞水平上對(duì)氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的不正常利用赚哗。最終導(dǎo)致微血管血栓形成和微血管堵塞、灌注不足硅堆、缺血和組織損傷屿储，進(jìn)而發(fā)展為多器官系統(tǒng)功能衰竭，最終死亡渐逃。雖然機(jī)體確實(shí)試圖通過產(chǎn)生抗炎介質(zhì)(IL-10)來調(diào)節(jié)初始的高炎癥狀態(tài)够掠，但臨床觀察到這是一段免疫抑制期，這種低反應(yīng)狀態(tài)的持續(xù)與繼發(fā)感染和死亡的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)茄菊。

內(nèi)毒素概括了膿毒癥的許多重要特征疯潭，包括血管完整性喪失、滲出性水腫的產(chǎn)生面殖、中性粒細(xì)胞外滲袁勺、免疫細(xì)胞活化、促炎和活性氧(ROS)合成增加畜普、微循環(huán)和凝血功能障礙期丰。在這里，我們提出并驗(yàn)證了一種新的內(nèi)毒素血癥斑馬魚模型，我們希望它可以加速敗血癥藥物的發(fā)現(xiàn)钝荡，用于基于表型的化學(xué)篩選街立，以確定具有疾病改善潛力的新治療靶點(diǎn)和化合物。

材料與方法

斑馬魚品系與護(hù)理

成年和胚胎斑馬魚使用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室程序飼養(yǎng)和維持。斑馬魚在28.5±0.5°C的光照/黑暗周期中飼養(yǎng)14 h/10 h。通過自然交配獲得胚粮彤，在胚培養(yǎng)基中培養(yǎng)影锈。本研究中的所有實(shí)驗(yàn)均按照圣邁克爾醫(yī)院動(dòng)物委員會(huì)制定的倫理準(zhǔn)則進(jìn)行，并批準(zhǔn)了動(dòng)物協(xié)議ACC660瞬哼。大于24 HPF的胚胎用200μM 1-苯基-2-硫脲處理以阻止色素沉著

lps誘導(dǎo)的斑馬魚膿毒癥模型:生存曲線和表型分析

常用的小鼠膿毒癥模型是LPS和盲腸結(jié)扎穿刺模型。考慮到實(shí)用性荣病，本研究采用LPS制作斑馬魚膿毒癥模型。暴露于不同濃度LPS(大腸桿菌0111:B4;Sigma)渗柿。采用浸漬法將受精后3 d的幼魚暴露于LPS環(huán)境中个盆。分別用25、50朵栖、75颊亮、100和200μg/mL LPS(溶解于胚液中)浸泡，在28.5℃下靜置2陨溅、7终惑、9和24 h，每次處理的總?cè)莘e為2 mL门扇。對(duì)照幼魚暴露于胚培養(yǎng)基中雹有。試驗(yàn)采用3個(gè)重復(fù)組，每個(gè)處理10只幼魚悯嗓。在LPS暴露6小時(shí)后件舵，對(duì)40只幼魚/LPS濃度進(jìn)行表型分析。

測(cè)量lps誘導(dǎo)的血管滲漏

微血管造影劑量子點(diǎn)(QD605)和異硫氰酸熒光素(FITC)-葡聚糖(4kd)用于觀察內(nèi)皮屏障功能喪失和血管滲漏脯厨。

將3只DPF Tg (flk1: GFP)和Tg (kdrl: mcherry)幼魚暴露于LPS(100μg/mL)中铅祸，在28.5℃下靜浸6 h。對(duì)照幼魚暴露于胚培養(yǎng)基中合武。然后用丁香油和QD605麻醉幼魚(平均3次临梗，每次處理9-14只幼魚)或FITC葡聚糖(4KD;采用標(biāo)準(zhǔn)顯微注射方案，將Tg (flk1: GFP)或Tg (kdrl: mcherry)幼魚分別注射到總主靜脈(CCV)中稼跳，每次處理平均3次盟庞，每次10-15只幼魚。將注射后的胚胎轉(zhuǎn)移到胚胎培養(yǎng)基中并使其恢復(fù)汤善，然后在注射后30分鐘使用徠卡熒光顯微鏡(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)成像什猖。為了實(shí)時(shí)觀察血管滲漏票彪，注射fitc -葡聚糖恢復(fù)后，對(duì)照和lps處理的幼魚立即固定在低熔點(diǎn)瓊脂糖中不狮，使用徠卡熒光顯微鏡進(jìn)行延時(shí)成像降铸。

細(xì)胞因子和細(xì)胞連接蛋白表達(dá)的測(cè)定

以伸長因子1α (EF1α)作為管家基因?qū)φ眨捎冒攵糠崔D(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)評(píng)估細(xì)胞因子(平均3個(gè)試驗(yàn)摇零，每個(gè)試驗(yàn)20只幼魚/處理)和細(xì)胞連接蛋白(平均3 - 5個(gè)試驗(yàn)推掸，每個(gè)試驗(yàn)20只幼魚/處理)的相對(duì)表達(dá)。

RNA提取和cDNA合成驻仅。將3只DPF野生型斑馬魚幼魚暴露于LPS(100μg/mL)中谅畅，在28.5℃下靜浸6 h。對(duì)照幼魚暴露于胚培養(yǎng)基中噪服。采用RNeasy提取試劑盒(Qiagen, Mississauga, Ontario, Canada)提取總RNA毡泻，每組20只，DNase處理芯咧。用NanoDrop?分光光度計(jì)在260/280 nm處測(cè)定總RNA的濃度牙捉。使用Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Invitrogen)根據(jù)制造商的說明竹揍，從1μg總RNA合成第一鏈cDNA敬飒。

PCR條件。感興趣的基因和使用的引物對(duì)如表1所示芬位。cDNA擴(kuò)增在94°C初始變性2分鐘后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)无拗，分別為變性(94°C 30秒)、退火(58°C 30秒)和延伸(72°C 1分鐘)昧碉，最后在72°C延伸10分鐘后終止英染。PCR總?cè)莘e為20μL，包括1 × PCR緩沖液被饿，1.25 mM MgCl2, 0.25 mM dNTP, 1 U Taq聚合酶四康，0.5μM正向和反向引物，1μL cDNA狭握。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳闪金。每個(gè)PCR產(chǎn)物的大小通過與100個(gè)堿基的DNA階梯進(jìn)行比較來確定。采用凝膠記錄系統(tǒng)和Fiji分析軟件對(duì)SYBR安全染色凝膠進(jìn)行密度分析论颅，定量PCR產(chǎn)物哎垦。對(duì)于每個(gè)樣品處理，獲得的目標(biāo)基因特異性帶的綜合密度值除以EF1α帶獲得的信號(hào)恃疯，得到相對(duì)mRNA豐度值漏设。EF1α波段的綜合密度值隨處理無顯著變化。每個(gè)基因至少重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次今妄。結(jié)果以n次試驗(yàn)的相對(duì)強(qiáng)度±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)表示郑口。

ZO-1免疫熒光分析

將3只DPF Tg (kdrl: mcherry)幼魚暴露于LPS(100μg/mL)中鸳碧，在28.5℃下靜浸6 h。對(duì)照幼魚暴露于胚培養(yǎng)基中犬性。胚胎在2%多聚甲醛(PFA)的PBST(磷酸鹽緩沖鹽水+ 0.1% Tween 20)中于4°C下固定過夜杆兵。然后胚胎在室溫下PBST中洗滌4次，5分鐘仔夺，在PBST + 0.5% TritonX-100中透性30分鐘琐脏。然后將胚胎用PBST + 0.1% TritonX-100 + 10%正常山羊血清(NGS) + 1%牛血清蛋白(BSA)在室溫下封閉2小時(shí)。胚胎用一抗(兔抗zo -1 mid;Invitrogen #40 2200)在阻斷溶液(1:200)中缸兔，在4°C下過夜日裙。然后在RT下PBST中洗滌6次，20分鐘惰蜜，用二抗(山羊抗兔IgG Alexa flu488;1:1000)在阻斷液中孵育2小時(shí)昂拂。胚胎在PBST中孵育3次，孵育10分鐘抛猖，然后置于4′格侯，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI) Vectashield中。圖像由蔡司共聚焦顯微鏡拍攝财著。平均3次試驗(yàn)联四，4 ~ 6只/處理，獲得定量數(shù)據(jù)撑教。

測(cè)量免疫細(xì)胞的活化和ROS的產(chǎn)生

為了觀察中性粒細(xì)胞的活化和轉(zhuǎn)運(yùn)朝墩，將3只DPF Tg (mpx: GFP)幼魚在28.5°C下靜浸LPS(100μg/mL) 4 h，使用徠卡熒光顯微鏡(n = 7/處理)成像伟姐。為了可視化中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在lps誘導(dǎo)的組織損傷中所起的作用收苏，3 DPF Tg (coro1a: eGFP;lyz: Dsred)雙轉(zhuǎn)基因幼魚(巨噬細(xì)胞顯示綠色熒光，中性粒細(xì)胞顯示綠色和紅色熒光)在28.5°C下靜態(tài)浸泡LPS(100μg/mL) 6 h愤兵，使用徠卡熒光顯微鏡(n = 7/處理)成像鹿霸。使用Fiji分析軟件統(tǒng)計(jì)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量。

用2 '秆乳，7 ' -二氯二氫熒光素(DCFH-DA;Sigma-Aldrich)懦鼠， ROS指標(biāo)(n = 4/組)。將野生型斑馬魚置于LPS(100μg/mL)中矫夷，在28.5℃下靜浸5 h葛闷，然后與100μM DCFH-DA一起在28.5℃下黑暗孵育1h，用胚水洗滌3次双藕，孵育5 min淑趾。DCFH- da擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞酯酶去乙跤桥悖化為非熒光DCFH扣泊，后者被ROS迅速氧化為高熒光的2’近范，7’-二氯熒光素。熒光強(qiáng)度與胞漿內(nèi)ROS水平成正比延蟹。為了證明觀察到的對(duì)ROS產(chǎn)生的影響是LPS特異性的评矩，我們還進(jìn)行了LPS劑量反應(yīng)和由此產(chǎn)生的ROS產(chǎn)生的變化。野生型斑馬魚暴露于不同濃度的LPS(0阱飘、25斥杜、50、75和100μg/mL;n = 3/處理)在28.5°C下靜浸5 - 6 h沥匈，然后與100μM DCFH-DA在28.5°C下黑暗孵育1 h蔗喂，用胚水洗滌3次，孵育5 min高帖。使用徠卡DFC 300-FX相機(jī)和徠卡熒光顯微鏡拍攝照片缰儿，并使用Fiji分析軟件進(jìn)行處理。

校正總熒光(CTF)的計(jì)算公式如下:CTF =積分密度-(選定細(xì)胞面積×背景讀數(shù)的平均熒光)

測(cè)量循環(huán)缺陷

為了可視化lps誘導(dǎo)的循環(huán)變化散址，3 DPF Tg (flk1: GFP;gata-1: Dsred)雙轉(zhuǎn)基因幼魚在28.5°C下靜浸LPS(100μg/mL) 6 h乖阵，用徠卡熒光顯微鏡成像(平均3次試驗(yàn)，7只幼魚/處理)预麸。對(duì)照幼魚暴露于胚培養(yǎng)基中瞪浸。結(jié)果用鄰二苯胺(OD)染色技術(shù)對(duì)血紅蛋白進(jìn)行了驗(yàn)證。簡單地說师崎，將LPS處理后固定在4% PFA中的幼魚在PBST中洗滌默终，然后在o- diisidine (OD)染色液(10 mL溶液中含有6 mg OD, 4 mL EtOH, 100μL 1M乙酸鈉和5.9 mL水)中黑暗孵育6分鐘椅棺。然后在PBST中洗滌3次犁罩，5分鐘，用明視野顯微鏡成像两疚。

為了測(cè)量lps誘導(dǎo)的血管狹窄床估，使用徠卡熒光顯微鏡測(cè)量背主動(dòng)脈(卵黃延伸尖端正上方)直徑的像素距離，然后使用斐濟(jì)分析軟件轉(zhuǎn)換為μm (n = 5-8 /處理)诱渤。

測(cè)量血小板聚集

為了觀察血小板丐巫，相當(dāng)于人類血小板(招募，聚集和可能形成微血管血栓)勺美，將3只DPF Tg (CD41: GFP)幼魚在28.5°C下靜態(tài)浸泡6小時(shí)递胧，暴露于LPS(100μg/mL)中，并使用徠卡熒光顯微鏡成像(平均3次試驗(yàn)赡茸，5-7只幼魚/處理)缎脾。

膿毒癥中免疫抑制狀態(tài)的表征

為了描述膿毒癥晚期常見的免疫抑制狀態(tài)，在lps治療后6-7小時(shí)對(duì)中性粒細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)占卧。將3只DPF Tg (mpx: GFP)幼魚在28.5°C下靜浸LPS(100μg/mL) 6-7 h遗菠，使用徠卡熒光顯微鏡(n = 7-12 /處理)成像联喘。晚期炎癥介質(zhì)HMGB1的轉(zhuǎn)錄水平也通過定量實(shí)時(shí)PCR測(cè)定，如前幾節(jié)所述辙纬。

斑馬魚膿毒癥+和NFκB的LPS信號(hào)傳導(dǎo)

TLR4a豁遭、TLR4b和MyD88的轉(zhuǎn)錄本豐度通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，如前幾節(jié)所述贺拣。利用Encinas等人的改進(jìn)方案蓖谢，通過全胚胎免疫熒光觀察NFκB蛋白表達(dá)和核易位。簡單地說譬涡，將3只DPF幼魚暴露于LPS(100μg/mL)中蜈抓，在28.5°C下靜態(tài)浸泡2小時(shí)。對(duì)照幼魚暴露于胚培養(yǎng)基中昂儒。胚胎在2% PFA的PBST中于4°C下固定過夜沟使。在PBST + 0.5% TritonX-100中，胚胎在RT下洗4次渊跋，5分鐘腊嗡，RT下透性30分鐘。胚胎在PBST + 0.1% TritonX-100 + 10% NGS + 1% BSA中封閉2 h拾酝。胚胎用一抗(NFκB/p65 [Rel A] Ab-1燕少，兔多克隆抗體;RB-1638-P0)在阻斷溶液(1:200)中在4°C下過夜。然后在RT下PBST中洗滌6次蒿囤，20分鐘客们，用二抗(山羊抗兔IgG Alexa flu488;1:1000)在阻斷液中孵育2小時(shí)。胚胎最后在PBST中孵育3次材诽，孵育10分鐘底挫，并在DAPI Vectashield中孵育。圖像由蔡司共聚焦顯微鏡拍攝脸侥。平均3次試驗(yàn)建邓，每次處理3 - 4只幼魚，獲得定量數(shù)據(jù)睁枕。

驗(yàn)證斑馬魚膿毒癥模型在高通量藥物篩選應(yīng)用中的實(shí)用性

內(nèi)部組裝的小分子藥物文庫與適當(dāng)?shù)年栃院完幮詫?duì)照一起官边，最初溶解在100%二甲基亞砜(DMSO)中，濃度為10 mg/mL外遇，然后用無核酸酶的水進(jìn)一步稀釋注簿。3只DPF野生型斑馬魚幼魚與LPS(100μg/mL)和小分子文庫(終藥濃度為1μg/mL;DMSO <0.01%)在28.5°C下，96孔設(shè)置過夜(暗壁板跳仿，底部透明;1幼魚/;實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)诡渴。在同一盤子上也設(shè)置了適當(dāng)?shù)膶?duì)照。篩選是使用我們內(nèi)部的高通量機(jī)器人藥物發(fā)現(xiàn)平臺(tái)完成的塔嬉。初步篩選涉及96個(gè)小分子(分子量250-500)靶向表觀遺傳調(diào)節(jié)劑玩徊、免疫調(diào)節(jié)劑及其類似物(生命化學(xué)品)租悄。這些分子既滿足Lipinski的“五法則”，也滿足Veber準(zhǔn)則和差異性評(píng)價(jià)恩袱。

在我們的高通量篩選中使用的三個(gè)主要讀數(shù)是:(1)小分子提高存活率的能力泣棋，(2)小分子挽救lps誘導(dǎo)的血管滲漏和由此導(dǎo)致的尾鰭水腫的能力(通過明場(chǎng)顯微鏡觀察)和(3)小分子挽救lps誘導(dǎo)的系統(tǒng)性ROS產(chǎn)生的能力(見上面的方案);使用ImageXpress Ultra共聚焦高含量分析系統(tǒng)(Molecular Devices)進(jìn)行成像和定量。

為了進(jìn)一步測(cè)試法舒地爾對(duì)LPS誘導(dǎo)的死亡畔塔、血管滲漏和ROS產(chǎn)生的影響潭辈，將3只DPF斑馬魚幼魚與LPS(100μg/mL)共孵育，在不同濃度的法舒地爾(0.01 ~ 75μM)下澈吨，獲得該藥物相對(duì)于生存的EC50(處理采用3個(gè)重復(fù)組把敢，每個(gè)處理10只幼魚)。fitc -葡聚糖注射(平均3次試驗(yàn)谅辣，每處理10只幼魚)和活性氧產(chǎn)生測(cè)定(見上面的方案;平均3個(gè)試驗(yàn)(3只幼魚/處理)來評(píng)估法舒地爾對(duì)lps誘導(dǎo)的血管滲漏和ROS生成的拯救能力修赞。

統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。采用T檢驗(yàn)(對(duì)照與LPS實(shí)驗(yàn))和Tukey事后檢驗(yàn)的雙向方差分析(藥物搶救實(shí)驗(yàn))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較桑阶，以確定治療差異柏副。當(dāng)需要滿足正態(tài)性和等方差假設(shè)時(shí)，對(duì)原始數(shù)據(jù)或轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析蚣录。概率水平P < 0.05為顯著性割择。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用graphpad Prism軟件進(jìn)行。

暴露于LPS引起的尾鰭水腫和死亡率

暴露于LPS的三只DPF斑馬魚幼魚顯示出劑量依賴性的死亡率增加(圖1A)萎河。雖然較低濃度的LPS(25或50μg/mL)在前24小時(shí)內(nèi)沒有導(dǎo)致死亡荔泳，但50μg/mL組中5%的幼魚出現(xiàn)了腫脹的心包囊(圖1B)。暴露于75或100 μ g/mL的中高劑量LPS分別導(dǎo)致40%和93%的死亡率虐杯。暴露于50和75μg/mL LPS的幼魚心包腫脹玛歌。75μg/mL LPS組只有7.5%的幼魚出現(xiàn)尾鰭水腫和組織損傷，而100μg/mL LPS組92.5%的幼魚出現(xiàn)尾鰭損傷和水腫厦幅。此外沾鳄，暴露于100μg/mL LPS下的幼魚尾鰭水腫和損傷隨著時(shí)間的推移而惡化(圖1C, D)。暴露于LPS后确憨，最高劑量200μg/mL導(dǎo)致心包出血，2小時(shí)死亡率為37%瓤的，7小時(shí)死亡率為100%休弃。所有后續(xù)實(shí)驗(yàn)均使用100 μ g/mL LPS劑量進(jìn)行，因?yàn)樵搫┝繉?dǎo)致適合基于表型的藥物篩選的尾部表型圈膏，如果不進(jìn)行干預(yù)塔猾，也會(huì)導(dǎo)致死亡率。

lps誘導(dǎo)斑馬魚幼魚血管滲漏

注射量子點(diǎn)(QD605)提供了明亮的生命標(biāo)記稽坤，顯示暴露于LPS(100μg/mL)后47%的斑馬魚幼魚(Flk1: GFP)血管滲漏增加(圖2A, B)丈甸。最明顯的QD滲漏發(fā)生在卵黃延伸尖端正上方的區(qū)域(圖2A)糯俗，沿著后基數(shù)靜脈(PCV)。由于量子點(diǎn)相對(duì)較大(約為大分子的大小~ 15-20 nm)睦擂，因此使用該方法無法識(shí)別較小的泄漏得湘。為了解決這個(gè)問題，我們使用了分子量為4 KD(~ 14埃)的綠色標(biāo)記的fitc -葡聚糖來證明lps誘導(dǎo)的血管滲漏通過節(jié)間血管(isv)和fitc -葡聚糖在尾部尖端的積累顿仇，這與尾鰭中看到的水腫和組織損傷相對(duì)應(yīng)(圖2C)淘正。fitc -葡聚糖注射后lps誘導(dǎo)的血管滲漏延時(shí)成像可以實(shí)時(shí)顯示體內(nèi)血管滲漏(見補(bǔ)充數(shù)據(jù))。注射fitc -葡聚糖檢測(cè)到97%的幼魚有血管滲漏臼闻，與量子點(diǎn)注射相比鸿吆，這是一種更可靠的檢測(cè)lps誘導(dǎo)血管滲漏的方法(圖2D)。

LPS改變細(xì)胞連接蛋白的表達(dá)和分布

內(nèi)毒素血癥后述呐，血管滲漏被認(rèn)為是由微生物或/和宿主因子對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和/或其緊密和粘附連接的直接作用引起的(TJs和AJs惩淳，圖3A)。AJs是組織完整性的基礎(chǔ)乓搬，而tj則與屏障功能有關(guān)(27)黎泣。將斑馬魚幼魚暴露于100μg/mL LPS中，顯著降低TJ蛋白o(hù)ccludin A的轉(zhuǎn)錄水平(2.7倍;圖3B)缤谎， occludin B(2.4倍;圖3C)抒倚， claudin 5a(1.9倍;圖3D)和claudin 5b(1.8倍;圖3E)， claudin 2的表達(dá)增加(4倍;圖3F)坷澡，對(duì)AJ蛋白VE鈣粘蛋白的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有影響(圖3G)托呕。LPS也顯著降低(2.6倍;ZO-1是一種與跨膜TJ蛋白、細(xì)胞骨架和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子相關(guān)的支架連接蛋白频敛。ZO-1蛋白表達(dá)也明顯降低(圖3I)项郊，并且在lps誘導(dǎo)的尾部水腫和組織損傷部位出現(xiàn)斷裂/碎片化(圖3J)。

LPS誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞血管外遷移

通過使用帶有熒光標(biāo)記的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系斟赚，我們量化了白細(xì)胞從限定血管中的遷移着降。中性粒細(xì)胞在未處理的3 DPF幼魚中處于靜止?fàn)顟B(tài)，主要位于主動(dòng)脈背側(cè)(DA;圖4 Ai)拗军。在炎癥的早期階段任洞，暴露于LPS導(dǎo)致嗜中性粒細(xì)胞從DA遷移到間隙(圖4i, B)。LPS還誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞從血管內(nèi)空間遷移到水腫尾的血管外液體中(圖4C, D)发侵。

暴露于LPS后ROS和炎癥介質(zhì)表達(dá)增加

它們的快速擴(kuò)散和多樣的生物活性使ROS成為確定彌漫性損傷和傷口到白細(xì)胞信號(hào)的存在和程度的良好候選者交掏。LPS以劑量依賴的方式誘導(dǎo)ROS生成增加(補(bǔ)充圖S1)。LPS暴露后刃鳄，與對(duì)照組相比盅弛，斑馬魚幼魚(暴露于100μg/mL LPS)的ROS產(chǎn)量迅速顯著增加(34倍)(圖5A, B)。LPS處理的幼魚尾部ROS產(chǎn)量增加與觀察到的尾部和組織損傷相對(duì)應(yīng)。間質(zhì)水腫和ROS生成的增加與關(guān)鍵促炎細(xì)胞因子表達(dá)的適度增加和抗炎細(xì)胞因子IL-1表達(dá)的較大增加進(jìn)一步相關(guān)(1.2倍;圖5C)挪鹏， IL-6(1.3倍;圖5D)见秽， TNF(1.6倍;圖5E)， IL-8l1(1.5倍;圖5F)讨盒， IL-8l2(1.3倍;圖5G)和IL-10(5.5倍;圖5 h)解取。

 補(bǔ)充1 LPS暴露顯著增加ROS的產(chǎn)生，且呈劑量依賴

 圖5 LPS誘導(dǎo)斑馬魚產(chǎn)生ROS催植，增加促炎和抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)

LPS誘導(dǎo)血管狹窄肮蛹，血流減少和血栓細(xì)胞聚集

通過轉(zhuǎn)基因斑馬魚系和血紅蛋白染色，暴露于LPS后创南，>86%的3只DPF幼魚表現(xiàn)出腦毛細(xì)血管微血管循環(huán)減少伦忠，主要是在中央動(dòng)脈(圖6A, B)。我們還通過DA和PCV觀察到循環(huán)不良和缺陷(圖6C)稿辙，并伴有DA狹窄(圖6D)昆码。在超過80%的斑馬魚幼魚中，我們還觀察到與對(duì)照組相比邻储，DA和PCV之間的CCV和胚胎尾側(cè)區(qū)域的血栓細(xì)胞聚集增加赋咽，這表明斑馬魚幼魚尾側(cè)區(qū)域有少量循環(huán)血栓細(xì)胞(圖6E, F)。

中性粒細(xì)胞數(shù)量減少和HMGB1表達(dá)增加提示斑馬魚膿毒癥模型處于免疫抑制狀態(tài)

在我們的斑馬魚膿毒癥模型中吨娜，我們觀察到炎癥后期(LPS治療后6-7小時(shí))中性粒細(xì)胞數(shù)量減少(補(bǔ)充圖S2A, S2B)脓匿， HMGB1表達(dá)增加(2.5倍)(補(bǔ)充圖S2C)，表明該模型的免疫抑制狀態(tài)與臨床膿毒癥中觀察到的相似宦赠。

斑馬魚膿毒癥模型中的LPS信號(hào)通路包括nf - κ b上調(diào)勾扭、核nf - κ b易位和升高M(jìn)yD88表達(dá)式

lps誘導(dǎo)的斑馬魚膿毒癥模型內(nèi)毒素血癥是通過NFκB和MyD88信號(hào)通路介導(dǎo)的毡琉。NFκB熒光主要定位于對(duì)照斑馬魚幼魚的細(xì)胞質(zhì)中。然而妙色，熒光也出現(xiàn)在細(xì)胞核中桅滋，并且在LPS處理的幼魚(處理后2 h)中熒光強(qiáng)度增加，提示誘導(dǎo)了斑馬魚NFκB的易位和新合成(補(bǔ)充圖S3A, S3B)身辨。這也與MyD88表達(dá)增加(2.8倍;補(bǔ)充圖S3C)丐谋，但TLR4轉(zhuǎn)錄物水平?jīng)]有變化(補(bǔ)充圖S3D, S3E)。

內(nèi)毒素誘導(dǎo)的高通量藥物篩選參數(shù)評(píng)價(jià)

我們建立了一個(gè)方案笋鄙，將健康的3只DPF幼魚分布在96孔板中，暴露于LPS和內(nèi)部組裝的不同藥物庫中14-16小時(shí)怪瓶，以檢測(cè)候選化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)的死亡、血管滲漏(以尾鰭水腫為特征)和ROS產(chǎn)生的影響。根據(jù)可重復(fù)性洗贰、易檢測(cè)性找岖、可視化、量化和與膿毒癥病理生理的相關(guān)性敛滋，選擇內(nèi)毒素血癥嚴(yán)重程度的替代標(biāo)記物作為我們表型篩選的基礎(chǔ)许布。各種先導(dǎo)候選物降低了lps誘導(dǎo)損傷的主要(尾鰭水腫和ROS產(chǎn)生)和次要(死亡率)結(jié)果標(biāo)志物。從我們96個(gè)專有小分子化合物的初步篩選中绎晃，鑒定出10個(gè)化合物可以挽救所有三種表型蜜唾。其中一種被確定的藥物是法舒地爾(圖7A, B)，一種已知可以挽救實(shí)驗(yàn)性膿毒癥小鼠模型中脂多糖誘導(dǎo)的血管滲漏的藥物庶艾。對(duì)法舒地爾的反應(yīng)被用來驗(yàn)證我們的模型在確定死亡率袁余、血管泄漏和活性氧產(chǎn)生的新修飾因子方面的實(shí)用性。該藥物在斑馬魚中的進(jìn)一步測(cè)試表明咱揍，法舒地爾對(duì)lps誘導(dǎo)的死亡具有劑量依賴性颖榜，對(duì)存活的EC50為3.852μM(圖8A)。此外煤裙，雖然所有暴露于LPS并接受載藥處理的幼魚都出現(xiàn)尾部水腫和腫脹掩完，并伴有血管滲漏和尾部fitc -葡聚糖的積累，但法舒地爾和LPS處理的幼魚中硼砰，88%的幼魚完全恢復(fù)了尾部表型和fitc -葡聚糖滲漏(圖8B, C)且蓬。法舒地爾本身對(duì)血管滲漏沒有影響，對(duì)斑馬魚幼魚沒有毒性作用题翰。法舒地爾還能挽救脂多糖誘導(dǎo)的尾部ROS生成(圖8D恶阴、E)。有趣的是遍愿，與對(duì)照組存淫、法舒地爾處理和脂多糖+法舒地爾處理的幼魚相比，脂多糖處理的幼魚魚鰾中的ROS減少(圖8F)沼填。

討論

在這里桅咆，我們建立了一種新的內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎癥和損傷斑馬魚模型，概括了人類敗血癥的主要生理和細(xì)胞特征坞笙。將斑馬魚幼魚暴露于高劑量LPS會(huì)導(dǎo)致血管滲漏岩饼，導(dǎo)致尾鰭水腫和組織損傷，并隨著時(shí)間的推移而惡化薛夜，在沒有干預(yù)的情況下籍茧，與高死亡率相關(guān)。尾巴表型還與量子點(diǎn)和葡聚糖從血管內(nèi)滲漏到間隙的增加有關(guān)梯澜，主要是沿著尾巴寞冯。血管通透性的喪失與緊密連接蛋白基因表達(dá)減少、水孔基因claudin2表達(dá)增加、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤增加吮龄、細(xì)胞因子表達(dá)增加和ROS產(chǎn)生增加有關(guān)俭茧。LPS暴露也與背主動(dòng)脈收縮有關(guān)，有證據(jù)表明流向大腦的血流量受損漓帚，血小板聚集增加母债，表明大動(dòng)脈血管收縮和血小板功能障礙。

PRRs及其下游信號(hào)通路和先天免疫效應(yīng)機(jī)制在人類和斑馬魚之間是保守的尝抖。脂多糖是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分毡们。它是一種強(qiáng)效免疫刺激劑，已知在脊椎動(dòng)物模型中可誘導(dǎo)器官功能障礙昧辽、血管麻痹甚至死亡衙熔。此外，大多數(shù)人類敗血癥病例與細(xì)菌感染有關(guān)奴迅，革蘭氏陰性菌常與嚴(yán)重?cái)⊙Y和感染性休克的發(fā)病機(jī)制有關(guān)青责。雖然最近的研究使用微生物注射細(xì)菌提取物來誘導(dǎo)斑馬魚的炎癥和敗血癥樣病理生理，但我們使用了一種更簡單的技術(shù)(水媒暴露于LPS)取具，它更適合高通量藥物篩選脖隶。

血管通透性增加有助于膿毒癥的病理生理，以及多種其他疾病狀態(tài)暇检。對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的間質(zhì)水腫形成的更深入的了解可能為屏障功能喪失的機(jī)制提供基本的見解产阱。微注射量子點(diǎn)(QD605)和fitc -葡聚糖等微血管造影造影劑，可以實(shí)時(shí)直接觀察血管通透性的變化块仆，并在體內(nèi)對(duì)靶向血管通透性的藥物進(jìn)行評(píng)價(jià)构蹬。在lps誘導(dǎo)的斑馬魚膿毒癥模型中，我們實(shí)時(shí)觀察到血管完整性的廣泛喪失和隨之而來的血管泄漏的增加悔据。注射QD605有助于檢測(cè)主要滲漏庄敛，而注射fitc -葡聚糖有助于觀察isv的輕微滲漏，以及泄漏的fitc -葡聚糖在尾鰭的積累科汗，這與這些幼魚的尾鰭水腫相吻合藻烤。

屏障完整性的破壞至少部分歸因于細(xì)胞連接蛋白的表達(dá)和分布的改變。在我們的模型中头滔，血管通透性增加伴隨著緊密連接蛋白o(hù)ccludin a和b怖亭、claudin 5a和b及其細(xì)胞內(nèi)伙伴ZO-1的表達(dá)減少。雖然在斑馬魚中claudin 5被認(rèn)為對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞更具特異性坤检，但其表達(dá)僅限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和玻璃狀血管兴猩。相反，claudin 5b在整個(gè)血管系統(tǒng)中表達(dá)早歇。其他緊密連接蛋白如occludin和許多claudin家族成員不僅存在于內(nèi)皮細(xì)胞中倾芝，也存在于上皮細(xì)胞中讨勤。在這些細(xì)胞中，TJs有助于生成主要屏障蛀醉，阻止溶質(zhì)通過細(xì)胞旁途徑擴(kuò)散)悬襟。

值得注意的是衅码，我們測(cè)量了全身連接蛋白的表達(dá)拯刁，在我們的表達(dá)分析中沒有區(qū)分上皮和內(nèi)皮連接蛋白。我們的結(jié)果與小鼠膿毒癥模型的研究一致逝段，也顯示occludin和claudin 5水平顯著降低垛玻。對(duì)膿毒癥小鼠的研究也表明，ZO-1表達(dá)減少奶躯，模式紊亂帚桩，碎片化程度更高，這與我們?cè)诎唏R魚膿毒癥模型中的發(fā)現(xiàn)相似嘹黔。我們還發(fā)現(xiàn)账嚎，在小鼠多微生物膿毒癥模型中，形成孔隙的緊密連接蛋白claudin 2表達(dá)上調(diào))儡蔓。有趣的是郭蕉，我們沒有檢測(cè)到VE鈣粘蛋白表達(dá)的任何顯著差異，盡管這種AJ蛋白廣泛參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮完整性和通透性喂江。這種差異可能是由于我們測(cè)量了VE鈣粘蛋白的總轉(zhuǎn)錄水平召锈，而VE鈣粘蛋白介導(dǎo)的內(nèi)皮通透性的大多數(shù)變化是翻譯后變化的結(jié)果，即VE鈣粘蛋白磷酸化和快速內(nèi)化和裂解获询，這并不一定反映轉(zhuǎn)錄水平的變化涨岁。

誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)IL-1、IL-6吉嚣、TNF及IL-8的兩種同源物在處理后6 h暴露于病理濃度LPS的斑馬魚幼魚中表達(dá)適度升高梢薪。眾所周知，細(xì)胞因子水平在對(duì)感染的反應(yīng)中是暫時(shí)調(diào)節(jié)的尝哆，我們可能錯(cuò)過了通常在免疫損傷后最初幾個(gè)小時(shí)觀察到的促炎細(xì)胞因子表達(dá)的峰值水平秉撇。此外，抗炎細(xì)胞因子IL-10的顯著高表達(dá)表明進(jìn)展為免疫抑制表型较解，通常與敗血癥后期繼發(fā)感染的原因有關(guān)畜疾。本研究中測(cè)量的細(xì)胞因子和趨化因子通常被用作硬骨魚免疫反應(yīng)的測(cè)量方法，并且先前已證明斑馬魚和哺乳動(dòng)物之間相當(dāng)保守(序列保守和/或結(jié)構(gòu)保守)印衔。然而啡捶，斑馬魚的許多細(xì)胞因子基因在進(jìn)化過程中獨(dú)立復(fù)制和分化，其功能含義尚不完全清楚奸焙。在人類以及內(nèi)毒素血癥和敗血癥的非靈長類動(dòng)物模型中瞎暑，這些促炎介質(zhì)已被證明協(xié)同作用彤敛，誘導(dǎo)以血管通透性增加、嚴(yán)重肺水腫和出血為特征的休克樣狀態(tài)了赌。這些細(xì)胞因子和趨化因子以自分泌和旁分泌的方式激活巨噬細(xì)胞墨榄，促進(jìn)中性粒細(xì)胞募集，激活凝血途徑并放大炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)勿她。在我們的模型中袄秩，促炎介質(zhì)的上調(diào)與中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞遷移的增加有關(guān)，同時(shí)伴隨著ROS產(chǎn)生的增加逢并，尤其是在尾部之剧。在膿毒癥中，中性粒細(xì)胞在脈管系統(tǒng)和外周器官的積聚可導(dǎo)致肺砍聊、腎背稼、膈、肝和腸等多個(gè)器官的非特異性細(xì)胞和組織損傷玻蝌。此外蟹肘，中性粒細(xì)胞還通過與內(nèi)皮壁的結(jié)合和血小板-白細(xì)胞聚集體的形成，促進(jìn)敗血癥相關(guān)的血液凝固和微血管堵塞俯树。進(jìn)一步的研究將探討循環(huán)細(xì)胞和實(shí)質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的組織損傷發(fā)病機(jī)制中的具體作用帘腹。

在敗血癥/感染性休克期間微循環(huán)發(fā)生巨大改變。局部小動(dòng)脈收縮和內(nèi)皮通透性增加會(huì)破壞正常的血流聘萨。我們觀察到斑馬魚膿毒癥模型中通過腦毛細(xì)血管的循環(huán)非常少竹椒。血流分流可能導(dǎo)致毛細(xì)血管血流減慢，并與微血栓引起的毛細(xì)血管阻塞一起米辐，可能減少向組織輸送氧氣胸完，損害二氧化碳和廢物的清除。我們還觀察到主要血管(如DA和PCV)的循環(huán)減少翘贮，DA變窄赊窥。這伴隨著脈管系統(tǒng)中血小板的聚集，這可能是lps誘導(dǎo)的微血管血栓和與敗血癥相關(guān)的微血管堵塞的形成的指示狸页，可能導(dǎo)致組織灌注減少锨能。未來的機(jī)制研究旨在闡明與病理性暴露于LPS相關(guān)的血流動(dòng)力學(xué)損害，目前正在進(jìn)行中芍耘。

死于敗血癥的患者也表現(xiàn)出免疫抑制狀態(tài)址遇。這種全身性免疫抑制狀態(tài)不僅導(dǎo)致無法根除原發(fā)感染，還會(huì)導(dǎo)致致命的繼發(fā)感染斋竞。膿毒癥的免疫抑制與免疫細(xì)胞的衰竭和免疫調(diào)節(jié)分子如細(xì)胞因子水平的改變有關(guān)倔约。在我們的模型中，雖然我們觀察到炎癥早期中性粒細(xì)胞外滲增加坝初，但在lps誘導(dǎo)的炎癥后期浸剩，中性粒細(xì)胞數(shù)量明顯減少钾军。這與先前的數(shù)據(jù)一致，顯示嚴(yán)重膿毒癥患者中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著減少绢要。有人提出吏恭，中性粒細(xì)胞數(shù)量的減少可能是由于中性粒細(xì)胞對(duì)抗入侵細(xì)菌的自我犧牲機(jī)制，稱為“NETosis”(NET:中性粒細(xì)胞胞外陷阱)重罪。作為對(duì)炎癥刺激的反應(yīng)樱哼，中性粒細(xì)胞從循環(huán)中滲出到被感染的組織，并啟動(dòng)NETosis蛆封，由此它們釋放顆粒蛋白唇礁，如中性粒細(xì)胞彈性酶和髓過氧化物酶，其作用是降解毒力因子和殺死細(xì)菌惨篱。在嚴(yán)重膿毒癥的情況下，許多中性粒細(xì)胞因此被消耗以消除細(xì)菌围俘。雖然NETs通常被認(rèn)為是有益的砸讳，但過度形成也可能通過激活血小板對(duì)宿主造成意外傷害，導(dǎo)致微血管堵塞界牡。中性粒細(xì)胞數(shù)量減少也可能為繼發(fā)性機(jī)會(huì)性感染鋪平道路簿寂。

HMGB1主要以其作為dna結(jié)合蛋白促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的作用而聞名，現(xiàn)在已被認(rèn)為是一種促炎細(xì)胞因子和炎癥的晚期介質(zhì)宿亡。有趣的是常遂，在我們的斑馬魚膿毒癥模型中，HMGB1的表達(dá)在炎癥后期也顯著增加挽荠。已知HMGB1在人類敗血癥晚期的積累在敗血癥后免疫抑制的發(fā)展中起主要作用克胳。此外，在小鼠膿毒癥模型中圈匆，治療性阻斷HMGB1已被證明可以提高死亡率漠另。斑馬魚是否也有同樣的情況還有待研究。

硬魚體內(nèi)脂多糖信號(hào)傳導(dǎo)的機(jī)制存在廣泛爭議跃赚。許多硬骨魚缺乏TLR4受體笆搓，但仍然對(duì)LPS有反應(yīng)，這強(qiáng)調(diào)了硬骨魚中LPS信號(hào)傳導(dǎo)不是通過傳統(tǒng)的TLR4信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)生的事實(shí)纬傲。我們也沒有看到TLR4在LPS刺激下的表達(dá)有任何變化满败。然而，我們?cè)诖吮砻靼唏R魚膿毒癥模型中對(duì)LPS的識(shí)別確實(shí)需要NFκB易位和MyD88叹括，與之前的研究相似算墨。

利用我們的斑馬魚內(nèi)毒素血癥模型，我們建立了一種新的篩選方案來篩選許多抗血管滲漏/抗內(nèi)毒素特性的化合物领猾。所使用的三個(gè)主要讀數(shù)(挽救死亡率米同、挽救尾部表型和挽救ROS產(chǎn)生)非常直接骇扇，不需要侵入性手術(shù)。法舒地爾是一種RhoA/ rho激酶途徑的抑制劑面粮，與內(nèi)皮屏障功能喪失和血管通透性增加有關(guān)少孝，與內(nèi)毒素誘導(dǎo)的敗血癥有關(guān)。此外熬苍，法舒地爾在小鼠模型中也被證明可以挽救lps誘導(dǎo)的血管滲漏稍走。

法舒地爾同時(shí)暴露于LPS可減少斑馬魚幼魚尾部水腫、葡聚糖泄漏和ROS產(chǎn)生柴底。有趣的是婿脸，與其他三組相比，暴露于LPS的幼魚在魚鰾中產(chǎn)生的ROS減少柄驻。魚的魚鰾與四足動(dòng)物的肺是同源的狐树。在魚類中，這主要與流體靜力作用有關(guān)鸿脓。氧氣是魚鰾中的主要?dú)怏w抑钟，該器官的組織經(jīng)常暴露于持續(xù)的高氧，導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生增加野哭。這可能解釋了我們?cè)趯?duì)照魚中觀察到的ROS產(chǎn)量增加在塔。魚鰾也被認(rèn)為是氧氣儲(chǔ)存庫，血液可以在需要的時(shí)候從中吸取額外的氧氣拨黔。這也許可以解釋在脂多糖處理的斑馬魚幼魚中看到的低ROS水平蛔溃，這表明氧氣可能來自魚鰾，以補(bǔ)償脂多糖引起的身體不同部位和遠(yuǎn)處組織的缺氧篱蝇。

結(jié)論

綜上所述贺待，給斑馬魚幼魚施用水性脂多糖可重現(xiàn)與人類敗血癥相關(guān)的許多表型和細(xì)胞變化。這些可以可靠地可視化态兴，量化和逆轉(zhuǎn)管理的抗血管滲漏化合物狠持，如法舒地爾。重要的是瞻润，臨床相關(guān)結(jié)果(如死亡率喘垂、血管滲漏和ROS產(chǎn)生)可以利用高通量方法篩選斑馬魚幼魚的各種化合物。