雜志：International Journal of Molecular Sciences

影響因子：5.6（2022）

年份：2017

通訊作者：Kun-Yun Yeh , Guor Mour Her

摘要

miR-27b已成為膽固醇和脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)樞紐朽缎，并成為治療動(dòng)脈粥樣硬化和肥胖的潛在治療靶點(diǎn)。然而，miR-27b對(duì)體內(nèi)脂質(zhì)水平的影響仍有待確定话肖。斑馬魚(yú)的脂質(zhì)通常以三醣被啵基甘油（TGs）的形式儲(chǔ)存，它們的主要儲(chǔ)存部位是內(nèi)臟最筒、肌肉內(nèi)和皮下的脂質(zhì)庫(kù)贺氓，而不是血管和肝臟。在本研究中床蜘，我們應(yīng)用microRNA-海綿（miR-SP）技術(shù)辙培，生成表達(dá)轉(zhuǎn)基因miR-27b-SP（C27bSPs）的斑馬魚(yú)，該基因破壞內(nèi)源性miR-27b活性邢锯，誘導(dǎo)血管內(nèi)脂質(zhì)積累（高脂血癥）和非酒精性脂肪肝（NAFLD）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的早期發(fā)病扬蕊。C27bSPs幼魚(yú)和幼魚(yú)的血管和肝臟中油性紅O染色明顯增加，表明miR-27b消耗在功能上促進(jìn)了脂質(zhì)積累弹囚。C27bsp也顯示出脂肪墊的增加厨相，這是由于脂肪細(xì)胞增生领曼。分子分析顯示鸥鹉，miR-27b的缺失增加了與脂肪生成和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）相關(guān)的基因的表達(dá)。此外庶骄，miR-27b-SP增加了過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）毁渗、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(C/EBP-α和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1c（SREBP-1c）的表達(dá)，并有助于脂肪生成和脂肪生成单刁。結(jié)論：我們的研究結(jié)果表明灸异，miR-27b-SP通過(guò)直接增加多種成脂/成脂轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而導(dǎo)致脂肪生成和脂肪生成的增加羔飞。在本研究中肺樟，miR-27b的表達(dá)改善了C27bSP的脂質(zhì)代謝，提示miR-27b是調(diào)節(jié)斑馬魚(yú)早期高脂血癥和脂肪形成的重要脂肪生成因子逻淌。

關(guān)鍵詞：microRNA海綿么伯、脂肪細(xì)胞發(fā)生、脂肪形成卡儒、肝脂肪變性田柔、非酒精性脂肪肝。

前言

除了經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄監(jiān)管機(jī)構(gòu)骨望，microRNAs（miRs）已被證明參與幾乎所有代謝穩(wěn)態(tài)過(guò)程硬爆，包括脂肪細(xì)胞發(fā)生，脂肪生成和葡萄糖刺激胰島素分泌擎鸠，以影響參與非酒精性脂肪肝（NAFLD）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）發(fā)病機(jī)制的代謝途徑缀磕。最近的研究表明，miRs能夠調(diào)節(jié)參與脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵基因的表達(dá)，包括miR-122袜蚕、miR-33准验、miR-106、miR-758廷没、miR-26糊饱、miR-370、miR-378颠黎、let-7另锋、miR-27、miR-143狭归、miR-34a和miR-335夭坪。一些miRs已被證明可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因，這可能參與了NAFLD的發(fā)病機(jī)制过椎。因此室梅，某些miRs可能參與了代謝性疾病的發(fā)病機(jī)制。Karbiener等人證實(shí)在人脂肪來(lái)源的干細(xì)胞（hMADS）細(xì)胞的脂肪形成過(guò)程中疚宇，miR-27b水平下降亡鼠，miR-27b的過(guò)表達(dá)抑制了在脂肪形成和后期甘油三酯積累的早期開(kāi)始階段PPAR-γ和CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-α（C/EBP-α）的表達(dá)。PPAR-γ在其30 UTR中有一個(gè)高度保守的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)敷待，并被證實(shí)為miR-27b的直接靶點(diǎn)间涵。Kang等人發(fā)現(xiàn)，miR-27是一種抗成脂的microRNA榜揖，部分原因是通過(guò)靶向抑制素（PHB）和損害線粒體功能勾哩。Kang等在研究中發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)hMADS成脂后举哟，miR-27a和miR-27b的水平均下調(diào)思劳，而miR-27a或miR-27b的過(guò)表達(dá)抑制了PHB的表達(dá)和脂肪細(xì)胞分化。此外妨猩，Kong等人證實(shí)潜叛，miR-27b在糖皮質(zhì)激素（GC）誘導(dǎo)的中心脂肪積累的發(fā)病機(jī)制中起著核心作用。過(guò)表達(dá)miR-27b抑制了棕色脂肪的分化和原代脂肪細(xì)胞的能量消耗册赛。相反钠导，抑制miR-27b的功能會(huì)下調(diào)棕色脂肪組織中特定基因的表達(dá)。此外森瘪，Vickers等人在硅牡属、體外和體內(nèi)提供了證據(jù)，表明miR-27b是脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)樞紐的一個(gè)強(qiáng)有力的候選者扼睬。他們證明逮栅，肝臟miR-27b對(duì)脂質(zhì)水平有反應(yīng)悴势，并調(diào)節(jié)關(guān)鍵代謝基因的表達(dá)（mRNA和蛋白），包括血管生成素樣3（ANGPTL3）和甘油-3-磷酸醮敕ィ基轉(zhuǎn)移酶1（GPAM）特纤，這些基因此前與脂質(zhì)相關(guān)疾病的病理生物學(xué)有關(guān)。盡管有這些觀察結(jié)果侥加，但迄今為止捧存，還沒(méi)有關(guān)于miR-27b對(duì)體內(nèi)脂質(zhì)代謝的影響的報(bào)道。

許多研究已經(jīng)證明了斑馬魚(yú)和人類的脂質(zhì)代謝之間的同源性担败。事實(shí)上昔穴，斑馬魚(yú)最近已經(jīng)成為研究NAFLD的重要模式生物。我們之前的研究表明提前，乙型肝炎病毒X蛋白吗货、強(qiáng)定蛋白、陰陽(yáng)1（YY1）和大麻素受體1（CB1R）通過(guò)增加成年斑馬魚(yú)脂肪生成基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)誘導(dǎo)肝脂肪變性的發(fā)展狈网。分子分析顯示宙搬，過(guò)表達(dá)錨定蛋白誘導(dǎo)肝臟脂肪變性，并調(diào)節(jié)四種肝臟microrna拓哺，miR-16勇垛、miR-27b、miR-122和miR-126的表達(dá)譜拓售。在本研究中窥摄，我們報(bào)道了YY1通過(guò)下調(diào)C/EBP同源蛋白10（CHOP-10）與肝臟脂質(zhì)積累的關(guān)系，該蛋白抑制了斑馬魚(yú)幼魚(yú)和成魚(yú)脂肪生成程序中PPAR-γ和C/EBP-α的表達(dá)础淤。

本研究旨在探討miR-27b缺失對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)和成魚(yú)脂質(zhì)代謝的影響。我們生成了microRNA-海綿（miR-SP）轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)（C27bSP）哨苛，以分析miR-27b消耗對(duì)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的影響鸽凶。在本研究中，我們描述了miR-27b在27bSP和野生型斑馬魚(yú)的脂質(zhì)代謝中的作用建峭。我們確定了miR-27b缺失對(duì)斑馬魚(yú)脂肪生成和脂肪生成通路調(diào)控的影響玻侥。過(guò)度抑制miR-27b的表達(dá)與高脂血癥、NAFLD（或NASH）和肥胖表型相關(guān)亿蒸。這項(xiàng)工作的結(jié)果首次揭示了miR-27b可以調(diào)節(jié)與斑馬魚(yú)脂肪代謝紊亂相關(guān)的分子病理信號(hào)通路凑兰。

結(jié)果

成熟的miR-27b序列在許多物種中都是完全保守的，在5’端有一個(gè)相同的種子序列（圖1A）边锁。為了研究?jī)?nèi)源性miR-27b在斑馬魚(yú)中的功能姑食，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種含有10個(gè)miR-27b結(jié)合位點(diǎn)的miR-27b海綿，以及4個(gè)與miRNA核苷酸9-12不匹配的核苷酸間隔物茅坛，以阻斷miR-27b的抑制活性(圖1B)音半。為了評(píng)估海綿結(jié)構(gòu)在體內(nèi)和體外的抑制活性，我們?cè)u(píng)估了海綿產(chǎn)物對(duì)miR-27b的隔離是否會(huì)破壞miRNA-27b與靶mRNA 3’UTR內(nèi)的靶位點(diǎn)的結(jié)合。因此曹鸠，我們使用熒光素酶報(bào)告基因pb-Act-eGFP-mir-27b-TS和一個(gè)載體進(jìn)行了eGFP報(bào)告基因分析煌茬，其中eGFP 的3’UTR mRNA包含miR-27b的完美靶序列。

我們檢測(cè)了miR-27b簇海綿元件（miR-27b-SP）的表達(dá)彻桃，以評(píng)估其在體內(nèi)發(fā)揮作用以降低miR-27b表達(dá)的能力坛善。在體內(nèi)和體外都進(jìn)行了eGFP報(bào)告基因檢測(cè)，以確認(rèn)miR-27b-SP和miR-27b靶向序列（miR-27b-TS）的直接相互作用邻眷。在體外實(shí)驗(yàn)中浑吟，與對(duì)照GFP (TS-mut或SP-mut)相比，miR-27b-SP過(guò)表達(dá)以一致的方式挽救了miR-27b-TS的GFP強(qiáng)度降低(圖1C)耗溜。相應(yīng)地组力，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照組相比抖拴，miR-Act-EGFP-miR-27b-TS/miR-27b共表達(dá)降低的eGFP熒光強(qiáng)度可以以miR-27b-27b劑量依賴的方式挽救（圖1D）燎字。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明阿宅，miR-27b-SP可以特異性抑制miR-27b的表達(dá)候衍，并通過(guò)消除miR-27b的表達(dá)來(lái)隔離miR-27b在其靶基因上的活性。

圖1 miR-27b-海綿（miR27b-SP）的設(shè)計(jì)和驗(yàn)證洒放。（A）序列比對(duì)表明成熟miR-27b在許多物種中都是完全保守的蛉鹿，包括樹(shù)棲蜥蜴（aca-miR-27b）、田鼠（cgr-miR-27b）往湿、家山羊（chi-miR-27b）妖异、斑馬魚(yú)（dre-miR-27b）、紅原雞（gga-miR-27b）领追、人（hsa-miR-27b）他膳、灰色短尾負(fù)鼠（mdo-miR-27b）、恒河猴（mml-miR-27b）绒窑、小鼠（mmu-miR-27b）棕孙、鴨嘴獸（oan-miR-27b）、眼鏡蛇（oha-miR-27b）些膨、七鰓鰻（pma-miR-27b）蟀俊、大鼠（rno-miR-27b）、大西洋鮭魚(yú)（ssa-miR-27b)订雾、野豬（ssc-miR-27b）和中國(guó)樹(shù)鼩（tch-miR-27b)肢预。（B）將pri-miR-27b和miR27b-SP轉(zhuǎn)化為b-Act表達(dá)載體。premiR-27b莖環(huán)結(jié)構(gòu)顯示葬燎，其中成熟的miR-27b用紅色突出顯示误甚。(C)采用體外EGFP報(bào)告基因分析來(lái)確認(rèn)miR-27b與靶序列之間的直接相互作用缚甩。用b-Act-miR-27b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ZFL、ZEM2S和SOB-15細(xì)胞窑邦，并測(cè)定EGFP強(qiáng)度擅威。* p < 0.01，和** p < 0.005冈钦。(D)采用體內(nèi)EGFP報(bào)告基因分析郊丛，證實(shí)了miR-27b在受精后6天內(nèi)的miR-27b與目標(biāo)序列之間的直接相互作用。

轉(zhuǎn)基因C27bSPs（bC27bSP1瞧筛、2和hC27bSP1厉熟、2）斑馬魚(yú)品系的生成

為了在斑馬魚(yú)中產(chǎn)生穩(wěn)定的mcherry融合miR-27b-SP表達(dá)，我們使用pb-Act-mCherry-miR-27b-SP和LF2.8-mCherry-miR-27b-SP構(gòu)建物來(lái)產(chǎn)生傳遞生殖系的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)株系C27bSPs（圖2A）较幌。通過(guò)pb-Act-mCherry-miR-27b-SP構(gòu)建揍瑟，生成了斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因株系bC27bSPs（Tg（-2.5β-Act：mCherry-miR-27b-SP）），其中miR-27b的表達(dá)被全局消除（圖2B乍炉，面板1,2）绢片。利用LF2.8-mCherry-miR-27b-SP構(gòu)建，我們生成了斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因株系hC27bSPs（Tg（-2.8fabp10a：mCherry-miR-27b-SP））岛琼，其中miR-27b在肝臟中被特異性消除（圖2B底循，面板3,4）。

我們采用莖環(huán)RT-PCR方法檢測(cè)成熟miR-27b在bC27bsp和hC27bsp中的表達(dá)水平槐瑞。根據(jù)miR-27b的表達(dá)熙涤，選擇2個(gè)bC27bSP（bC27bSP1和bC27bSP2）和2個(gè)hC27bSP（hC27bSP1和hC27bSP2）轉(zhuǎn)基因株系（圖2C）。與野生型對(duì)照相比困檩，miR-27b在hC27bSP1和hC27bSP2細(xì)胞系的肝臟中分別顯著下調(diào)了15.4倍和7.8倍祠挫。此外，我們還證明窗看，與野生型（WT）相比茸歧，肝臟過(guò)表達(dá)miR-27b-SP并沒(méi)有改變hC27bsp中其他組織中內(nèi)源性成熟miR-27b的水平（圖2C）。在bC27bSP1和bC27bSP2細(xì)胞系的肝臟中显沈，肝臟成熟的miR-27b分別減少了近3.8倍和2.9倍。然而逢唤，與WT相比拉讯，bC27bSPs中其他組織的成熟miR-27b水平顯著降低（圖2C）。結(jié)果表明鳖藕，miR-27b-SP能夠阻斷體內(nèi)miR-27b的表達(dá)魔慷。

圖2 miR27b-SP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)產(chǎn)生。(A)將pri-miR-27b和miR27b-SP克隆到LF2.8或b-Act表達(dá)載體中著恩。(B)miR27b-SP在bC27bSP1全身表達(dá)的紅色熒光圖像（面板1,9 dpf院尔，40×放大蜻展，比例尺200μm；面板2邀摆，受精后4個(gè)月（mpf）纵顾，40×放大，比例尺100 mm）和hC27bSP1肝臟（3,9 dpf栋盹；4,4 mpf施逾，40×放大，比例尺：100 mm）例获。(C)對(duì)bC7asp（bC27bSP1汉额、2）和hC7asp（hC27bSP1、2）榨汤、肝臟蠕搜、心臟、腸道收壕、大腦妓灌、眼睛、脂肪和肌肉組織成熟miR-27b的莖環(huán)RT-qPCR分析啼器。每組均為n=5-8旬渠。* p < 0.01，和** p < 0.005端壳。

抑制內(nèi)源性miR-27b可增加體內(nèi)和血管內(nèi)脂質(zhì)積累

為了檢測(cè)hC27bSPs告丢、bC27bSPs和WT幼魚(yú)之間的中性脂質(zhì)，我們對(duì)受精后10d（dpf）幼魚(yú)進(jìn)行了油紅O染色（圖3）损谦。在WT幼魚(yú)中沒(méi)有檢測(cè)到油紅O信號(hào)（圖3A岖免、A’、A’’）照捡，盡管它確實(shí)對(duì)膀胱進(jìn)行了非特異性染色（圖3A’）颅湘。hC27bSPs的幼魚(yú)僅在肝臟中表現(xiàn)出強(qiáng)烈的染色（圖3B、B’栗精、C闯参、C’）。飼喂高脂飲食（HFD）的bC27bSPs幼魚(yú)在肝臟（圖3D’悲立、E’）鹿寨、大腦和心臟（圖3D’、E’）中均有中度染色薪夕，在血管系統(tǒng)中也有額外的染色脚草，包括后主脈、背主動(dòng)脈和節(jié)段間血管（圖3D’’原献、E’’）馏慨。

重要的是埂淮，hC27bSPs中的體內(nèi)和血管內(nèi)脂質(zhì)積累（78?86%）和肝臟脂質(zhì)積累（77?81%）的發(fā)生率要高得多，而WT幼魚(yú)中肝臟脂質(zhì)積累僅為1.4?5.3%写隶，血管內(nèi)脂質(zhì)積累為4.4%（圖3F）倔撞。這些數(shù)據(jù)表明，miR-27b的消耗可誘導(dǎo)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的體內(nèi)和血管內(nèi)脂質(zhì)積累樟澜。

圖3 通過(guò)Oil Red O（ORO）染色误窖，miR27b-SP對(duì)hC27bsp和bC7aSPs肝臟和血管內(nèi)脂質(zhì)的影響。（A-E）用高脂飼料（HFD）喂養(yǎng)的代表性幼魚(yú)的全貼裝ORO染色的側(cè)視圖（40×放大秩贰，比例尺：200μm）霹俺。軀干和后部的放大顯示在面板0和00（110×放大，比例尺：100μm）毒费。(F)通過(guò)ORO染色計(jì)算hC27bSPs和bC27bSPs幼魚(yú)中脂肪變性和血管內(nèi)脂質(zhì)的百分比丙唧。ORO染色重復(fù)進(jìn)行三次，平均每組60-80只幼魚(yú)觅玻。星號(hào)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義想际；* p < 0.01，** p < 0.005溪厘『荆縮寫：e、眼畸悬、背主動(dòng)脈侧甫、視網(wǎng)膜，背縱向吻合血管蹋宦、心臟披粟、腸、節(jié)段間血管冷冗、PCV守屉，后主靜脈，膀胱蒿辙，卵黃囊拇泛。

miR-27b缺失增加了C27bsp中與脂肪生成相關(guān)的基因的表達(dá)

由于miR-27b缺失可誘導(dǎo)斑馬魚(yú)的內(nèi)營(yíng)養(yǎng)和血管內(nèi)脂質(zhì)積累和肝脂肪變性，我們接下來(lái)研究了miR-27b缺失對(duì)脂肪生成和未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）靶基因表達(dá)的影響思灌。和對(duì)照組相比脂肪酸（FA）膜轉(zhuǎn)運(yùn)體的mRNA水平顯著上調(diào)碰镜，包括脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（FATPs），如slc25a10和slc35b4习瑰，脂肪酸結(jié)合蛋白（FABPs）如bC27bSPs和hC27bSPs中的FABP6和脂肪酸轉(zhuǎn)位酶FAT/CD36（圖4A)。脂質(zhì)存儲(chǔ)基因的mRNA水平升高秽荤，包括ACAT-2甜奄、LDL受體LDLR和LPIN1（圖4B）柠横。許多參與肝臟脂肪生成的基因受到甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1c（SREBP-1c）的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，包括過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）和CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-α（C/EBP-α）课兄，它們被發(fā)現(xiàn)上調(diào)（圖4C）牍氛。參與脂肪酸合成的關(guān)鍵脂肪生成酶的mRNA水平顯著升高，包括乙酰輔酶a羧化酶1（ACC1）烟阐、脂肪酸合酶（FAS）搬俊、A酰基輔酶A合酶（ACS）蜒茄、醢蓿基輔酶a：酰基轉(zhuǎn)移酶1-跆锤穑基甘油-sn-3-磷酸跬嫠睿基轉(zhuǎn)移酶（AGAPT）、磷脂酸磷酸酶（PAP）和二跤炝基甘油O-蹩赵基轉(zhuǎn)移酶2（DGAT2）（圖4D）。與對(duì)照組（WT和WT-liver）相比润讥，所有標(biāo)記物在bC27?和hC27?的肝臟中均顯著且高上調(diào)转锈。這些結(jié)果表明，bC27bsp和hC27bsp中的脂質(zhì)積累是脂質(zhì)生物發(fā)生相關(guān)基因上調(diào)的結(jié)果楚殿。

圖4 對(duì)bC27bSPs幼魚(yú)和hC27bSPs幼魚(yú)肝臟中選定的成脂基因的RT-qPCR分析撮慨。C27bSPs中脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)(A)脂質(zhì)儲(chǔ)存(B)、脂肪生成因子(C)和脂肪生成酶(D)基因的相對(duì)mRNA表達(dá)量與野生型魚(yú)的基因表達(dá)量相比較勒魔。qRT-PCR進(jìn)行三次重復(fù)甫煞。用每組平均4個(gè)月雄雌魚(yú)的cDNA對(duì)所選基因進(jìn)行表達(dá)分析。數(shù)值與β-actin進(jìn)行歸一化處理冠绢。星號(hào)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義抚吠；與對(duì)照組相比，* p < 0 .01弟胀，** p < 0.005水平楷力。

hC27bSP成魚(yú)發(fā)展為NAFLD并最終發(fā)展為NASH

我們懷疑C27bSPs幼魚(yú)（<60 dpf）在早期出現(xiàn)NAFLD表型。與預(yù)期的一樣孵户，飼喂低脂飲食（LFD）的C27bSPs幼魚(yú)（21 dpf）出現(xiàn)了明顯的肝臟脂肪變性萧朝，而飼喂相同飲食的WT幼魚(yú)沒(méi)有出現(xiàn)脂質(zhì)沉積（圖5A，面板1?5）夏哭。組織學(xué)分析顯示检柬，WT中均勻的肝竇和肝細(xì)胞顯示完好的細(xì)胞質(zhì)和明顯的細(xì)胞核（圖5A，圖6）竖配，幼年C27bsp的肝臟切片顯示肝細(xì)胞質(zhì)中有不同程度的空泡化（圖5A何址，圖7?10）里逆。宏觀上看，WT成年肝臟在受精后4.5個(gè)月（mpf）顏色正常用爪、柔軟和樂(lè)觀（圖5A原押，面板11），而大約80%的4.5 mpf C27bsp魚(yú)顯示黃色和油膩的肝臟偎血，這是典型的斑馬魚(yú)脂肪肝（圖5A诸衔，面板12?15）。Oil Red O染色進(jìn)一步證實(shí)了脂肪肝結(jié)果颇玷，結(jié)果顯示笨农，與成年WT相比，成年c27bps的肝組織中有囊泡狀脂肪變性和大量脂滴（圖5A亚隙，圖17?20）（圖5A磁餐，圖16）。此外阿弃，我們還觀察到肝脂質(zhì)（與WT相比诊霹，hC27bSP1、hC27bSP2渣淳、bC27bSP1和bC27bSP2的含量分別為5.8-脾还、4.9-、3.2-和2.8倍）和膽固醇與WT相比入愧，hC27bSP1鄙漏、hC27bSP2、bC27bSP1和bC27bSP2的含量分別為3.1-棺蛛、2.6-怔蚌、2.1-和1.8倍）顯著增加（圖5B)。然而旁赊，與hC27bsp和WT相比桦踊，bC27bsp的血脂和膽固醇水平僅稍微升高（圖5B）。

在成年hC27bsp（年齡大于10 mpf）中终畅，肝細(xì)胞內(nèi)的慢性脂質(zhì)積累進(jìn)一步引發(fā)了肝細(xì)胞損傷和肝應(yīng)激籍胯，這與之前觀察到的NASH樣表型一致（圖5C，面板3?6）离福，并與WT進(jìn)行了比較（圖5C杖狼，面板1、2）妖爷。我們發(fā)現(xiàn)蝶涩，氧化應(yīng)激顯著增加了hC27bSPs和bC27bSPs中肝臟MDA和過(guò)氧化氫的釋放；然而，在喂食LFD的WT肝臟中沒(méi)有或更少觀察到氧化應(yīng)激的影響（圖5D）子寓，表明miR-27b消耗可以顯著增強(qiáng)斑馬魚(yú)肝臟的氧化應(yīng)激暗挑。此外，對(duì)hC27bSP2 NASH肝臟的分子分析顯示斜友，參與NASH發(fā)育的基因表達(dá)上調(diào)。與預(yù)期的一樣垃它，與WT相比鲜屏，hC27bSPs成魚(yú)炎癥基因il-1b、il-6国拇、tnf-α洛史、ifn-γ、nfkb2和nf-kb的表達(dá)增加（圖5E）酱吝。此外也殖，hC7aSPs成魚(yú)還表現(xiàn)出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激標(biāo)志物atf6、ern2务热、ire1忆嗜、prek、hspa5和ddit3的上調(diào)（圖5E）崎岂。這些結(jié)果表明捆毫，hC27bsp成人發(fā)生了NAFLD和NASH，這是由于肝臟中脂肪的積累冲甘，并伴隨著隨后的炎癥和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的激活绩卤。

圖5 在hC27bsp和bC27bsp成人中觀察到NAFLD和NASH表型。(A)不同喂養(yǎng)量和脂質(zhì)含量下C27bSPs幼魚(yú)的肝臟組織學(xué)變化江醇。用低脂飼料（LFD）喂養(yǎng)的C27bSPs幼魚(yú)肝臟中WT（圖1）濒憋、hC7aSPs（圖2和3）和bC7aSPs（圖4和5）的ORO染色。110倍放大陶夜，比例尺：100μm凛驮。用LFD喂養(yǎng)WT（圖6）、hC7aSPs（圖7和圖8）和bC7aSPs（圖9和圖10）的斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝臟的組織學(xué)變化律适，400×放大辐烂，比例尺：10μm。4個(gè)月大的WT（11）捂贿、hC7aSP（12和13）和bC7aSP（14和15）成人肝臟的代表性大體解剖纠修。40×的放大倍數(shù)，比例尺：50毫米厂僧。通過(guò)成年WT（16）扣草、hC7aSP（17和18）和bC7aSP（19和20）的oro染色切片證實(shí)了脂質(zhì)積累。400×的放大倍數(shù)，比例尺：25μm辰妙。(B)11個(gè)月大的hC27bsp和bC27bsp成人的脂質(zhì)含量（肝臟和血清甘油三酯和膽固醇）的比較鹰祸。（每組n=4-6）。* p < 0.01密浑，和** p < 0.005蛙婴。(C)11個(gè)月大的WT(1)、hC27bSP1(3)和hC27bSP2(5)肝臟的代表性大體解剖圖像尔破。40×的放大倍數(shù)街图，比例尺：50毫米。對(duì)11個(gè)月大的WT(2)懒构、hC7aSP1(4)和hC7aSP2(6)肝臟進(jìn)行H&E染色餐济，顯示與WT相比，hC27bSPs誘導(dǎo)肝臟應(yīng)激和損傷胆剧。400×的放大倍數(shù)絮姆，比例尺：50μm。將肝臟線粒體中MDA和過(guò)氧化氫的(D)水平與hC27秩霍、WT成人bC27和過(guò)氧化氫水平進(jìn)行比較篙悯。(E)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激標(biāo)志物atf6、ern2前域、ire1辕近、prek、hspa5匿垄、grp78和ddit3（上升）和炎癥基因il-1b移宅、il-6、tnf-α椿疗、ifn-γ漏峰、nfkb2和NF-kB的表達(dá)增加（下降）。qrt-pcr一式3份届榄。用每組平均4個(gè)月雄雌魚(yú)的cDNA對(duì)所選基因進(jìn)行表達(dá)分析浅乔。數(shù)值與β-actin進(jìn)行歸一化處理。星號(hào)表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義铝条。與對(duì)照組相比靖苇，* p < 0 .01，** p < 0.005水平班缰。

miR-27b缺失可誘導(dǎo)斑馬魚(yú)早期發(fā)生脂肪細(xì)胞增生

為了評(píng)估m(xù)iR-27b在斑馬魚(yú)早期脂肪形成中的重要性贤壁，我們分析了同一階段飼喂LFD或HFD的bC27bSPs和WT幼魚(yú)（圖6A，B）埠忘。與野生型相比脾拆，在幼魚(yú)發(fā)育過(guò)程中馒索，bc27bsp7魚(yú)體重和長(zhǎng)度均顯著增加（圖6C，D）名船。此外绰上，我們還比較了在24 dpf時(shí)油紅o染色的內(nèi)臟脂肪細(xì)胞的大小。我們檢測(cè)到渠驼，與野生型斑馬魚(yú)相比蜈块，bC27bSPs中內(nèi)臟脂肪細(xì)胞的質(zhì)量增加了（圖6E），而含有內(nèi)臟脂肪細(xì)胞增生的斑馬魚(yú)幼魚(yú)的百分比也增加了（圖6F）渴邦。因此疯趟，miR-27b缺失導(dǎo)致斑馬魚(yú)幼魚(yú)內(nèi)臟脂肪細(xì)胞增生，暗示miR-27b表達(dá)對(duì)斑馬魚(yú)胚胎后生長(zhǎng)和幼魚(yú)脂肪細(xì)胞形成的影響谋梭。

圖6 miR-27b缺失導(dǎo)致bC27bSPs幼魚(yú)生長(zhǎng)和脂肪細(xì)胞形成的增強(qiáng)。(A)bC7aSPs和WT幼魚(yú)的代表性圖像倦青，喂養(yǎng)HFD和(B)喂養(yǎng)LFD瓮床，40×放大，比例尺：200μm产镐。(C)飼喂LFD或HFD的bC27bSPs和WT幼魚(yú)的平均體重（每組n=為40-50）隘庄。* p < 0.01，和** p < 0.005癣亚。(D)飼喂LFD或HFD的bC27bsp和WT幼魚(yú)的平均體長(zhǎng)（每組n=為40-50）丑掺。* p < 0.01，和** p < 0.005述雾。(E)與WT對(duì)照組相比街州，在24 dpf時(shí)，bC27bSPs中的oro染色的內(nèi)臟脂肪細(xì)胞玻孟。內(nèi)臟脂肪細(xì)胞被圈起來(lái)唆缴。110×的放大倍數(shù)，比例尺：200μm黍翎。(F)含有內(nèi)臟脂肪細(xì)胞增生的bC27bsp和WT幼魚(yú)的百分比（每組n=40-50）面徽。* p < 0.01，和** p < 0.005匣掸。

成年bC27bsp體積大趟紊，白色脂肪組織質(zhì)量增加

為了確定miR-27b缺失是否可能在脂肪組織中具有功能相關(guān)性，我們檢測(cè)了成年bC27bsp白色脂肪組織（WAT）表型碰酝，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)肥胖或超重有肥大反應(yīng)霎匈。在四個(gè)月的時(shí)間里，我們發(fā)現(xiàn)bC27bsp對(duì)被喂食HFD有顯著的尖銳反應(yīng)砰粹。與生長(zhǎng)曲線一致唧躲，bC27bSPs成魚(yú)的體重在5個(gè)月內(nèi)顯著增加（圖7A）造挽。比喂食HFD的bC27bSP1成魚(yú)豐滿且更大（圖7B）。從大體觀察(圖7C弄痹，左)饭入、內(nèi)臟大小(圖7C，中)和脂肪庫(kù)外植體(圖7C肛真，右)可以看出谐丢，飲食引起的體重增加伴隨著脂肪積累的顯著增加。此外蚓让，我們還研究了miR-27b-SP是否能調(diào)節(jié)伴隨脂肪形成的bC27bsp的WAT中的肥大乾忱。肥大的WAT伴隨著成脂轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)增加，包括PPAR-γ历极、C/EBP-α和SREBP-1c（圖7D）窄瘟。這些結(jié)果表明，miR-27b的缺失通過(guò)上調(diào)參與脂肪形成的成脂轉(zhuǎn)錄因子趟卸，加速了斑馬魚(yú)的脂肪細(xì)胞分化蹄葱。

圖7 miR-27b消耗誘導(dǎo)成人bC7aSPs的體重增加和脂肪質(zhì)量增加。(A) bC27bSPs锄列、hC27bSPs和WT用HFD喂養(yǎng)210天图云。每月監(jiān)測(cè)每只斑馬魚(yú)的連續(xù)體重（n=20-25）。* p < 0.01邻邮，和** p < 0.005竣况。(B)男性和女性bC27bSP1和WT喂養(yǎng)HFD 5個(gè)月的代表性圖像。(C) miR-27b消耗導(dǎo)致更大的腹部脂肪（左）筒严，更大的內(nèi)臟器官（中）和腹部脂肪墊大小的增加（右）丹泉。脂肪組織被圈起來(lái)。40×放大萝风，比例尺：25mm(D)嘀掸，WT和bC27bSP1腹部脂肪中成脂基因和蛋白的表達(dá)。PPAR-γ规惰、C/EBP-β和SREBP-25pxRNA（左睬塌，qRT-PCR）和蛋白質(zhì)（右，免疫印跡）歇万。* p < 0.01揩晴，和** p < 0.05。

討論

microRNA miR-27b參與了許多代謝過(guò)程贪磺，這些代謝過(guò)程與多種疾病有關(guān)硫兰，包括脂質(zhì)代謝、動(dòng)脈粥樣硬化寒锚、胰島素抵抗和2型糖尿病劫映。盡管其重要违孝，但很少有功能驗(yàn)證的相關(guān)代謝模型，也缺乏體內(nèi)研究泳赋。在本研究中雌桑，我們發(fā)現(xiàn)miR-27b在斑馬魚(yú)的脂肪細(xì)胞發(fā)生和脂肪生成中均具有負(fù)調(diào)控因子。我們報(bào)道了一個(gè)新的發(fā)現(xiàn)祖今，即miR-27b缺失導(dǎo)致內(nèi)營(yíng)養(yǎng)和血管內(nèi)脂質(zhì)積累和高脂血癥校坑，以及幾種脂肪生成標(biāo)志物基因的表達(dá)增加。在斑馬魚(yú)千诬。最近的報(bào)道已經(jīng)確定miR-27b是脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)樞紐耍目，并有許多證實(shí)。Vickers等人預(yù)測(cè)miR-27b是脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)樞紐徐绑。他們證明邪驮，肝臟miR-27b對(duì)脂質(zhì)水平敏感，并調(diào)節(jié)兩個(gè)關(guān)鍵代謝基因的表達(dá)傲茄，血管生成素樣3（ANGPTL3）和甘油-3-磷酸醺蹋基轉(zhuǎn)移酶1（GPAM），這兩個(gè)基因之前已經(jīng)涉及到血脂異常病理烫幕。此外，我們還發(fā)現(xiàn)C27bSPs中的脂質(zhì)積累是由于參與FFA合成途徑的基因上調(diào)敞映，導(dǎo)致后來(lái)的發(fā)病率伴隨不同水平的肝脂肪變性较曼。我們的研究結(jié)果表明，miR-27b在體內(nèi)表達(dá)的脂質(zhì)代謝途徑平行振愿，而在哺乳動(dòng)物和斑馬魚(yú)中捷犹，miR-27b介導(dǎo)的調(diào)控的脂質(zhì)代謝具有很強(qiáng)的相似性。

為了更清楚地定義內(nèi)源性miR-27b在肝臟反應(yīng)中的生理作用冕末，我們建立了一個(gè)肝臟特異性的miR-27b-SP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型萍歉，hC27bSPs。值得注意的是档桃，hC27bSPs在幼魚(yú)期發(fā)生生理NAFLD枪孩，在成魚(yú)期發(fā)生NASH。我們的研究結(jié)果與最近的一項(xiàng)研究一致藻肄，表明抑制miR-27b可以恢復(fù)大鼠肝星狀細(xì)胞（HSCs）中的細(xì)胞質(zhì)脂滴蔑舞。Vickers等人報(bào)道，miR-27b被特異性發(fā)現(xiàn)參與肝臟中的脂質(zhì)代謝嘹屯，并發(fā)現(xiàn)與正常小鼠肝臟相比攻询，miR-27b在HFD肝臟中顯著增加。他們將miR-27b模擬物或抑制劑（antagomiRs）引入人肝細(xì)胞（Huh7細(xì)胞）州弟。miR-27b模擬物的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致4個(gè)脂肪生成基因PPAR- γ钧栖、ANGPTL3低零、N-去乙酰化酶/磺基轉(zhuǎn)移酶1（NDST1）和GPAM的表達(dá)顯著增加拯杠，而內(nèi)源性miR-27b的抑制顯著上調(diào)了相同的4個(gè)基因掏婶。Vacaru等人，證明斑馬魚(yú)肝脂肪變性與UPR激活的標(biāo)志物相關(guān)阴挣，而強(qiáng)大的UPR誘導(dǎo)脂肪變性气堕。此外，一種miR-27a/b抑制劑顯著增加了促炎因子產(chǎn)生畔咧，如IL-1β茎芭、IL-6、MCP-1和TNF-α誓沸。相反梅桩，用miR-27a/b模擬物處理細(xì)胞后，炎癥反應(yīng)降低拜隧。相應(yīng)地宿百，我們提供了證據(jù)，表明肝臟中miR-27b的消耗導(dǎo)致了肝臟脂肪變性和脂肪變性洪添，甚至脂肪性肝炎的發(fā)展垦页，這對(duì)炎癥反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有進(jìn)一步的聯(lián)合作用。

一些miRNAs干奢，包括miR-27痊焊，已經(jīng)參與了加速或抑制前脂肪細(xì)胞分化的過(guò)程。最近忿峻，來(lái)自三個(gè)研究小組的研究結(jié)果表明薄啥，miR-27b是脂肪細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控因子。Zou等報(bào)道逛尚，柿子單寧在脂肪形成早期通過(guò)調(diào)控PPAR-γ垄惧、C/EBP-α和miR-27來(lái)抑制3T3-L1細(xì)胞的脂肪細(xì)胞分化。Karbiener等人發(fā)現(xiàn)绰寞，miR-27b在hMADS細(xì)胞中的抗成脂作用是由于抑制了PPAR-γ所致到逊。Kang等人證實(shí)，miR-27a和b通過(guò)靶向PHB和損害hMADS細(xì)胞中的線粒體生物發(fā)生和功能來(lái)抑制脂肪形成克握。研究表明蕾管，miR-27b消耗對(duì)HFD誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞增生敏感，這至少部分解釋了bC27bSPs的體重增加或肥胖菩暗，表明bC27bSPs可作為早發(fā)性體重增加的模型掰曾。bC27bsp在幼魚(yú)期生長(zhǎng)迅速（10?21dpf），導(dǎo)致幼魚(yú)期體重和長(zhǎng)度增加停团。體重增加可能是早期生命脂質(zhì)積累引起的生長(zhǎng)“超前”的結(jié)果旷坦，可能與脂質(zhì)代謝損傷和能量消耗不足狀態(tài)有關(guān)掏熬，從而影響斑馬魚(yú)胚胎后的生長(zhǎng)。

根據(jù)外觀和脂肪庫(kù)的檢查秒梅，與對(duì)照組相比旗芬，幼魚(yú)bC27bSPs的脂肪量略有增加，而bC27bSPs的年輕成魚(yú)的脂肪量顯著增加捆蜀。這種效應(yīng)在成人中顯著增加的事實(shí)表明疮丛，bC27bsp對(duì)與年齡相關(guān)的體重增加很敏感。此外辆它，我們的研究結(jié)果表明誊薄，bC27bsp中脂肪質(zhì)量的增加是由細(xì)胞數(shù)量的增加（脂肪細(xì)胞的增生）引起的。相應(yīng)地锰茉，miR-27抑制脂肪細(xì)胞分化呢蔫，這與肥胖的發(fā)生密切相關(guān)。miR-27b在大鼠飒筑、小鼠和人類細(xì)胞模型中作為脂肪形成的負(fù)調(diào)控因子片吊。Chan等人報(bào)道，人參皂苷-Rb1可以下調(diào)miR-27b的活性协屡，進(jìn)而促進(jìn)PPAR-γ的表達(dá)和脂肪的形成俏脊。然而，miR-27b已被發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)脂肪的形成肤晓。Kong等人發(fā)現(xiàn)联予，miR-27b是Prdm16的中心上游調(diào)控因子，可以控制WAT的褐變材原。白色脂肪的“布朗寧”已經(jīng)成為目前持續(xù)對(duì)抗肥胖的焦點(diǎn)。因此季眷，靶向miR-27b可能會(huì)促進(jìn)由WAT轉(zhuǎn)化為棕色脂肪組織（BAT）介導(dǎo)的能量消耗余蟹，并有可能預(yù)防肥胖。雖然成年斑馬魚(yú)的脂肪組織已被描述子刮，其生理和形態(tài)與哺乳動(dòng)物相似已被證實(shí)為威酒，但對(duì)斑馬魚(yú)BAT的發(fā)育知之甚少。我們的體內(nèi)觀察表明挺峡，在bC27bSP1的脂肪細(xì)胞終末分化過(guò)程中葵孤，miR-27b缺失通過(guò)誘導(dǎo)PPAR-γ、C/EBP-α和SREBP-1c而導(dǎo)致脂肪細(xì)胞增生橱赠。我們的結(jié)果表明尤仍，bC27bSPs中脂肪體積的增加是由于脂肪生成的增加。我們假設(shè)miR-27b可能比燃料代謝更介調(diào)節(jié)脂肪積累狭姨，通過(guò)能量消耗抑制脂肪組織宰啦。這一發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了miR-27b功能等值對(duì)斑馬魚(yú)脂肪組織的潛在重要性苏遥，這也被證明與斑馬魚(yú)的一般發(fā)育和大小密切相關(guān)。

總之赡模，我們的研究結(jié)果表明田炭，miR-27b的慢性消耗會(huì)導(dǎo)致總脂質(zhì)含量的增加，從而導(dǎo)致斑馬魚(yú)中高脂血癥和NAFLD表型的早期發(fā)病漓柑。miR-27b的慢性消耗會(huì)導(dǎo)致脂肪形成增加教硫，進(jìn)而導(dǎo)致脂肪形成（斑馬魚(yú)的脂肪細(xì)胞增生）和斑馬魚(yú)體重增加。所提出的幼年C27bSP模型顯示了病理狀態(tài)的改變辆布，如肝脂肪變性瞬矩，更多的是，脂肪性肝炎和高脂血癥谚殊。具有傳染性nash樣和肥胖表型（不同水平的嚴(yán)重肝脂肪變性和脂肪質(zhì)量）的老年C27bsp是研究人類代謝性疾病的理想模型丧鸯，如高甘油三酯血癥、肥胖和糖尿病嫩絮。

原文網(wǎng)址：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29286302/

注：因文章篇幅有限丛肢，所有相關(guān)引用文獻(xiàn)，以及補(bǔ)充圖剿干、表可以點(diǎn)擊至原文查閱蜂怎。