雜志：Atherosclerosis

影響因子：5.3（2023）

年份：2022

通訊作者：Chun Liang，Qing Jing

通訊作者單位：Department of Cardiology, Changzheng Hospital, Shanghai, 200003, China庇茫；

摘要

背景和目的：ApoEb是斑馬魚中與哺乳動物ApoE同源的一種港粱，缺乏ApoE會導(dǎo)致動脈粥樣硬化等脂質(zhì)代謝紊亂(LMDs)。我們嘗試敲除斑馬魚ApoEb旦签，然后建立LMD斑馬魚模型查坪。

方法：利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除ApoEb，并通過油紅O染色宁炫、共聚焦成像和脂質(zhì)測量證實(shí)脂質(zhì)蓄積偿曙。通過斑馬魚幼魚活體成像，我們評估了辛伐他汀(SIM)羔巢、依折麥布(EZE)和血脂康(XZK)的降脂作用望忆。

結(jié)果：在ApoEb突變體中，血管發(fā)生了顯著的脂質(zhì)沉積竿秆，在幼魚和成體血漿的全身勻漿中進(jìn)行的脂質(zhì)測定顯示脂質(zhì)水平顯著升高启摄。SIM、EZE和XZK明顯緩解ApoEb突變體的高脂血癥幽钢，XZK對中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的募集有顯著的抑制作用歉备。

結(jié)論：本研究在ApoEb突變斑馬魚中建立了LMD模型。我們認(rèn)為這一多功能模型可用于研究高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化早期相關(guān)的血管病理匪燕，以及ApoE的生理功能蕾羊。

關(guān)鍵詞：高脂血癥、動脈粥樣硬化谎懦、載脂蛋白肚豺、ApoEb溃斋、血脂康界拦、斑馬魚。

前言

載脂蛋白E (ApoE)是一種主要表達(dá)于哺乳動物肝臟的載脂蛋白梗劫。它在脂質(zhì)代謝享甸，特別是極低密度脂蛋白(vldl)、膽固醇和高密度脂蛋白(hdl)的代謝中起著至關(guān)重要的作用梳侨。ApoE與心血管疾病(如高脂血癥和缺血性心臟病)風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系已通過大量流行病學(xué)觀察和遺傳學(xué)研究以及干預(yù)性臨床試驗(yàn)被發(fā)現(xiàn)蛉威。大約一半的血漿ApoE與富含甘油三酯的脂蛋白有關(guān)，其中ApoE是低密度脂蛋白受體(LDLR)和LDLR相關(guān)蛋白(LRP)的主要配體走哺。既往研究發(fā)現(xiàn)蚯嫌，甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)調(diào)控LDLR及其他參與膽固醇生物合成的蛋白如羥-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)、脂肪酸合成酶(FASN)、蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草素/酮蛋白9型(PCSK9)的表達(dá)择示。

針對各種途徑的降脂藥物已經(jīng)成功地幫助人類控制高脂血癥束凑。辛伐他汀(Simvastatin, SIM)是針對Ldlr表達(dá)的主要藥物之一，能夠有效降低LDL-C栅盲，減少人類心血管疾病的發(fā)病率汪诉。血脂康(XZK)是從紅曲米中提取的一種常用中藥。在國內(nèi)外的臨床試驗(yàn)中均顯示出強(qiáng)大的降脂效果谈秫。盡管XZK被廣泛使用扒寄，但其藥理和毒理學(xué)作用仍未完全闡明。

雖然發(fā)明了各種降脂藥物拟烫，但家族性高膽固醇血癥(FH)患者對這些藥物并不敏感该编，因此新的降脂藥物仍有待開發(fā)，有效的動物模型至關(guān)重要构灸。但是上渴，使用ApoE-/-小鼠進(jìn)行藥物篩選和高脂血癥相關(guān)研究的過程是比較昂貴、耗時的喜颁。斑馬魚作為一種新型的模式動物稠氮，具有胚胎透明、后代數(shù)量多半开、維護(hù)成本低等優(yōu)點(diǎn)隔披。更重要的是，人類和斑馬魚之間的基因具有相對較高的保守性寂拆，包括編碼載脂蛋白家族成員的基因奢米，如ApoA家族、ApoB纠永、ApoC2和Ldlr鬓长。為了深入研究FH等脂質(zhì)代謝紊亂(LMDs)，近年來建立了相應(yīng)基因突變的斑馬魚品系尝江。已知的FH的主要原因是Ldlr涉波、ApoB(編碼載脂蛋白B的基因)和Pcsk9以及ApoE的致病變異。其中Ldlr炭序、ApoB和Pcsk9突變斑馬魚系近年來已建立啤覆，但FH的病理生理機(jī)制尚不明確。為研究FH及相關(guān)cvd的發(fā)生發(fā)展提供一個不同的視角惭聂，本研究采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除斑馬魚ApoEb基因的表達(dá)窗声，隨后進(jìn)行短時間高脂飲食(HFD)喂養(yǎng)，建立了一種新型斑馬魚LMD模型辜纲。利用這一疾病模型误堡，我們對XZK預(yù)防LMDs的機(jī)制進(jìn)行了初步研究。本研究為今后高脂血癥十籍、FH等LMDs的病理生理學(xué)研究以及降脂藥物的藥理和毒理學(xué)研究開辟了新的途徑。

材料和方法

野生型(Tuebingen)揩魂、Tg (fli1: EGFP)、Tg (ccl2:mCherry)和Tg (flk1:dsRed;lyz: EGFP)斑馬魚胚胎通過體外受精和自然產(chǎn)卵獲得炮温，成魚在28℃下保持14/10小時的光/暗周期火脉，并按照描述進(jìn)行分期。在Tg (fli1: EGFP)魚線中柒啤，綠色熒光蛋白標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞倦挂。在Tg (flk1:dsRed;lyz: EGFP)幼魚，紅色熒光蛋白標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞担巩，綠色熒光蛋白標(biāo)記中性粒細(xì)胞方援。在Tg (ccl2:mCherry)細(xì)胞系中，心肌細(xì)胞被紅色熒光蛋白標(biāo)記涛癌。為了防止胚胎發(fā)育期間的色素沉著犯戏，在培養(yǎng)水中添加0.003% 2-苯基硫脲(PTU, Sigma-Aldrich, CA, USA)。從受精后第5天(dpf)開始拳话，斑馬魚幼魚每天兩次喂食先匪，分別以正常飼料(ND)(草履蟲，來自中國斑馬魚資源中心)或高脂飼料(HFD)(上海元野弃衍，中國)呀非，其中每體重(w/w)含有4%的膽固醇和20%的甘油三酯。在藥物治療實(shí)驗(yàn)中镜盯，將辛伐他汀(Sigma-Aldrich岸裙，慕尼黑，德國)速缆、依折麥布(Selleckchem降允，上海，中國)和XZK(北京北京大學(xué)WBL生物技術(shù)有限公司艺糜，北京剧董，中國)溶解于二甲基亞砜(DMSO) (Sigma-Aldrich，慕尼黑倦踢，德國)中送滞，并與HFD充分混合侠草。根據(jù)實(shí)驗(yàn)辱挥，藥物在使用時被溶解成不同的濃度。所有處理組的DMSO終濃度均≤0.5% vol/vol (v/v)边涕。成年Tuebingen品系斑馬魚在相同環(huán)境中飼養(yǎng)晤碘，并按照描述每天喂食兩次鹵蝦(渤海褂微，濱州，中國)园爷。成年魚高脂飼料(含5% w/w膽固醇和24% w/w甘油三酯)購自中國南通營養(yǎng)集團(tuán)公司宠蚂。所有動物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)上海長征醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除ApoEb

本研究使用的gRNA質(zhì)粒和Cas9 mRNA質(zhì)粒是北京大學(xué)熊景偉博士贈送的童社。使用T7 RNA聚合酶(Ambion, TX, USA)按照制造商的說明進(jìn)行g(shù)RNAs和Cas9 mRNA的體外轉(zhuǎn)錄求厕，并通過苯酚氯仿萃取純化。選擇了兩個ApoEb基因組靶序列:5 ' - gcccagatgggaggagatggtggg -3 '和5 ' - gcccagaggaagaaccgtgtcgg -3 '扰楼，其中后3nt為CRISPR/Cas9功能所需的原間隔鄰近基序(protospacer鄰基序呀癣，PAM)。將100 pg的gRNAs和200 pg的Cas9 mRNA共注射到1至2細(xì)胞期的胚胎中弦赖∠罾福基因分型時，取成魚尾鰭部分切除蹬竖，全胚均質(zhì)沼沈。使用TransDirect動物組織PCR試劑盒(Transgen，北京币厕，中國)提取基因組DNA列另。使用Ex Taq DNA聚合酶(Takara, Tokyo, Japan)擴(kuò)增含有目標(biāo)位點(diǎn)的基因組DNA片段。用于擴(kuò)增ApoEb cDNA側(cè)面外顯子3至外顯子4的引物見補(bǔ)充表1旦装。所有引物及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Sanger測序詳細(xì)確認(rèn)基因型由中國上海Biosune有限公司提供访递。

定量RT-PCR

使用Trizol試劑(Thermo Fisher, MA, USA)從15只幼魚中分離總RNA，并使用FastQuant RT Kit (Tiangen, Beijing, China)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄同辣。采用SYBR Green Realtime PCR Master Mix (Toyobo, Osaka, Japan)進(jìn)行定量RT-PCR檢測拷姿。用于mRNA檢測的引物均列在補(bǔ)充表1中。

油紅O染色

油紅O (Oil Red O, ORO)染色采用油紅O染料(Sigma-Aldrich, Munich, Germany)對斑馬魚體內(nèi)脂質(zhì)進(jìn)行染色旱函。斑馬魚幼魚在4%多聚甲醛(生工响巢，上海，中國)中固定12 h棒妨，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(生工踪古，上海，中國)洗滌兩次券腔，然后在0.3% ORO溶液中孵育3 h伏穆。染色的幼魚在成像前用PBS沖洗。

全載免疫熒光(Wm-IF)

3dpf Tg (flk1:dsRed;lyz:EGFP)幼魚被固定在4%多聚甲醛中纷纫，并用于Wm-IF枕扫，如前所述[[17]]。使用以下抗體:抗mpo (1:20 00;兔子;Abcam)辱魁，抗mfap4 (1:20 00;兔子;Abcam)和驢抗兔IgG H&L (Alexa Fluor 647)抗體(1:20 00;Abcam)烟瞧。

成像和計(jì)數(shù)

如之前所述诗鸭，在HFD中添加1 μg/g的熒光膽固醇酯類似物yl BODIPY 576/589C11 (Invitrogen, Carlsbad, USA)，用于血管脂質(zhì)沉積的體內(nèi)可視化参滴。將Tg (fli1:EGFP)幼魚按照不同的實(shí)驗(yàn)程序用這種熒光標(biāo)記的飼料喂養(yǎng)特定的時間后强岸，將其安裝在含0.04% Tricaine的Danieu溶液中的低熔點(diǎn)瓊脂糖(Sigma-Aldrich)中，使其固定砾赔。在徠卡TCS SP5共聚焦顯微鏡下蝌箍，以400 Hz、1024 × 1024像素暴心、1.5 μm步長掃描幼魚十绑。分別使用相同參數(shù)的共聚焦顯微鏡和Leica M205熒光顯微鏡對Tg (fli1: EGFP)細(xì)胞系的血管生成進(jìn)行活體成像，同時使用Leica M205熒光顯微鏡對Tg (flk1:dsRed;lyz: EGFP)魚線酷勺。采用Image-Pro Plus 6.0軟件(Media Cybernetics, MD, USA)計(jì)數(shù)軀干連續(xù)10個節(jié)段的中性粒細(xì)胞數(shù)量本橙。使用Leica M205熒光顯微鏡拍攝Tg (ccl2: mCherry)魚線的心臟跳動圖像和影片。采用Image-Pro Plus 6.0軟件對圖像進(jìn)行測量脆诉。采用體視顯微鏡(Zeiss, Oberkochen甚亭，德國)對ORO染色和中性紅染色進(jìn)行亮視野成像。采用Image-Pro Plus 6.0軟件測量所有ORO染色或中性紅染色圖像中軀干連續(xù)5節(jié)段的積分光密度(IOD)值击胜，相對定量血管脂質(zhì)積聚或巨噬細(xì)胞募集亏狰。所有的圖像都是側(cè)位圖，前向左偶摔，背側(cè)向上暇唾，除非特別注明。

血脂水平測定

同一組15只幼魚在冰PBS中安樂死辰斋，超聲破碎勻漿策州，收集上清作為1個勻漿樣。使用總膽固醇(TC)宫仗、甘油三酯(TG)够挂、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、極低密度脂蛋白(VLDL)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)定量試劑盒(中國南京建成)藕夫，分別按照制造商的方案測定稀釋后的成蟲血漿或幼魚勻漿中的脂質(zhì)水平孽糖。

中性紅染色

每組取15只活幼魚，分別在含2.5 mg/L中性紅色染料溶液(Solarbio毅贮，北京办悟，中國)的12孔板中培養(yǎng)，由于巨噬細(xì)胞的募集滩褥，活幼魚會聚集在巨噬細(xì)胞中形成紅點(diǎn)病蛉。孵育8 h后麻醉幼魚，顯微鏡下觀察。

組織學(xué)

收集4 μm厚的成年斑馬魚石蠟切片铡恕。包含DA或PCV病變的切片分別按照先前報(bào)告的方案進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)和Masson染色。

統(tǒng)計(jì)分析

用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)評估正態(tài)性丢间。數(shù)據(jù)擬合正態(tài)分布表示為平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)探熔，而箱線圖表示偏態(tài)分布數(shù)據(jù)。使用GraphPad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析烘挫。對于正態(tài)分布數(shù)據(jù)诀艰，進(jìn)一步進(jìn)行Levene方差齊性檢驗(yàn)。當(dāng)數(shù)據(jù)符合方差齊性時饮六，采用雙尾Student's t檢驗(yàn)或單因素方差分析其垄。對于不符合方差齊性的數(shù)據(jù)，采用Mann-Whitney檢驗(yàn)卤橄、Brown-Forsythe ANOVA檢驗(yàn)或Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)绿满。對偏態(tài)分布數(shù)據(jù)進(jìn)行Mann-Whitney檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。p值均為雙側(cè)窟扑，p < 0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義喇颁。

結(jié)果

在斑馬魚中，ApoE基因有兩個類似物——ApoEa (NCBI基因ID: 553587)和ApoEb (NCBI基因ID: 30314)嚎货。盡管其與小鼠或人類ApoE的同源性不到30%(補(bǔ)充圖1A)橘霎，但ApoEb(而非ApoEa)包含一個保守區(qū)域，編碼與人類ApoE的脂蛋白受體結(jié)合區(qū)(LRR)相似的氨基酸序列殖属，其蛋白質(zhì)序列滿足血漿載脂蛋白潛在的兩性螺旋特征所描述的共同結(jié)構(gòu)特征姐叁。先前的一項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)，ApoEa的表達(dá)在魚類發(fā)育過程中逐漸減少洗显，而ApoEb的表達(dá)則增加外潜。所有這些都表明，在哺乳動物ApoE等保守功能基元中挠唆，ApoEb可能在斑馬魚的脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用橡卤。為了利用CRISPR/Cas9有效阻斷ApoEb基因的表達(dá)，我們分別針對其外顯子3和4設(shè)計(jì)了2個gRNAs(圖1A)损搬。這可能導(dǎo)致ApoEb mRNA中378個核苷酸的缺失碧库，從而導(dǎo)致相應(yīng)ApoEb蛋白中126個氨基酸(aa)的丟失和1個氨基酸的誤翻譯(圖1B)。翻譯后的截?cái)嗟鞍卓赡軙ポd脂蛋白結(jié)構(gòu)域的部分和ApoEb功能所需的LRR(圖1C)巧勤。因此嵌灰，突變體可能只有ApoEb蛋白的功能喪失。將合成的gRNA和Cas9 mRNA盡快注入受精卵細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中颅悉，獲得突變體(F0)沽瞭。F0基因組DNA的Sanger測序顯示，在幾個突變體中出現(xiàn)542個核苷酸缺失(Δ542)剩瓶，如圖1D所示驹溃。為了將這一突變攜帶到其他具有不同轉(zhuǎn)基因背景的斑馬魚品系城丧，成功誘變的F0代被飼養(yǎng)到成年，并與其他魚系雜交獲得F1代豌鹤。性成熟后亡哄，將F1雄性與F1雌性雜交，得到攜帶相同突變的F2胚胎布疙。經(jīng)過2代蚊惯，純合子ApoEb突變Tg (fl1:EGFP)， Tg (flk1:dsRed;然后篩選出lyz: EGFP)和Tg (ccl2:mCherry)系灵临。利用整合序列對正常ApoEb mRNA進(jìn)行Rt-qPCR檢測顯示截型，在5dpf ApoEb?/?突變體以及2月齡成魚的肝臟中，ApoEb mRNA水平幾乎檢測不到(圖1E)儒溉。這部分結(jié)果表明宦焦，純合子中存在不具有正常功能的ApoEb蛋白。

圖1 ApoEb敲除斑馬魚突變體的建立顿涣。(A) ApoEb位點(diǎn)gRNA靶位示意圖赶诊。設(shè)計(jì)了兩個gRNA靶點(diǎn)來誘導(dǎo)大片段缺失。外顯子3和4的白色片段表示要刪除的片段园骆。紅色箭頭表示用于基因分型的引物的位置舔痪。綠色箭頭表示用于檢測正常ApoEb mRNA的引物的位置。+1锌唾，翻譯起始位點(diǎn);+748和+ 1290是gRNA的靶位;+2242, ApoEb的終止密碼子位點(diǎn)锄码。(B) ApoEb突變體序列顯示開放閱讀框(ORF)缺失375 個核苷酸，這意味著缺失126個氨基酸(aa)和1個錯誤的氨基酸(R→C)晌涕。(C)斑馬魚ApoEb蛋白含有一個保守的信號肽(SP)和載脂蛋白結(jié)構(gòu)域(Pfam ID: PF01442)滋捶，其中存在一個脂蛋白受體結(jié)合區(qū)(LRR)。部分載脂蛋白結(jié)構(gòu)域和ApoEb功能所需的LRR在預(yù)測的截?cái)嗟腁poEb突變蛋白中丟失余黎。(D)與測序結(jié)果一致重窟，基因分型顯示F2個雜合子(±)和純合子(?/?)的基因組Δ542缺失。(E)對5只dpf F3幼魚全身勻漿中ApoEb mRNA水平的定量分析顯示惧财，純合子(?/?)以及2月齡成蟲肝臟中ApoEb的表達(dá)顯著降低巡扇。左圖為每個樣本15只幼魚，每組n = 12只垮衷。在右圖中厅翔，每組n = 10。

成年ApoEb突變斑馬魚的高脂血癥

在3個月大的野生型雄性斑馬魚和ApoEb突變斑馬魚之間搀突，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的生理差異(圖2A和圖B)刀闷。為了測試ApoEb缺乏是否會導(dǎo)致高甘油三酯血癥，我們從喂食8周正常飲食(ND)和高脂肪飲食(HFD)的成年雄性斑馬魚身上采血，測量血漿中的脂質(zhì)譜甸昏。結(jié)果表明顽分，ND喂養(yǎng)的ApoEb突變體具有較高的血漿TC、LDL-C和VLDL水平施蜜。ApoEb突變體血漿TG水平有升高趨勢卒蘸，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)過HFD喂養(yǎng)后花墩，ApoEb突變體血漿中的TC悬秉、TG澄步、LDL-C和VLDL水平顯著升高冰蘑，而HDL-C與同胞相比沒有變化(圖2C)。由于ApoEb很可能是斑馬魚LDLR的配體村缸，而斑馬魚LDLR是細(xì)胞外膽固醇攝取和肝臟內(nèi)Srebp通路調(diào)節(jié)血漿膽固醇所必需的祠肥，因此我們接下來在正常喂養(yǎng)的2月齡ApoEb突變體的肝臟中測試了ApoEb敲除是否對Srebp通路產(chǎn)生影響，而Srebp通路也是許多降脂藥物的靶點(diǎn)(圖2D)梯皿。Srebp-2的兩個靶基因Hmgcr和Ldlr的表達(dá)水平在ApoEb突變體中顯著上調(diào)仇箱，而Srebp-2沒有顯著上調(diào)。在ApoEb突變體中东羹，Srebp-1及其靶基因Fasn的mRNA表達(dá)增加剂桥。

圖2 成年ApoEb突變斑馬魚發(fā)生高脂血癥。(A) 3月齡野生型雄性斑馬魚與ApoEb突變斑馬魚之間無明顯差異属提。成年魚的體長是指從嘴部到尾鰭開始的長度(如紅線段所示)权逗。(B) 3月齡成魚ApoEb缺失后體長和體重?zé)o明顯變化。每組N = 14冤议。(C) 8周正常飲食(ND)或高脂肪飲食(HFD)喂養(yǎng)3個月大的野生型斑馬魚或ApoEb突變體的血漿脂質(zhì)譜斟薇。每個樣本共5只動物，每組n = 6恕酸。(D) ApoEb突變成人肝臟中SREBP-1和-2通路的激活堪滨。每組N = 6。

ApoEb突變體幼魚的早期血管生成缺陷

3dpf ApoEb突變的幼魚在發(fā)育蕊温、卵黃利用和生長方面沒有顯著缺陷(圖3A)袱箱。3dpf野生型斑馬魚和ApoEb突變體的體長、卵黃面積和卵黃延伸沒有任何差異(圖3B)义矛。然而犯眠，約40%的ApoEb突變體在3dpf時出現(xiàn)腦出血，主要發(fā)生在中腦和后腦(圖3C和D症革，紅色三角形表示)筐咧。3 dpf ApoEb突變體Tg (fli1: EGFP)幼魚的共聚焦成像顯示，腦血管網(wǎng)絡(luò)的完整性受到明顯干擾。例如量蕊，在圖3E中铺罢，紅色三角形表示ApoEb突變體中狹窄的腦后靜脈(PCeVs)，而白色三角形表示原始后腦通道(PHBCs)的缺失残炮。然后我們觀察了突變體的節(jié)段間血管(ISVs)的發(fā)育韭赘。圖3F顯示了野生型和ApoEb突變的幼魚在48 hpf內(nèi)的ISVs發(fā)育情況，突變體在30势就、36和48 hpf時ISVs明顯縮小泉瞻。然而，在6 dpf內(nèi)苞冯，雖然48個hpf ApoEb突變體的ISV直徑縮短袖牙，但I(xiàn)SVs擴(kuò)散的時間和長度沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3F)。這些結(jié)果表明舅锄，血管生成缺陷發(fā)生在ApoEb突變體的早期發(fā)育階段鞭达。

圖3 ApoEb突變體幼魚的發(fā)育和血管生成。(A)野生型和ApoEb突變體胚胎在3dpf時的形態(tài)皇忿。突出顯示的紅色和藍(lán)色長度分別用于描繪體長和卵黃延伸的大小畴蹭。用綠色虛線圈出的面積計(jì)算卵黃面積。標(biāo)尺鳍烁，200 μm叨襟。(B)野生型和ApoEb突變體之間的體長、卵黃面積或卵黃延伸沒有顯著差異幔荒。每組N = 12糊闽。(C和D)約40%的ApoEb突變體在3dpf時，在中腦和后腦可見腦出血(紅色三角形表示)铺峭。每組N = 9;標(biāo)尺墓怀，200 μm。(E)腦血管網(wǎng)絡(luò)的完整性受到明顯干擾卫键。紅色三角形表示ApoEb突變體中大腦后靜脈(PCeVs)變窄傀履，白色三角形表示原始后腦通道(PHBCs)缺失。比例尺:上200 μm莉炉、下150 μm钓账。(F)顯示了fli1:EGFP背景的野生型和ApoEb突變體幼魚在48 hpf內(nèi)的體間血管(ISVs)的發(fā)育。注意ApoEb突變體在30,36和48hpf時的ISVs變窄絮宁。在6 dpf(每組n = 3)內(nèi)的不同時間點(diǎn)上梆暮，野生型和ApoEb突變體之間ISVs的發(fā)芽時間和傳播長度無顯著差異(p = 0.168)。然而绍昂，ApoEb突變體在48hpf內(nèi)啦粹，ISV直徑縮短(p = 0.001)(每組n = 15)偿荷。比例尺:200 μm (24hpf)或50 μm(28,30,36和48hpf)。

HFD誘導(dǎo)的ApoEb突變體發(fā)生脂質(zhì)代謝紊亂

我們進(jìn)行了ORO染色唠椭、共聚焦成像和脂質(zhì)測量來測試ApoEb突變體是否發(fā)展為LMD跳纳。我們發(fā)現(xiàn)ApoEb突變體的卵黃囊和血管都有脂質(zhì)含量(補(bǔ)充圖2A)。脂質(zhì)沉積隨著發(fā)育逐漸減少贪嫂，一直持續(xù)到6 dpf寺庄，表明卵黃囊的脂質(zhì)在這一階段已被消耗殆盡(補(bǔ)充圖2A)。與ND喂養(yǎng)1天相比力崇，ND喂養(yǎng)2天的7dpf ApoEb突變體幼魚血管中出現(xiàn)輕微的ORO染色(補(bǔ)充圖2B)斗塘，表明循環(huán)中中性脂質(zhì)水平中度升高×裂ィ可用于相對量化血管內(nèi)ORO染色強(qiáng)度的IOD值證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)(補(bǔ)充圖2C)馍盟。飼養(yǎng)5天后，用ND喂養(yǎng)的10dpf幼魚的ORO染色顯示ApoEb突變體有明顯的血管內(nèi)脂質(zhì)沉積(補(bǔ)充圖2D)台猴。然而朽合，在5天ND喂養(yǎng)的10dpf ApoEb突變體中俱两，血管中積累的熒光標(biāo)記膽固醇酯(576/589-CE饱狂，數(shù)字表示激發(fā)/發(fā)射波長)并沒有顯示出顯著變化(補(bǔ)充圖2D和E)。有趣的是宪彩，ISVs早期的血管生成缺陷似乎在這一階段得到了糾正休讳。換句話說，7dpf突變體的血管系統(tǒng)是正常的(補(bǔ)充圖2D)尿孔。然后俊柔，我們測試了2天的HFD喂養(yǎng)是否能夠在ApoEb突變體幼魚中誘導(dǎo)LMD。結(jié)果表明活合，接受2天HFD喂養(yǎng)的ApoEb突變體的表型更加穩(wěn)定(補(bǔ)充圖2F和G)雏婶。在接受5天HFD喂養(yǎng)的10 dpf ApoEb突變體中，通過ORO染色也可以觀察到更多的血管內(nèi)脂質(zhì)積累(圖4A和B)白指。即使只接受2天的HFD喂養(yǎng)留晚，也可能導(dǎo)致7 dpf ApoEb突變體幼魚的576/589-CE沉積顯著增加(圖4A)。每段平均脂質(zhì)沉積的計(jì)算也驗(yàn)證了這一結(jié)果(圖4C)告嘲。

圖4 ApoEb突變體幼魚發(fā)生脂質(zhì)代謝紊亂错维。(A)經(jīng)5天高脂飼料(HFD)喂養(yǎng)的10dpf幼魚的油紅O (ORO)染色顯示ApoEb突變體有明顯的血管內(nèi)脂質(zhì)沉積。將熒光標(biāo)記的膽固醇酯(576/589-CE橄唬，數(shù)字表示激發(fā)/發(fā)射波長)添加到HFD中赋焕，這樣可以看到7 dpf野生型和ApoEb突變體幼魚在喂食2天HFD后的血管脂質(zhì)沉積。DA仰楚，主動脈背側(cè);PCV隆判，后主靜脈;標(biāo)尺犬庇，200 μm。(B)通過積分光密度(IOD)定量(A)中的血管內(nèi)ORO染色強(qiáng)度侨嘀。每組N = 15械筛。(C)計(jì)算每節(jié)段平均脂質(zhì)沉積(每組n = 15)。(D)采用RT-qPCR方法檢測10dpf野生型和ApoEb突變體幼魚(每組15只飒炎，每組6只)飼喂5 天正陈裼矗或高脂飼料后Srebp-1和-2通路的表達(dá)情況。(E)飼喂5天高脂飼料提高了10dpf ApoEb突變體全身勻漿中總膽固醇(TC)郎汪、甘油三酯(TG)赤赊、極低密度脂蛋白(VLDL)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平不變煞赢。每個樣本共15個胚胎抛计，每組n = 6。

為了弄清楚ApoEb敲除對Srebp通路的主要影響照筑，我們在5dpf禁食的野生型和ApoEb突變的幼魚中進(jìn)行了檢測(Supplementary Fig. 2H)吹截，結(jié)果顯示了Ldlr的有趣上調(diào)。雖然2天的ND并沒有改變Srebp通路的表達(dá)凝危，但2天的HFD喂養(yǎng)顯著激活了ApoEb突變體的兩條Srebp通路(補(bǔ)充圖2I)波俄。這與飼養(yǎng)5 天的10dpf ApoEb突變體中Srebp-1和-2通路的表達(dá)一致，表明ND可能誘導(dǎo)Hmgcr上調(diào)蛾默，而HFD上調(diào)了所有這些基因的表達(dá)(圖4D)懦铺。8周HFD喂養(yǎng)ApoEb突變體的肝臟結(jié)果也是如此(補(bǔ)充圖2J)。此外支鸡，對7dpf幼魚的全身勻漿的脂質(zhì)測量顯示冬念，喂食HFD 2天的ApoEb突變體的TC、TG牧挣、LDL-C和HDL-C水平顯著升高急前，而喂食2天的ND也增加了ApoEb突變體的膽固醇水平(補(bǔ)充圖2K)。然而瀑构，連續(xù)5天的ND并沒有提高脂質(zhì)水平(補(bǔ)充圖2L)裆针，而5天的HFD喂養(yǎng)增加了10dpf ApoEb突變體的全身勻漿中TC、TG检碗、VLDL和LDL-C的水平据块，而HDL-C水平不變(圖4E)。

我們還研究了ApoEb缺乏對全身炎癥的影響折剃。我們發(fā)現(xiàn)另假，在5天HFD喂養(yǎng)的10dpf ApoEb突變體中，IL-1β和TNF-α的表達(dá)顯著上調(diào)怕犁，而IL-6的表達(dá)保持不變(Supplementary Fig. 2M)边篮。此外己莺，我們發(fā)現(xiàn)急性脂質(zhì)負(fù)荷如2天的高脂喂養(yǎng)可能導(dǎo)致ApoEb突變體Tg (ccl2: mCherry)幼魚心功能受損和心律失常。補(bǔ)充圖2N顯示戈轿，喂食HFD 2天后凌受，ApoEb突變體表現(xiàn)出更高的心率，更低的心室縮短分?jǐn)?shù)(FS)思杯，更小的心臟面積以及更短的靜脈竇(SV) -動脈球(BA)距離胜蛉，這表明心跳受限。補(bǔ)充影像1和2顯示色乾，與野生型相比誊册，喂食2天HFD的7 dpf ApoEb突變體顯示了明顯的舒張延長和早搏。以上結(jié)果提示暖璧，高脂飼料可能導(dǎo)致ApoEb突變斑馬魚發(fā)生嚴(yán)重的LMD案怯。

辛伐他汀、依折麥布和血脂康可顯著改善ApoEb突變體幼魚的脂代謝紊亂

為了評估ApoEb突變斑馬魚短期(2天)高脂飲食是否可用于藥物篩選實(shí)驗(yàn)澎办，我們需要找到合適的陽性對照嘲碱。我們測試了Hmgcr抑制劑和廣泛應(yīng)用的降脂藥物辛伐他汀(SIM)對血管內(nèi)脂質(zhì)積聚的影響。首先局蚀，將5 dpf幼魚用2d的高脂飼料喂養(yǎng)麦锯，最后24 h時添加不同濃度(0、0.1至会、0.2离咐、0.3谱俭、0.4奉件、0.5、1.0 μg/mL)的SIM昆著。24h SIM處理的生存試驗(yàn)顯示县貌，0.4 μg/mL SIM處理12 h時，幼魚存活率保持在較高水平(補(bǔ)充圖3A)凑懂。然而煤痕，24小時SIM處理具有相對較高的致死率(補(bǔ)充圖3A)，這與之前的報(bào)道一致接谨，并且對斑馬魚幼魚具有顯著的致畸作用摆碉。當(dāng)處理24 h時，幼魚表現(xiàn)出2倍的慢觸誘發(fā)逃逸率(用于測量斑馬魚幼魚的身體運(yùn)動能力和對外界刺激的反應(yīng)能力的參數(shù)脓豪，補(bǔ)充圖3B)巷帝，以及異常形態(tài)的發(fā)生率升高(補(bǔ)充圖3C和D，紅色三角形表示彎曲的尾巴)扫夜。在較長的藥物處理實(shí)驗(yàn)中楞泼，根據(jù)之前的研究驰徊，我們測試了依折麥布(ezetimibe, EZE)，當(dāng)處理超過2d時堕阔，EZE比SIM更安全棍厂。結(jié)果表明，5 μM和10 μM EZE處理的幼魚5d內(nèi)存活率較高(補(bǔ)充圖3E和F)超陆。血脂康(XZK)≤120 μg/mL處理的幼魚12h存活率較好(補(bǔ)充圖3E和F)牺弹， XZK處理5d的最佳濃度為30 μg/mL(補(bǔ)充圖3E)。

在此基礎(chǔ)上时呀，我們測試了SIM例驹、EZE和XZK的降脂效果。ORO染色表明退唠，30 μg/mL XZK處理12h可以有效減少經(jīng)2天HFD喂養(yǎng)的7 dpf ApoEb突變體的血管內(nèi)脂質(zhì)沉積鹃锈，而10 μM依折麥布或0.4 μg/mL SIM處理更有效(圖5A和B)。我們還通過共聚焦成像直接檢測了血管內(nèi)脂質(zhì)沉積(圖5C)瞧预。與此一致屎债，XZK處理組576/589-CE的血管沉積顯著減少，EZE和SIM處理組進(jìn)一步減少(圖5C和D)垢油。在5d處理實(shí)驗(yàn)中盆驹，10 μM EZE和30 μg/mL XZK與DMSO組(0.5% DMSO處理)相比，均顯著降低組織中的脂質(zhì)水平滩愁，HDL-C水平升高(圖5E)躯喇。我們還檢測了EZE或XZK處理對10 dpf ApoEb突變體幼魚中Srebp-1和2通路表達(dá)的影響(圖5F)。結(jié)果表明硝枉，EZE可能激活兩條通路廉丽，而XZK主要上調(diào)Srebp-2通路，Hmgcr和Ldlr的表達(dá)增加(圖5F)妻味。

圖5 辛伐他汀正压、依折麥布和血脂康可顯著改善ApoEb突變體幼魚的脂代謝紊亂。(A)7dpf ApoEb突變體幼魚喂2天HFD后责球，用0.5% (v/v) DMSO 焦履、30 μg/mL血脂康、10 μM依折麥布或0.4 μg/mL辛伐他汀處理12 h雏逾，血管內(nèi)脂質(zhì)沉積的ORO染色嘉裤。標(biāo)尺，100 μm栖博。(B)定量數(shù)據(jù)顯示血脂康治療組血管內(nèi)脂質(zhì)堆積明顯減少屑宠，依折麥布和辛伐他汀治療組血管內(nèi)脂質(zhì)堆積進(jìn)一步減少。每組N = 15笛匙。(C和D)血管脂質(zhì)沉積的代表性圖像和定量數(shù)據(jù)侨把。每組N = 14;標(biāo)尺犀变，100 μm。(E)與0.5% DMSO組相比秋柄，10dpf ApoEb突變體幼魚在添加10 μM依折麥布或30 μg/mL血脂康的條件下获枝，飼喂5d HFD后，其全身勻漿的脂質(zhì)測量結(jié)果顯示骇笔，總膽固醇(TC)省店、甘油三酯(TG)、極低密度脂蛋白(VLDL)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平顯著降低笨触，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平顯著升高懦傍。每個樣本共15個胚胎，每組n = 6芦劣。(F)采用rt-qPCR方法檢測依折麥布和血脂康處理對經(jīng)5 d HFD喂養(yǎng)的10dpf ApoEb突變體幼魚Srebp-1和-2通路表達(dá)的影響(每組15只粗俱，n = 6)。

以上結(jié)果證明ApoEb突變體LMD模型可用于藥物篩選虚吟。SIM和EZE分別在處理12h和5d時可作為陽性對照寸认。通過快速相對定量的方法，我們還發(fā)現(xiàn)XZK能夠通過降低斑馬魚的總TC串慰、TG偏塞、VLDL和LDL-C水平，同時提高HDL-C水平來緩解LMD邦鲫。

XZK對脂質(zhì)代謝紊亂的影響

XZK處理的攜帶ApoEb突變的Tg (flk1:dsRed;lyz:EGFP)幼魚的ORO染色顯示灸叼，隨著XZK濃度的增加，血管內(nèi)脂質(zhì)沉積逐漸減少(補(bǔ)充圖4A和B庆捺，圖6A為代表性圖像)古今，這可以通過血管內(nèi)染色強(qiáng)度的量化來證實(shí)(圖6B)。這種降脂作用可能在XZK對高脂血癥的預(yù)防作用中起重要作用疼燥。為了證明該魚系中顯示綠色熒光的細(xì)胞是中性粒細(xì)胞而不是巨噬細(xì)胞沧卢，我們進(jìn)行了免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證(圖6C)。如圖6C所示醉者，由Lyz啟動子驅(qū)動的EGFP(綠色)與中性粒細(xì)胞特異性標(biāo)記物Mpo(紅色)有明顯的共定位(黃色)，但與巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)記物MFAP4沒有共定位披诗。這表明在魚系中表達(dá)EGFP的細(xì)胞確實(shí)是中性粒細(xì)胞撬即。另一方面，熒光攝影顯示呈队，HFD喂養(yǎng)2d后剥槐，軀干大血管周圍表達(dá)EGFP的中性粒細(xì)胞大量聚集(圖6D)。而XZK和SIM治療組宪摧，中性粒細(xì)胞主要集中在腸道粒竖，而不是血管(補(bǔ)圖4C-D颅崩，圖6D為代表性圖像)，并且隨著藥物濃度的增加蕊苗，血管中積累的中性粒細(xì)胞減少(圖6E)沿后。這些結(jié)果表明，XZK對中性粒細(xì)胞的聚集有抑制作用朽砰，這可能是XZK預(yù)防LMD作用的另一機(jī)制尖滚。為了評估XZK處理是否影響巨噬細(xì)胞募集，我們對10 dpf的ApoEb突變體進(jìn)行中性紅染色瞧柔，并在5d的HFD中添加EZE (10 μM)和XZK (30 μg/mL)漆弄。結(jié)果顯示，兩者均能有效減少巨噬細(xì)胞的募集(圖6F和G)造锅。此外撼唾，在添加0.5% DMSO (DMSO)、XZK或EZE的HFD中哥蔚，10dpf幼魚的全身勻漿中IL-1β券坞、IL-6和TNF-α的mRNA含量測定顯示，EZE顯著誘導(dǎo)IL-1β和TNF-α的下調(diào)肺素。XZK處理可降低IL-1β mRNA表達(dá)恨锚，但對TNF-α無明顯影響。IL-6不受XZK和EZE的影響(圖6H)倍靡。

圖6 血脂康預(yù)防脂質(zhì)代謝紊亂的作用可能有多種機(jī)制猴伶。(A)藥物治療12h后，與DMSO組(0.5% DMSO)相比塌西，低濃度血脂康(XZK)治療組(36μg/mL, Lo-XZK)和高濃度XZK治療組(500μg/mL, Hi-XZK)的血管內(nèi)脂質(zhì)沉積均顯著降低他挎，與0.4μg/mL辛伐他汀(SIM)相當(dāng)。標(biāo)尺捡需，100μm办桨。(B)定量血管內(nèi)ORO染色強(qiáng)度證實(shí)了(A)的結(jié)果。每組N = 15站辉。(C) lyz啟動子驅(qū)動的EGFP(綠色)與中性粒細(xì)胞特異性標(biāo)記物Mpo(上一行紅色)有明顯的共定位(黃色)呢撞，但與巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)記物MFAP4(下一行紅色)無共定位。標(biāo)尺饰剥，200 μm殊霞。(D)在DMSO組(7dpf ApoEb突變體幼魚喂食含0.5% DMSO的2d HFD)中，中性粒細(xì)胞大量聚集在樹干大血管周圍(綠色箭頭)汰蓉。中性粒細(xì)胞大量聚集在軀干大血管周圍(綠色箭頭)绷蹲。XZK高濃度治療組(500μg/mL, Hi-XZK)、XZK低濃度治療組(18 μg/mL, Lo-XZK)和辛伐他汀治療組(SIM)中，中性粒細(xì)胞主要集中于腸道(白色箭頭)而非主干血管祝钢。標(biāo)尺比规，200 μm。(E)主干血管中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示拦英，≥18μg/mL XZK處理顯著降低了中性粒細(xì)胞的募集數(shù)量蜒什，說明特定濃度的XZK對中性粒細(xì)胞的募集有抑制作用。Dmso, 0.5% Dmso;Lo-XZK, 18μg/mL血脂康;Hi-XZK, 500μg/mL血脂康;SIM, 0.4μg/mL辛伐他汀;每組N = 12龄章。(F吃谣、G) 依折麥布(10μM)和血脂康(30 μg/mL)處理均能有效減少10dpf ApoEb突變體5 d HFD喂養(yǎng)的巨噬細(xì)胞募集。每組N = 9;標(biāo)尺做裙，200 μm岗憋。(H) RT-qPCR檢測10dpf幼魚在添加0.5% DMSO (DMSO)、30μg/mL血脂康和10μM依折麥布5 d的飼料中IL-1β锚贱、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)仔戈。每個樣本共15只幼魚，每組n = 6拧廊。

討論

目前监徘，ApoE基因敲除小鼠和Ldlr基因敲除小鼠補(bǔ)充HFD已成為動脈粥樣硬化、高脂血癥等LMDs的常規(guī)動物模型吧碾。ApoE敲除小鼠血脂明顯升高凰盔，主動脈壁有大量脂質(zhì)沉積，可在短時間內(nèi)發(fā)生動脈粥樣硬化倦春。盡管ApoE和Ldlr突變小鼠的表型相似户敬，但它們在發(fā)生動脈粥樣硬化的飲食需求、突出的脂蛋白和肝脂肪酶缺乏的影響方面存在差異睁本。ApoE-/-小鼠模型的優(yōu)勢在于尿庐，在喂食正常低脂鼠糧的動物中，復(fù)雜的血管病變很容易發(fā)生呢堰，而喂食高脂肪抄瑟、高膽固醇的西式飲食可以顯著加速動脈粥樣硬化的發(fā)生，這是建立Ldlr敲除小鼠動脈粥樣硬化模型的必要條件枉疼。此外皮假，載脂蛋白ApoE除直接參與脂質(zhì)代謝外，在動脈粥樣硬化的病理過程中還具有多種作用往衷，如調(diào)節(jié)單核細(xì)胞活化和平滑肌細(xì)胞(SMC)的遷移和增殖钞翔、一氧化氮合酶(NOS)介導(dǎo)的血小板聚集等∠幔總之，不同的因素可能在ApoE和Ldlr敲除小鼠中分別表現(xiàn)出不同的功能哮笆。換句話說来颤，ApoE和LDLR突變體不能相互替代汰扭。

在最近的一篇綜述中，Vedder等人寫道:“ApoE-/-斑馬魚的發(fā)展將為動脈粥樣硬化研究創(chuàng)造一種新的工具福铅，可以與小鼠模型進(jìn)行比較萝毛。”在本研究中滑黔，我們旨在建立斑馬魚中ApoEb功能缺失的LMD模型笆包，ApoEb是在斑馬魚進(jìn)化過程中由ApoE的兩個亞功能化類似物之一編碼的。斑馬魚ApoEb基因的表達(dá)具有物種特異性略荡，其具體功能和機(jī)制研究尚缺乏庵佣。一些研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚的載脂蛋白e蛋白與哺乳動物的載脂蛋白e蛋白具有相似的功能域和高度同源性。在接下來的研究中汛兜，我們假設(shè)斑馬魚ApoEb在哺乳動物中扮演ApoE基因的角色巴粪，ApoEb突變魚系增加了斑馬魚脂質(zhì)異常模型集，包括ApoC2突變斑馬魚等粥谬。雖然已經(jīng)建立了這些突變的斑馬魚系肛根，但ApoEb突變體與其他突變體之間存在各種生理和病理生理差異。在本研究中漏策，我們發(fā)現(xiàn)斑馬魚ApoEb缺乏導(dǎo)致腦出血派哲、腦血管網(wǎng)絡(luò)缺損和內(nèi)室狹窄。在脂質(zhì)負(fù)荷下掺喻，ApoEb突變體表現(xiàn)為早期心功能障礙和顯著的血管脂質(zhì)沉積芭届。先前的研究報(bào)道了一種具有血管脂質(zhì)沉積積累的WT幼魚斑馬魚高膽固醇血癥模型，其建立需要2周的HCD喂養(yǎng)巢寡，以及具有相似表型的Ldlr功能喪失突變斑馬魚模型喉脖，該模型需要5天的HCD喂養(yǎng)。然而抑月，根據(jù)特定的研究目的树叽，例如中性粒細(xì)胞在急性脂質(zhì)負(fù)荷中的快速反應(yīng)，我們的新ApoEb突變體通過HFD喂養(yǎng)誘導(dǎo)血管脂質(zhì)積累的時間可以減少到48小時谦絮。此外题诵，我們的ApoEb突變斑馬魚模型的建立不僅對LMDs的研究有價(jià)值，而且可以用于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和阿爾茨海默病等疾病的研究层皱，以及細(xì)菌抗原免疫等先天免疫系統(tǒng)的研究性锭。

在我們的研究結(jié)果中，禁食的5dpf ApoEb突變體顯示Ldlr表達(dá)增加叫胖，這表明Srebp-2途徑被激活草冈，F(xiàn)asn表達(dá)減少，這表明Srebp-1途徑被抑制。通過攝食不同時間點(diǎn)的測量怎棱，我們證實(shí)了HFD攝食ApoEb突變體中Srebp-1和-2通路的激活哩俭，并一致地表達(dá)了Ldlr的上調(diào)。眾所周知拳恋，Ldlr是肝臟膽固醇攝取的介質(zhì)凡资，主要由SREBP-2調(diào)節(jié)。當(dāng)肝細(xì)胞缺乏相對于其生理需要所需的膽固醇時谬运，Ldlr的上調(diào)將通過由SREBP-2嚴(yán)格控制的負(fù)反饋機(jī)制介導(dǎo)隙赁。另一方面，F(xiàn)ASN是一種與脂肪酸合成直接相關(guān)的多功能蛋白梆暖，在哺乳動物的從頭脂肪生成中起著至關(guān)重要的作用伞访。值得注意的是，我們在本研究中發(fā)現(xiàn)的ApoEb突變體中Fasn的下調(diào)與Ldlr突變體中Fasn的上調(diào)形成鮮明對比式廷。然而咐扭，其他Srebp基因，包括Hmgcr和Pcsk9滑废，在禁食幼魚中沒有顯著變化蝗肪。Srebp-1或Srebp-2對不同靶基因的調(diào)控方式不同，其潛在機(jī)制可能為膽固醇穩(wěn)態(tài)調(diào)控基因的差異靶向提供新的見解和新途徑蠕趁，值得進(jìn)一步探索薛闪。

在12 h的藥物治療實(shí)驗(yàn)中，我們使用SIM來測試所建立的模型是否可以用于降脂藥物的篩選俺陋。SIM有效地阻止了HFD誘導(dǎo)的血管脂質(zhì)沉積的積累豁延，并提高了血漿HDL-C水平，表明促進(jìn)了膽固醇逆向運(yùn)輸回肝臟腊状。這些結(jié)果與之前的報(bào)道相反诱咏，SIM在WT斑馬魚中沒有明顯的降脂作用。這種差異可能是由于SIM治療引起的ApoEb功能障礙誘導(dǎo)的Srebp通路激活和HMGCR抑制的潛在耦合效應(yīng)缴挖，部分原因是由于不同給藥方法對SIM的吸收不同袋狞。值得注意的是，之前的研究報(bào)告了SIM對斑馬魚幼魚以及人類患者的骨骼肌毒性映屋。與此一致苟鸯，我們的研究結(jié)果在體內(nèi)證實(shí)了SIM的肌肉毒性，其特征是身體運(yùn)動減少棚点，對外部刺激反應(yīng)緩慢早处，異常形態(tài)增加(彎曲尾巴和脊柱側(cè)凸)。在為期5天的藥物治療實(shí)驗(yàn)中瘫析，以EZE作為安全有效的陽性對照與XZK進(jìn)行比較砌梆。我們的研究結(jié)果顯示默责，EZE顯著激活Srebp-2通路，上調(diào)Srebp-2及其下游基因Hmgcr么库、Pcsk9和Ldlr的表達(dá)傻丝，與之前在小鼠中的研究一致甘有，XZK對Srebp-2通路也有類似的作用诉儒。這與小鼠研究不一致，我們發(fā)現(xiàn)EZE也上調(diào)Srebp-1的表達(dá)亏掀，而不影響其下游Fasn忱反。在目前的研究中，脂肪酸合成是否被激活以及在哪里被激活還很難確定滤愕，值得進(jìn)一步探索温算。因此，我們認(rèn)為ApoEb突變體幼魚可以用于機(jī)制研究间影，也可以用于初始遺傳或藥物篩選注竿，以確定新的治療靶點(diǎn)，以及它們的潛在危害魂贬。

我們還對ApoEb突變體及野生型斑馬魚的DA和PCV切片進(jìn)行了組織學(xué)染色(補(bǔ)充圖5)巩割。在我們的觀察中，ApoEb突變體的血管中可以自發(fā)形成動脈粥樣硬化病變付燥，主要是在PCV中宣谈。與以往研究一致，HFD喂養(yǎng)導(dǎo)致血管內(nèi)纖維組織大量染紅键科，導(dǎo)致血管狹窄闻丑，大部分病變隱藏在這些組織中。有趣的是勋颖，病變內(nèi)有巨大的空泡和大量吞噬細(xì)胞樣細(xì)胞浸潤(胞質(zhì)呈紫色嗦嗡，細(xì)胞核呈藍(lán)色，吞噬褐色壞死物質(zhì))饭玲，與哺乳動物動脈粥樣硬化病變相似侥祭。

在動脈粥樣硬化早期，中性粒細(xì)胞在血管內(nèi)皮下大量募集咱枉，釋放多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)卑硫，引起局部炎癥反應(yīng)。中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞進(jìn)入并吞噬氧化LDL (oxLDL)蚕断，形成泡沫細(xì)胞欢伏，促進(jìn)脂質(zhì)條紋的形成，進(jìn)一步激活巨噬細(xì)胞亿乳，加重動脈粥樣硬化硝拧。多項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)径筏，在晚期動脈粥樣硬化病變中，中性粒細(xì)胞的數(shù)量和活性與急性冠脈綜合征(ACS)障陶、不穩(wěn)定病變破裂滋恬、血栓形成等心血管事件的發(fā)生率呈正相關(guān)。此前的一項(xiàng)研究報(bào)道抱究，芥菜籽及其提取物等中藥可以抑制中性粒細(xì)胞的募集恢氯，發(fā)揮其抗動脈粥樣硬化的作用。在我們的實(shí)驗(yàn)中鼓寺，我們觀察到XZK治療后血管內(nèi)中性粒細(xì)胞募集明顯抑制勋拟，這表明XZK可能對中性粒細(xì)胞也有類似的抑制作用。這一觀察結(jié)果與最近有爭議的觀點(diǎn)是一致的妈候，即骨髓細(xì)胞而不是巨噬細(xì)胞驅(qū)動斑馬魚幼魚的早期動脈粥樣硬化敢靡，即中性粒細(xì)胞。EZE治療5天后苦银，血管內(nèi)巨噬細(xì)胞募集減少啸胧，與小鼠模型一致。與EZE一樣，XZK也表現(xiàn)出對巨噬細(xì)胞募集的抑制作用。此外虱疏，EZE和XZK均能顯著下調(diào)IL-1β的表達(dá)省古，而EZE單獨(dú)也能降低TNF-α的表達(dá)。

我們的研究有幾個局限性。首先，成年斑馬魚實(shí)驗(yàn)周期長，不適合進(jìn)行藥物篩選等大規(guī)模實(shí)驗(yàn)叭首。幼魚周期短，成本低踪栋，但體積小焙格，器官發(fā)育尚處于早期階段，難以進(jìn)行血液檢測和切片夷都。這可能是一個缺點(diǎn)眷唉，但容易的基因操作和幼魚的不透明性為研究早期動脈粥樣硬化的病理機(jī)制提供了機(jī)會。也許囤官，隨著檢測技術(shù)的進(jìn)步冬阳，ApoEb缺失對斑馬魚幼魚白細(xì)胞積累和動脈粥樣硬化病變形成的附加作用將在未來得到進(jìn)一步闡明。其次党饮，不可能準(zhǔn)確地量化每只幼魚的攝食肝陪、消耗和排泄。在實(shí)驗(yàn)中刑顺，我們定期在顯微鏡下觀察幼魚的發(fā)育和攝食情況氯窍，并及時拋棄不健康或不攝食的幼魚饲常，但仍不能完全消除個體差異對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。第三狼讨，敲除ApoEb是否會導(dǎo)致其他與脂質(zhì)代謝相關(guān)的病理后果尚不清楚贝淤，需要進(jìn)一步觀察。

結(jié)論

綜上所述政供，我們介紹了一種新的LMD遺傳模型播聪。ApoEb突變斑馬魚幼魚經(jīng)短期高脂飲食喂養(yǎng)后，血管內(nèi)脂質(zhì)沉積明顯且持續(xù)鲫骗。我們認(rèn)為犬耻，這一新的模型可能為高脂血癥、FH等LMDs的病理生理和治療靶點(diǎn)篩選研究执泰，以及新型降脂藥物的藥理和毒理學(xué)研究開辟另一條道路。

基金：這項(xiàng)研究得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(20119yfa0802700)和國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(92168206)的支持渡蜻。

原文：Hu Y X, You H M, Zhu R F, et al. Establishment of a lipid metabolism disorder model in ApoEb mutant zebrafish[J]. Atherosclerosis, 2022, 361: 18-29.

原文地址：https://doi.org/10.1016/j.atherosclerosis.2022.10.008

注：因文章篇幅有限术吝，所有相關(guān)引用文獻(xiàn)，以及補(bǔ)充圖茸苇、表可以點(diǎn)擊至原文查閱排苍。