雜志：International Journal of Molecular Sciences

影響因子：5.6（2022-2023）

年份：2023

通訊作者：Zongbin Cui

摘要

糖尿病已逐漸成為威脅人類健康的嚴重疾病。糖尿病的發(fā)病機制相當復(fù)雜鹃共，目前尚未完全闡明鬼佣。斑馬魚已被廣泛認為是研究糖尿病發(fā)病機制和治療干預(yù)的有用模型。然而霜浴，過度喂養(yǎng)導(dǎo)致斑馬魚糖尿病的分子基礎(chǔ)仍不清楚晶衷。本研究通過過度喂養(yǎng)建立斑馬魚糖尿病模型，探討過度喂養(yǎng)導(dǎo)致斑馬魚糖尿病的分子基礎(chǔ)阴孟。與對照組相比晌纫，過度喂養(yǎng)4周后斑馬魚的體長、體重和狀態(tài)因子指數(shù)均顯著增加永丝∏率空腹血糖水平明顯升高，伴有肝內(nèi)大量脂滴積聚慕嚷。血清和肝臟中甘油三酯和膽固醇水平均顯著升高哥牍。轉(zhuǎn)錄組測序用于研究過度喂養(yǎng)斑馬魚肝臟的變化毕泌。過度喂養(yǎng)斑馬魚肝臟中上調(diào)和下調(diào)的差異表達基因(DEGs)數(shù)量分別為1582和2404個。對差異表達基因進行KEGG和GO富集分析嗅辣，確定關(guān)鍵信號通路和關(guān)鍵DEGs撼泛。結(jié)果表明，在與脂肪酸代謝相關(guān)的信號通路中澡谭，有16個基因被發(fā)現(xiàn)顯著上調(diào)愿题。具體而言，這些基因主要參與脂肪酸轉(zhuǎn)運译暂、脂肪酸氧化和酮體生成抠忘。此外，13個在葡萄糖代謝中起關(guān)鍵作用的基因外永，特別是在糖酵解和糖生成途徑中崎脉，在過度喂養(yǎng)的斑馬魚的肝臟中顯著下調(diào)。這些結(jié)果表明伯顶，在過度喂養(yǎng)的斑馬魚的肝臟中囚灼，胰島素抵抗和葡萄糖進入肝細胞的抑制。這些發(fā)現(xiàn)闡明了斑馬魚過度喂養(yǎng)導(dǎo)致糖尿病的潛在分子基礎(chǔ)祭衩，并為進一步研究糖尿病的發(fā)病機制和治療提供了模型灶体。

關(guān)鍵詞：糖尿病掐暮；斑馬魚蝎抽；肝；RNA-seq路克；信號通路樟结。

前言

糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是全球死亡率的主要原因。預(yù)計到2045年精算，全球糖尿病病例將從目前的約5.37億增加到7.83億瓢宦。據(jù)估計，約有670萬20-79歲的成年人死于糖尿病或其并發(fā)癥灰羽。2021年中國糖尿病患者人數(shù)為1.409億人驮履。糖尿病是由于胰島素分泌不足或細胞對胰島素敏感性下降引起的，導(dǎo)致長時間的高血糖水平廉嚼，隨后對體內(nèi)許多組織和器官造成損害玫镐，如腎衰竭、心血管疾病怠噪、神經(jīng)和腦損傷以及其他微血管并發(fā)癥摘悴。糖尿病主要有三種類型:1型糖尿病(T1DM)、2型糖尿病(T2DM)和妊娠期糖尿病舰绘。

2型糖尿病(T2DM)是最常見的糖尿病類型蹂喻，占糖尿病病例的95%，其首發(fā)癥狀為胰島素抵抗捂寿。人體獲取葡萄糖的主要途徑有三個:腸道對食物的吸收口四、糖原的分解(糖原分解)和糖異生。胰島素是調(diào)節(jié)人體大部分細胞(尤其是肝臟秦陋、脂肪組織和肌肉)對血液中葡萄糖攝取的主要激素蔓彩。因此，胰島素缺乏或其受體不敏感在所有形式的糖尿病中起著核心作用驳概。胰島素不僅促進葡萄糖的吸收赤嚼，而且刺激脂肪的合成。高甘油三酯水平和肝脂肪變性與胰島素抵抗相關(guān)顺又。

許多T2DM患者在達到2型糖尿病診斷標準之前已經(jīng)有糖尿病前期的跡象更卒，如空腹血糖受損和/或糖耐量受損。尤其是糖耐量受損是進展為全面型糖尿病的主要診斷危險因素稚照。血液中膽固醇和甘油三酯水平高蹂空，以及收縮壓和舒張壓升高，也是發(fā)展為糖尿病的危險因素果录。糖尿病患者常出現(xiàn)以膽固醇和甘油三酯代謝異常為特征的血脂異常等代謝綜合征上枕。心血管疾病(CVD)是T2DM患者發(fā)病和死亡的主要原因。增加糖尿病患者CVD風(fēng)險的一個重要因素是動脈粥樣硬化性脂質(zhì)異常弱恒，而血液中膽固醇和甘油三酯水平的升高是血脂評估的重要標志物辨萍。既往研究表明，T2DM患者的肝臟脂代謝也存在明顯紊亂返弹。

T2DM主要由生活方式因素和遺傳因素引起锈玉。目前已知，許多生活方式因素在T2DM的發(fā)生中起重要作用琉苇，包括肥胖(定義為體重指數(shù)大于30)嘲玫、缺乏體力活動、不良飲食并扇、壓力和城市化去团。含糖飲料等飲食因素與風(fēng)險增加相關(guān)。飲食中的脂肪類型也是重要因素穷蛹，因為飽和脂肪和反式脂肪會增加風(fēng)險土陪，而多不飽和脂肪和單不飽和脂肪會降低風(fēng)險。過量食用精米可能會增加糖尿病的風(fēng)險肴熏，尤其在中國和日本人群中鬼雀。通過改變生活方式或改善胰島素敏感性或減少肝臟葡萄糖生成的藥物，可以減緩或逆轉(zhuǎn)糖尿病前期向顯性T2DM的進展蛙吏。

然而源哩，糖尿病發(fā)生發(fā)展的分子機制仍未闡明鞋吉。斑馬魚已廣泛應(yīng)用于代謝性疾病的研究領(lǐng)域。在糖尿病研究方面励烦，斑馬魚有幾個特點谓着。斑馬魚具有與哺乳動物相似的血糖調(diào)節(jié)機制，幾種已獲批準的2型糖尿病藥物可顯著降低斑馬魚高糖模型的血糖坛掠。此外赊锚，斑馬魚已被用于研究胰島β細胞再生的機制，并篩選促進胰島β細胞再生的化合物屉栓。在脂肪代謝方面舷蒲，斑馬魚已被用于研究脂肪代謝和減肥藥的開發(fā)，以及篩選和評價能夠降低體內(nèi)膽固醇水平的藥物友多。然而牲平，斑馬魚的血容量相對較低，不利于進行大規(guī)模夷陋、重復(fù)的采血實驗欠拾，如研究血糖代謝調(diào)節(jié)機制等∑疲考慮到不同物種間脂質(zhì)代謝的保守性藐窄，斑馬魚被認為是研究糖尿病和肥胖等代謝紊亂的良好模型，而利用斑馬魚作為模式生物來研究糖尿病也逐漸得到認可酬土。建立斑馬魚糖尿病模型的方法多種多樣荆忍，包括化學(xué)方法、飲食誘導(dǎo)撤缴、葡萄糖浸泡和基因敲除刹枉。利用斑馬魚糖尿病模型研究干細胞治療糖尿病和糖尿病心力衰竭。飲食誘導(dǎo)的糖尿病導(dǎo)致斑馬魚胰腺胰島素分泌增加屈呕。然而微宝，飲食因素引起的斑馬魚糖尿病在分子水平上的改變?nèi)晕幢唤沂尽?/span>

本研究通過過度喂養(yǎng)建立斑馬魚糖尿病模型。我們發(fā)現(xiàn)過度喂食的斑馬魚肝臟中有過多的脂滴積聚虎眨。通過高通量RNA-seq的比較分析揭示了在過度喂養(yǎng)的斑馬魚中促進脂滴積累和胰島素抵抗的新分子因子蟋软。這些研究結(jié)果為斑馬魚通過過量喂養(yǎng)成功誘導(dǎo)糖尿病提供了支持，為進一步研究糖尿病的病因和治療提供了模型嗽桩。

材料和方法

本研究中使用的AB菌株斑馬魚在28℃的標準實驗室條件下維持岳守，光/暗循環(huán)為12/12小時。

本研究中過度喂養(yǎng)的方法是基于發(fā)表的研究碌冶。選取4月齡野生型雄性斑馬魚湿痢，根據(jù)體重和體長隨機分為過度喂養(yǎng)組和對照組，每組20條扑庞。對照組在常規(guī)條件下每天喂養(yǎng)1次(上午9:00)譬重，過度喂養(yǎng)組在常規(guī)條件下每天喂養(yǎng)4次(上午9:00拒逮、上午11:00、下午15:00臀规、下午17:00)消恍。每次投喂4.08 g/20尾。

凍紅魚主要成分的粗脂肪以现、粗蛋白質(zhì)、粗灰分和粗纖維含量分別為4.07%约啊、52.73%邑遏、19.2%和9.56%。熱量為3.2254 kcal/g恰矩。

采血和測定

斑馬魚采血方法與前一篇文章相同记盒。成年斑馬魚禁食18 h后采血。根據(jù)制造商的說明外傅，使用Accu-Chek Performa血糖儀測量血糖水平纪吮。

油紅O染色和組織學(xué)

對照組和過度喂養(yǎng)組的肝組織被固定在4%多聚甲醛(PFA, Beyotime Biotechnology，上海萎胰，中國)中4℃過夜碾盟。固定后，如前所述用油紅O染色技竟。組織切片的照片使用來自Leica (Wetzlar冰肴，德國)的Aperio VERSA Brightfield熒光和FISH數(shù)字病理掃描儀拍攝。采用ImageJ軟件進行定量分析榔组。

總膽固醇和甘油三酯的測定

總膽固醇和甘油三酯(TG)水平根據(jù)制造商的說明書使用商業(yè)試劑盒測定熙尉。總膽固醇檢測試劑盒(A111-1-1)和甘油三酯檢測試劑盒(F001-1-1)購自南京建成生物工程研究所搓扯。

RNA測序的樣本收集和分析

斑馬魚被禁食一夜检痰，然后在過量喂養(yǎng)4周后被處死。收集3條斑馬魚的肝臟作為一個樣本锨推，使用TRIzol Reagent (Invitrogen, Waltham, MA, USA)進行總RNA提取铅歼，每組包含3個獨立樣本。樣本質(zhì)量分析爱态、RNA文庫制備和RNA-seq方法如前所述1谭贪。構(gòu)建6個測序文庫并測序。文庫建設(shè)和高通量rna測序由中國科學(xué)院水生生物研究所分析檢測中心(http://www.ihb.ac.cn/fxcszx/锦担， 2022年11月29日訪問)的專家完成俭识。

生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)分析按照之前的描述進行。簡而言之洞渔，我們首先使用Trimmomatic(0.38版)過濾原始數(shù)據(jù)套媚，以去除關(guān)節(jié)和低質(zhì)量數(shù)據(jù)缚态，并獲得干凈讀取。然后使用HISAT2(版本2.1.0)將這些高質(zhì)量的reads映射到從NCBI組裝數(shù)據(jù)庫獲得的參考基因組(Danio rerio GRCz11)堤瘤，以獲得對齊文件的BAM形成玫芦。然后，使用讀取匯總程序featurests對讀取計數(shù)進行匯總本辐。這些計數(shù)使用Bioconductor DESeq2包用于基因差異表達分析桥帆。篩選低豐度基因(總reads數(shù)< 10)進行差異表達分析。差異倍數(shù)≥1.5且p值≤0.05的基因被視為差異表達基因(DEGs)慎皱。

利用KOBAS-i對DEGs進行京都基因與基因組百科全書(KEGG)和基因本體論(GO)富集分析老虫。利用R-studio軟件中的ggplot2生成KEGG富集結(jié)果的點圖和GO富集結(jié)果(p值≤0.05)的條形圖。使用RStudio (Version 1.4.1717)根據(jù)富集分析結(jié)果中共享基因的數(shù)量計算兩條KEGG信號通路之間的Jaccard系數(shù)茫多，并使用Cytoscape (Version 3.8.2)軟件繪制網(wǎng)絡(luò)圖祈匙。利用Cytoscape插件cytoHubba，通過最大集團中心度(MCC)方法分析核心信號通路和基因天揖，并導(dǎo)出可視化結(jié)果夺欲。使用REVIGO工具根據(jù)KOBAS-i獲得的p值對GO項進行聚類和修剪。

統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel for Windows軟件(Microsoft Office 2013, Microsoft, Redmond, WA, USA)進行統(tǒng)計學(xué)分析今膊。采用獨立樣本t檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析些阅。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。

雄性斑馬魚過度喂養(yǎng)4周后空腹血糖水平的升高

過度喂養(yǎng)(OF) 4周后万细，雄性斑馬魚的體長扑眉、體重和條件因子指數(shù)均顯著高于對照組(CK)。其中赖钞，CK組斑馬魚平均體長為3.03 cm腰素，而OF組斑馬魚平均體長為3.25 cm。CK組斑馬魚平均重量為0.42 g, of組斑馬魚平均重量為0.58 g雪营。CK組斑馬魚的平均條件因子指數(shù)為1.52,OF組斑馬魚的平均條件因子指數(shù)為1.69弓千。過度喂養(yǎng)1個月后，與CK組相比献起，斑馬魚的體長洋访、體重和條件因子指數(shù)分別增加了1.1倍、1.4倍和1.1倍(圖1A-C)谴餐。

圖1 雄性斑馬魚過度喂養(yǎng)后體指數(shù)姻政、空腹血糖、甘油三酯和總膽固醇的變化岂嗓。過量喂養(yǎng)組雄性斑馬魚的體長(A)汁展、體重(B)、條件因子指數(shù)(C)、空腹血糖(D)以及血清中甘油三酯(E)和總膽固醇(F)水平顯著升高(*食绿，p < 0.05;**侈咕， p < 0.01;N = 13)。vegfc信號通路促進斑馬魚心臟損傷后冠狀動脈內(nèi)皮細胞(cEC)增殖器紧。

此外耀销，OF組的空腹血糖平均水平為3.25 mmol/L，顯著高于CK組的2.03 mmol/L(圖1D和圖S1A)铲汪。然而熊尉，與CK組相比，OF組雌性斑馬魚的空腹血糖水平并沒有出現(xiàn)顯著變化(圖S1B)掌腰。

CK組和OF組血清甘油三酯平均水平分別為1.44 mmol/L和7.89 mmol/L帽揪。與CK組相比，OF組的血清甘油三酯水平增加了5.5倍(圖1E)辅斟。CK組和of組血清膽固醇平均水平分別為3.67 mmol/L和7.33 mmol/L。與CK組相比芦拿，OF組血清中的膽固醇水平顯著增加了2倍(圖1F)士飒。

綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明雄性斑馬魚在過度喂養(yǎng)4周后已經(jīng)發(fā)展出糖尿病的特征蔗崎。

雄性斑馬魚過度喂養(yǎng)4周后肝臟脂滴的積聚

肝臟在調(diào)節(jié)血糖水平方面起著重要作用酵幕。對CK組和OF組的肝臟切片進行油紅0染色，發(fā)現(xiàn)OF組的肝臟內(nèi)脂滴積聚增加(圖2A)缓苛。ImageJ定量顯示芳撒，與CK組相比，OF組的油紅色區(qū)域面積增加了80倍(圖2B)未桥。

圖2 過量喂養(yǎng)的斑馬魚肝臟中脂滴的積累笔刹。對照組和過量攝食組肝臟切片油紅O染色圖像(A)。通過Image J軟件(版本1.50i)對對照組和過量攝食組肝臟脂滴積累的倍數(shù)變化進行量化冬耿，并以直方圖顯示(B)舌菜。對照組和過量攝食組肝臟甘油三酯(C)和膽固醇(D)水平。(數(shù)值為平均值±SEM;*亦镶， p < 0.05;**日月， p < 0.01;CK:對照組，OF:過食組;N = 5缤骨。)

斑馬魚肝臟中的甘油三酯和膽固醇水平也受到過度喂養(yǎng)的顯著影響爱咬。CK組和OF組肝臟甘油三酯平均水平分別為0.78×10?5 mmol/mg和3.47×10?5 mmol/mg。與對照組相比绊起，斑馬魚肝臟中的甘油三酯水平增加了4.5倍(圖2C)精拟。

CK組和OF組肝臟膽固醇平均水平分別為1.02×10-5 mmol/mg和1.46×10-5 mmol/mg。與CK組相比，OF斑馬魚肝臟中的膽固醇水平增加了1.4倍(圖2D)串前。

這些結(jié)果表明瘫里，過度喂養(yǎng)對斑馬魚的脂質(zhì)代謝產(chǎn)生嚴重影響，導(dǎo)致脂質(zhì)在肝臟中蓄積荡碾。

RNA-Seq分析鑒定差異表達基因

為了確定OF組肝臟在分子水平的胰島素抵抗現(xiàn)象谨读，我們對CK和OF組肝臟進行了轉(zhuǎn)錄組分析(圖S2A)。RNA測序的原始數(shù)據(jù)范圍為19.29 ~ 22.81M坛吁。去除適配器和低質(zhì)量數(shù)據(jù)后劳殖，凈讀長范圍為19.25 ~ 22.77M，各組的凈讀長比均在99%以上拨脉，表明RNA測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量可靠(圖S2B)哆姻。各組的clean reads被映射到斑馬魚的參考基因組，映射率在92%以上(圖S2B)玫膀。

主成分分析(PCA)顯示OF組和CK組分別聚類在一起矛缨，組間差異明顯(圖3A)。共獲得3986個差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)帖旨，其中1582個上調(diào)箕昭，2404個下調(diào)(fold change≥1.5且p值≤0.05)(圖3B和表S1)。

圖3 對照組和過量喂養(yǎng)組肝臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果解阅。差異表達基因的基因表達譜主成分分析(PCA) (A)落竹。直方圖(B)顯示斑馬魚過飼后肝臟中上調(diào)和下調(diào)的差異表達基因(deg)數(shù)量(倍數(shù)變化≥1.5,p值≤0.05)。

DEGs的KEGG富集分析

使用在線軟件KOBAS(版本3.0)對DEGs進行KEGG富集分析(表S2)货抄。上調(diào)DEGs中最富集(p值≤0.05)的KEGG通路為代謝通路述召、脂肪酸降解、纈氨酸蟹地、亮氨酸和異亮氨酸降解积暖、過氧化物酶體和β-丙氨酸代謝。下調(diào)DEGs中最富集的KEGG通路(p值≤0.05)為緊密連接怪与、凋亡呀酸、C型凝集素受體信號通路、NOD樣受體信號通路和細胞因子-細胞因子受體相互作用(圖4A琼梆、B)性誉。

圖4 過量飼養(yǎng)后肝臟中DEGs的KEGG富集分析結(jié)果。上調(diào)DEGs (A)和下調(diào)DEGs (B)的KEGG富集分析結(jié)果點圖茎杂。上調(diào)DEGs (C)和下調(diào)DEGs (D)的最大團簇中心性(MCC)最高的前10個樞紐通路網(wǎng)絡(luò)(節(jié)點間的邊表示Jaccard相似性系數(shù);節(jié)點的顏色和大小分別代表路徑的p值和路徑中基因的數(shù)量错览。)

由于不同KEGG信號通路可能共享相同的DEGs，因此引入Jaccard相似性系數(shù)煌往，根據(jù)共享DEGs的比例計算兩條信號通路之間的距離(表S3)倾哺。獲得上調(diào)和下調(diào)DEGs的KEGG通路網(wǎng)絡(luò)轧邪。然后，使用CytoHubba軟件識別網(wǎng)絡(luò)中的樞紐通路羞海。在表達上調(diào)的DEGs富集的信號通路中忌愚，排在前5位的hub信號通路是代謝通路、脂肪酸降解却邓、纈氨酸硕糊、亮氨酸和異亮氨酸降解、色氨酸代謝和賴氨酸降解(圖4C和表1)腊徙。在表達下調(diào)的DEGs富集的信號通路中简十，排在前5位的樞紐信號通路是C型凝集素受體信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路撬腾、NOD樣受體信號通路螟蝙、凋亡和toll樣受體信號通路(圖4D和表2)。此外民傻，22個DEGs被映射到脂肪酸降解的KEGG通路胰默，這是第一個從上調(diào)DEGs富集的樞紐信號通路(圖4C和表S2)。在從下調(diào)的DEGs富集的核心信號通路中漓踢，有47個DEGs被映射到MAPK信號通路初坠，這是核心通路中的第一個(圖4D和表S2)。

纈氨酸彭雾、亮氨酸和異亮氨酸降解、脂肪酸降解锁保、色氨酸代謝和賴氨酸降解等樞紐通路共有11個上調(diào)的樞紐DEGs(圖5A)薯酝。在這些核心DEGs中，有8個上調(diào)至少1倍爽柒，包括aldh2.1吴菠、CABZ01032488.1、acads浩村、aldh2.2做葵、hadh、ehhadh和ehhadh(圖5B)心墅。此外酿矢，C型凝集素受體信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路怎燥、NOD樣受體信號通路瘫筐、凋亡和toll樣受體信號通路等樞紐通路共有14個樞紐下調(diào)的DEGs(圖5C)。在這些核心DEGs中铐姚，有8個被下調(diào)至少1倍策肝，包括il1b、nfkbiaa、tnfa之众、hrasb拙毫、nfkb1、oik3ca棺禾、traf2b和rhoab(圖5D)缀蹄。

圖5 確定了樞紐通路中的樞紐基因。從上調(diào)的DEGs中富集到前4個核心通路的11個核心基因的網(wǎng)絡(luò)(A)帘睦。從下調(diào)的DEGs中富集到前5個核心通路的14個核心基因的網(wǎng)絡(luò)(C)袍患。從下調(diào)的核心基因的網(wǎng)絡(luò)(D)。edge代表(A,C)中路徑對應(yīng)的基因竣付。

DEGs的GO富集分析

利用KOBAS對差異表達基因進行GO富集分析诡延。從上調(diào)的DEGs中富集出133個GO項，其中與生物過程相關(guān)的GO項58個古胆，與細胞成分相關(guān)的GO項15個肆良，與分子功能相關(guān)的GO項60個(表S4)。此外逸绎，從下調(diào)的DEGs中富集出238個GO項惹恃，其中與生物過程相關(guān)的GO項117個，與細胞成分相關(guān)的GO項30個棺牧，與分子功能相關(guān)的GO項91個(表S4)巫糙。

采用在線軟件REVIGO (version 1.8.1)進行富集分析，獲得具有代表性的GO術(shù)語颊乘。在生物學(xué)過程中参淹，表達上調(diào)的DEGs富集的代表GO項包括脂肪酸β-氧化(GO:0006635)、細胞對雌激素刺激的反應(yīng)(GO:0071391)乏悄、胚胎造血(GO:0035162)浙值、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(GO:0006869)和突觸囊泡胞出的調(diào)節(jié)(GO:2000300)。在分子功能上檩小，由上調(diào)的DEGs富集的代表性GO項包括蹩牛基輔酶A脫氫酶活性(GO:0003995)、脂肪-豕媲螅基輔酶A結(jié)合(GO:0000062)筐付、酰基甘油脂肪酶活性(GO:0047372)阻肿、鐵離子結(jié)合(GO:0005506)家妆、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運活性(GO:0005319)和乙酰輔酶AC-酰基轉(zhuǎn)移酶活性(GO:0003988)(圖6A)冕茅。

圖6 GO富集分析代表性項的條形圖伤极。使用REVIGO工具蛹找，上調(diào)的DEGs (A)和下調(diào)的DEGs (B)的GO項被降低，并顯示在條形圖中哨坪。代表性GO術(shù)語的不同方面用不同的顏色表示庸疾。BP:生物過程;MF:分子功能;CC:細胞成分。

下調(diào)DEGs富集的代表性生物學(xué)過程包括對細菌的防御反應(yīng)(GO:0042742)当编、糖酵解過程(GO:0006096)届慈、氨基酸轉(zhuǎn)運(GO:0006865)、金屬離子轉(zhuǎn)運(GO:0030001)和JNK級聯(lián)的正調(diào)控(GO:0046330)忿偷。代表性的細胞成分包括中間絲狀體(GO:0005882)金顿、NADPH氧化酶復(fù)合物(GO:0043020)、頂端質(zhì)膜(GO:0016324)鲤桥、雙細胞緊密連接(GO:0005923)和自噬體膜(GO:0000421)揍拆。代表性分子功能包括l-氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運活性(GO:0015179)、蛋白酪氨酸激酶活性(GO:0004713)茶凳、腫瘤壞死因子受體結(jié)合活性(GO:0005164)嫂拴、配體門聯(lián)鈣通道活性(GO:0099604)和金屬肽酶活性(GO:0008237)(圖6B)。

過度喂養(yǎng)上調(diào)斑馬魚肝臟脂肪酸代謝基因和下調(diào)葡萄糖代謝基因

通過對OF斑馬魚肝臟中DEGs的分析贮喧，過度喂養(yǎng)影響的主要信號通路為脂肪酸和葡萄糖代謝(圖7)筒狠。

圖7 過量攝食組肝臟脂肪酸代謝和葡萄糖代謝信號通路上調(diào)和下調(diào)基因示意圖。斜體和紅色的字母代表上調(diào)基因箱沦，斜體和綠色的字母代表下調(diào)基因辩恼。

在上調(diào)的DEGs中，有16個DEGs參與脂肪酸代謝信號通路谓形。其中灶伊，plin1上調(diào)14倍，編碼一種主要附著在脂滴表面的脂滴相關(guān)蛋白套耕。其他15個DEGs主要參與脂肪酸跨膜轉(zhuǎn)運(fabp10b、slc27a2a)峡继、脂肪酸β -氧化(hacd2冯袍、acaa1、acaa2碾牌、acadl康愤、acadm、acads舶吗、acadvl征冷、echs1)、酮體生成(hmgcl)誓琼、膽固醇轉(zhuǎn)移(scp2a检激、cetp)肴捉、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(cpt2)和乙酰輔酶a合成酶(acsf2)等過程(圖7和圖S3，以及表3)叔收。

此外齿穗，下調(diào)的DEGs中有13個與糖代謝信號通路相關(guān)。下調(diào)倍數(shù)變化最大的兩個DEGs是hk2(下調(diào)6倍)和gyg1b(下調(diào)8倍)饺律。這些下調(diào)的DEGs主要參與糖酵解(hk1, hk2, pfkla, pfkpb, aldoaa, aldocb, gapdhs, eno1a, eno1b, pkma)和糖原生成(gys1, gsk3bb, gyg1b)窃页。此外副渴，一個參與糖原分解的DEG (pygl)被上調(diào)2.5倍(圖7侦香，圖S4和表4)。這些結(jié)果表明蘑拯，OF斑馬魚的肝細胞中葡萄糖含量降低巧颈，葡萄糖攝取受阻畦木。

綜上所述，OF斑馬魚肝臟脂肪酸代謝活性增強洛二，而葡萄糖代謝活性受到抑制馋劈，說明OF斑馬魚肝臟的能量供應(yīng)來源已經(jīng)從葡萄糖代謝轉(zhuǎn)向脂肪酸代謝，這與T2DM的生理現(xiàn)象是一致的晾嘶。

討論

T2DM的主要特征是胰島素抵抗和代償性胰島素分泌不足妓雾，導(dǎo)致血糖水平升高。胰島素抵抗是指肝臟垒迂、肌肉和脂肪組織對胰島素的反應(yīng)性降低械姻，從而導(dǎo)致高血糖、血脂異常机断、內(nèi)臟型肥胖和炎癥因子升高等癥狀楷拳。T2DM早期血液中胰島素水平升高，然而吏奸，長期的葡萄糖刺激會對胰島β細胞產(chǎn)生毒性欢揖，導(dǎo)致糖尿病后期的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細胞凋亡，導(dǎo)致β細胞合成和分泌胰島素的能力下降奋蔚，從而導(dǎo)致血漿中胰島素水平下降她混。糖尿病患者常伴有血清膽固醇和甘油三酯升高。因此泊碑，可以通過測定血清中的甘油三酯水平坤按、膽固醇含量和葡萄糖耐量來評估胰島素抵抗。本研究中馒过，雄性斑馬魚經(jīng)過1個月的過度喂養(yǎng)后臭脓，體長、體重腹忽、條件因子指數(shù)来累、空腹血糖水平以及血清甘油三酯和膽固醇含量均顯著高于對照組砚作，表明我們成功建立了過度喂養(yǎng)的T2DM斑馬魚模型。

T2DM模型的建立主要是通過破壞組織對胰島素的敏感性佃扼，導(dǎo)致葡萄糖吸收受損偎巢，從而導(dǎo)致血糖水平升高。將成年斑馬魚交替浸泡在水或2%葡萄糖溶液中28-30天兼耀，誘導(dǎo)空腹血糖水平升高压昼、視網(wǎng)膜損傷和骨細胞功能受損。3 hpf(受精后小時)至5 dpf(受精后天數(shù))的斑馬魚幼魚交替浸泡在4%和5%葡萄糖溶液中可誘發(fā)糖尿病樣視網(wǎng)膜病變瘤运。斑馬魚浸泡在逐漸增加的葡萄糖溶液中——50毫米葡萄糖溶液浸泡4天窍霞，100毫米葡萄糖溶液浸泡3天，200毫米葡萄糖溶液浸泡13天——表現(xiàn)出體重增加和血糖水平升高的癥狀拯坟。成年斑馬魚在111 mM的葡萄糖溶液中浸泡14天后但金，其血糖水平升高，眼部糖化蛋白的數(shù)量也增加郁季，但肌肉中胰島素受體的轉(zhuǎn)錄水平下降冷溃，對外源胰島素的反應(yīng)受損。

超重或肥胖也是T2DM發(fā)生發(fā)展的重要因素;因此梦裂，在斑馬魚中建立糖尿病模型的另一種方法是通過過度喂養(yǎng)或高脂喂養(yǎng)似枕。成年斑馬魚過量食用市售魚食可表現(xiàn)出糖尿病癥狀，如葡萄糖耐量降低和胰島素表達減少年柠。用10%膽固醇喂養(yǎng)斑馬魚并同時將其浸泡在2%葡萄糖溶液中19天凿歼，會導(dǎo)致斑馬魚幼魚出現(xiàn)更多的糖尿病癥狀，如胰島素冗恨、胰高血糖素答憔、葡萄糖、甘油三酯和膽固醇水平顯著升高掀抹。在肥胖個體中虐拓，脂肪組織釋放更多的非酯化脂肪酸、甘油傲武、激素蓉驹、促炎細胞因子等因子。這些因素可誘發(fā)胰島素抵抗谱轨，加速胰腺損傷戒幔，最終導(dǎo)致T2DM吠谢。此外土童，脂肪組織中的胰島素抵抗可導(dǎo)致線粒體功能障礙，導(dǎo)致ROS和炎性細胞因子的產(chǎn)生工坊，以及脂肪因子献汗、細胞因子敢订、趨化因子、過多的脂質(zhì)和毒性脂質(zhì)代謝物釋放到血流中罢吃。這些物質(zhì)進一步加劇其他組織的胰島素抵抗楚午。此外，肝組織中的胰島素抵抗導(dǎo)致脂肪酸在肝臟中的蓄積增加尿招。在之前的研究中矾柜，我們分析了過量進食斑馬魚的肝臟和胰腺的基因表達譜，并揭示了人類T2DM的共同通路就谜。在本研究中怪蔑，我們發(fā)現(xiàn)過量喂養(yǎng)的雄性斑馬魚在空腹血糖水平升高的同時，肝臟內(nèi)大量脂滴聚集丧荐。高脂飲食喂養(yǎng)小鼠表現(xiàn)為糖耐量受損缆瓣、胰島素抵抗、體質(zhì)量增加虹统、血漿和肝臟甘油三酯水平升高弓坞、肝臟脂肪變性。在本研究中车荔，這些特征在雄性斑馬魚過度喂養(yǎng)4周后被觀察到渡冻。然而，過度喂養(yǎng)導(dǎo)致糖尿病的分子基礎(chǔ)仍不清楚夸赫。因此菩帝，我們進一步進行了轉(zhuǎn)錄組分析，以研究過度喂養(yǎng)斑馬魚肝臟中的新變化茬腿。

在過度喂養(yǎng)4周后呼奢，雄性斑馬魚的空腹血糖水平顯著升高，而雌性斑馬魚即使在過度喂養(yǎng)8周后切平，空腹血糖水平也沒有顯著變化握础。世界范圍內(nèi)的差異性研究也發(fā)現(xiàn)糖尿病的發(fā)病率存在性別差異，男性發(fā)病率高于女性悴品≠髯郏可以推測，其原因可能是雌激素過多導(dǎo)致女性胰島素抵抗的可能性更大苔严。

需要進一步的研究來揭示雌激素和睪酮在糖尿病男女性別差異中的作用機制定枷。

肝臟中多余的脂肪酸需要通過β-氧化消耗或轉(zhuǎn)化為膽固醇或甘油三酯，然后通過載脂蛋白轉(zhuǎn)運到身體的其他部位届氢。肝臟中過量的甘油三酯和膽固醇被包裝在脂滴中欠窒。Perilipin 1由plin1表達，是一種主要附著在脂滴表面的脂滴相關(guān)蛋白退子。其功能包括增加脂滴大小和調(diào)節(jié)甘油三酯水平岖妄。在這項研究中型将，我們發(fā)現(xiàn)這個基因在過度喂養(yǎng)的斑馬魚的肝臟中表達上調(diào)了14倍。

此外荐虐，我們發(fā)現(xiàn)從脂肪酸轉(zhuǎn)運到脂肪酸β氧化的整個代謝過程中的多個其他基因顯著上調(diào)七兜。例如，基因slc27a2a和fabp10b分別上調(diào)2.9倍和2.8倍福扬。slc27a2a基因編碼長鏈脂肪跬笾基輔酶a合成酶家族的一個成員，參與脂質(zhì)生物合成和脂肪酸降解铛碑。fabp10b編碼脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)恬惯，主要促進脂肪酸的攝取、細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運和代謝亚茬。將脂肪酸類從細胞膜轉(zhuǎn)運到其代謝部位以進行β-氧化和甘油三酯類和磷脂類的合成酪耳。因此，在過量喂養(yǎng)的雄性斑馬魚中刹缝，slc27a2a和fabp10b的上調(diào)可以促進脂肪酸從細胞外到細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運碗暗。固醇載體蛋白2a (scp2a)主要調(diào)控細胞內(nèi)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運，促進外源性脂肪酸合成甘油三酯和膽固醇梢夯。膽固醇酯轉(zhuǎn)運蛋白(cetp)的主要功能是轉(zhuǎn)運膽固醇酯和甘油三酯言疗，調(diào)節(jié)膽固醇的反向轉(zhuǎn)運，將外周組織中多余的膽固醇轉(zhuǎn)運到肝臟進行代謝和消化颂砸。在本研究中噪奄，我們發(fā)現(xiàn)這兩個基因在過度喂養(yǎng)的斑馬魚肝臟中的表達分別上調(diào)了2.3倍和2.1倍。

上調(diào)DEGs的KEGG富集分析結(jié)果中人乓，有5條與脂肪酸代謝相關(guān)的信號通路勤篮。KEGG富集結(jié)果中最重要的樞紐通路為脂肪酸降解和脂肪酸代謝。與脂肪酸降解和代謝相關(guān)的核心基因為hadh色罚、ehhadh碰缔、acat1、hadhaa戳护、acads和echs1金抡。其中，上調(diào)最多的基因是acads腌且，其編碼豕８危基CoA脫氫酶，參與脂肪酸β-氧化的第一步铺董。這些樞紐基因可作為糖尿病早期診斷的潛在分子標志物巫击。在上調(diào)的DEGs的GO富集分析中，代表性的GO項為脂肪酸β-氧化，包含13個原始GO項喘鸟。進一步分析發(fā)現(xiàn)，這些上調(diào)的基因主要參與脂肪酸轉(zhuǎn)運驻右、脂肪酸氧化和膽固醇轉(zhuǎn)運什黑。

過量喂養(yǎng)的斑馬魚肝臟中acsf2和cpt2的表達水平分別上調(diào)2.5倍和2.7倍。長鏈脂肪酸首先需要蹩柏玻基輔酶a合成酶家族成員2 (acsf2)催化成蹉蛋眩基輔酶a，然后通過肉堿棕櫚跎基轉(zhuǎn)移酶2 (cpt2)轉(zhuǎn)移到線粒體內(nèi)膜恨豁。經(jīng)過多次酶催化反應(yīng)，長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶a爬迟，進入三羧酸循環(huán)氧化橘蜜。此外，過量喂養(yǎng)斑馬魚肝臟中參與脂肪酸β-氧化的多種酶基因顯著上調(diào)付呕，包括跫聘＃基輔酶a脫氫酶(acadvl, acadl, acadm, acads)、烯丙基輔酶a水合酶(echs1)徽职、3-羥基輔酶a脫氫酶(hacd2)和β-酮硫酶(acaa1, acaa2)象颖。脂肪酸β-氧化的產(chǎn)物乙酰輔酶a可進一步轉(zhuǎn)化為酮體，并轉(zhuǎn)運到其他組織姆钉，為機體提供能量[58]说订。由hmgcl編碼的HMG-CoA裂解酶在生酮過程中起重要作用，該基因在過量喂養(yǎng)的糖尿病斑馬魚肝臟中上調(diào)1.6倍潮瓶。脂肪酸β-氧化主要受PPARα信號通路調(diào)控[59]陶冷。我們發(fā)現(xiàn)PPARα通路已從上調(diào)基因中顯著富集，并且過量喂養(yǎng)的斑馬魚肝臟中有15個上調(diào)的deg被定位到該信號通路上毯辅。以上數(shù)據(jù)表明埃叭，過量攝食可以促進斑馬魚肝臟脂肪酸代謝。這些與脂肪酸代謝相關(guān)的基因的上調(diào)導(dǎo)致線粒體代謝負擔(dān)增加悉罕，導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生和線粒體功能障礙赤屋。線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激在很大程度上與T2DM有關(guān)。

細胞內(nèi)葡萄糖的代謝主要通過糖酵解進行壁袄。然而类早，與糖酵解相關(guān)的基因在過度喂養(yǎng)的斑馬魚肝臟中的表達水平顯著下調(diào)。這些酶主要包括己糖激酶(hk1嗜逻、hk2)涩僻、磷酸果糖激酶(pfkla、pfkpb)、果糖二磷酸醛縮酶(aldoaa逆日、aldocb)嵌巷、甘油醛磷酸脫氫酶(gapdhs)、烯醇化酶(eno1a室抽、eno1b)和丙酮酸激酶(pkma)搪哪。編碼糖原合成相關(guān)蛋白的基因gyg1b、gsk3bb和gys1在過度喂養(yǎng)的斑馬魚的肝臟中顯著下調(diào)坪圾。gyg1b編碼一種具有葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性的糖原蛋白晓折，其表達減少6倍，其催化產(chǎn)物為糖原合成酶的底物兽泄。gys1基因編碼糖原合酶漓概，在過度喂養(yǎng)的斑馬魚的肝臟中下調(diào)1.6倍。激活糖原合成酶的糖原合成酶激酶(gsk3bb)下調(diào)2.6倍病梢。然而胃珍，催化糖原分解的基因pygl在過度喂養(yǎng)的斑馬魚的肝臟中上調(diào)了2.5倍，表明過度喂養(yǎng)導(dǎo)致肝細胞葡萄糖含量降低和葡萄糖攝取受損蜓陌。

本研究通過轉(zhuǎn)錄組鑒定了斑馬魚肝臟中的4個胰島素受體亞單位(irs1, irs2a, irs2b, irs4a)和2個胰島素受體(insra, insrb)堂鲜。其中irs1、insra表達上調(diào)护奈，irs2a缔莲、irs2b、irs4a霉旗、insrb表達下調(diào)痴奏。然而，這6個基因的倍數(shù)變化均小于1.5厌秒，并且在統(tǒng)計學(xué)上不顯著(p值> 0.05)(表S5)读拆。據(jù)報道，胰島素受體磷酸化的降低對胰島素抵抗細胞中胰島素信號通路的阻斷是重要的鸵闪。胰島素受體雜合子缺失的小鼠具有正常的葡萄糖和胰島素耐受性檐晕。這些研究表明胰島素受體的磷酸化在胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中比胰島素受體表達水平的改變起著更重要的作用。此外蚌讼，過去幾年的大量研究表明辟灰，肝內(nèi)脂滴的形成以及膽固醇和甘油三酯含量的增加與胰島素抵抗相關(guān)。在本研究中篡石，過量喂養(yǎng)的斑馬魚肝臟中出現(xiàn)了脂滴的過度積累和甘油三酯和膽固醇水平的升高芥喇，在一定程度上說明了胰島素抵抗的發(fā)生。

綜上所述凰萨，我們利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)分析技術(shù)继控，揭示了過量飲食斑馬魚肝臟中與脂肪酸和葡萄糖代謝相關(guān)的信號分子的變化械馆。過量喂養(yǎng)的雄性斑馬魚表現(xiàn)出脂肪酸代謝增強和葡萄糖代謝抑制，提示胰島素抵抗和糖尿病的發(fā)生武通。

結(jié)論

本研究通過過度喂養(yǎng)建立斑馬魚糖尿病模型霹崎。與對照組相比，過度喂養(yǎng)4周后斑馬魚的體長冶忱、體重和條件因子指數(shù)均顯著增加尾菇。空腹血糖水平明顯升高朗和，肝臟內(nèi)大量脂滴積聚。血清和肝臟中甘油三酯和膽固醇含量也顯著升高簿晓。通過對過度喂養(yǎng)斑馬魚肝臟的轉(zhuǎn)錄組測序眶拉，我們發(fā)現(xiàn)16個上調(diào)的DEGs在脂肪酸代謝的信號通路中發(fā)揮作用，包括脂肪酸轉(zhuǎn)運憔儿，脂肪酸氧化和酮生成忆植。此外，13個下調(diào)的DEGs參與了糖代謝信號通路中的糖酵解和糖生成谒臼，表明過量喂養(yǎng)雄性斑馬魚的胰島素抵抗和葡萄糖進入肝細胞的抑制朝刊。這些發(fā)現(xiàn)闡明了過度喂養(yǎng)導(dǎo)致斑馬魚糖尿病的分子基礎(chǔ)，為進一步研究斑馬魚糖尿病的發(fā)病機制和治療奠定了基礎(chǔ)蜈缤。

基金：這項研究得到了國家重點研發(fā)計劃項目(2018YFA0800503)拾氓、廣東省科學(xué)院建設(shè)國內(nèi)一流科研機構(gòu)項目(2021GDASYL-20210103024)、中國科學(xué)院科技發(fā)展計劃項目(2022gdaszhh -2022010202)底哥、廣東省科學(xué)院專項基金項目(2021GDASYL-20210102003)咙鞍、國家自然科學(xué)基金項目(31871463和31571504)的支持。

原文：Ge G, Ren J, Song G, et al. Transcriptome Analysis Reveals the Molecular Basis of Overfeeding-Induced Diabetes in Zebrafish[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2023, 24(15): 11994.

原文地址：https://doi.org/10.3390/ijms241511994

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