雜志：Frontiers in Endocrinology

影響因子：5.2（2023）

年份：2022

通訊作者：Jie Liu通砍、 Mingyu Li

摘要

背景：據(jù)報道，孤兒核受體Nur77參與多種代謝過程烤蜕，包括碳水化合物代謝和脂質代謝封孙。然而，Nur77在代謝途徑調控中的具體機制仍需進一步研究讽营。

方法：在本研究中虎忌，我們通過CRISPR/Cas9技術構建了nur77敲除斑馬魚模型，然后對野生型和nur77缺失斑馬魚進行了全生物體RNA測序分析橱鹏，剖析了代謝相關通路的遺傳變化膜蠢。

結果：我們發(fā)現(xiàn)，許多涉及氨基酸莉兰、脂質和碳水化合物代謝的基因發(fā)生了兩倍以上的變化挑围。此外，我們發(fā)現(xiàn)nur77突變體表現(xiàn)出總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)增加糖荒，總氨基酸改變以及葡萄糖升高杉辙。我們還證明，葡萄糖升高不是由于葡萄糖攝取的改變捶朵，而可能是由糖酵解/糖異生障礙和β細胞功能受損引起的蜘矢，包括insb表達下調、β細胞質量減少和胰島素分泌抑制综看。

結論：重要的是品腹，我們還驗證了β細胞中Nur77的靶向表達足以挽救全球Nur77幼魚斑馬魚的β-細胞缺陷。這些結果為Nur77信號調節(jié)的全球代謝網(wǎng)絡以及Nur77在β細胞功能中的作用提供了新的信息红碑。

關鍵詞：Nur77舞吭，斑馬魚，轉錄組學句喷，β細胞镣典，脂質代謝，葡萄糖代謝唾琼。

前言

核受體Nur77兄春，也被稱為TR3、NR4A1锡溯、NGFI-B赶舆、NAK1或TIS1哑姚，屬于核受體超家族的NR4A亞家族。Nur77是一種早期即時反應基因芜茵，可被多種生理分子和刺激誘導叙量，包括細胞因子、生長因子九串、神經(jīng)遞質绞佩、應激、葡萄糖和脂肪酸猪钮。它在細胞增殖品山、分化、炎癥烤低、免疫肘交、凋亡和代謝中起著多效作用。

最近扑馁，越來越多的研究表明Nur77是控制葡萄糖和亞麻酸穩(wěn)態(tài)的關鍵調節(jié)因子涯呻。Nur77表達于多種代謝相關組織，如骨骼肌腻要、肝臟复罐、胰腺和脂肪。在骨骼肌細胞中闯第，與能量代謝相關的基因和蛋白表達減少市栗。Nur77的過度表達導致葡萄糖轉運、胰島素信號(如Glut4)咳短、糖酵解和糖原分解相關基因的顯著增加贞言。Nur77過表達可以增強葡萄糖轉運隶症，并通過調節(jié)小鼠糖酵解改變肌肉質量和肌纖維大小嗡善。高脂肪喂養(yǎng)的Nur77?/?小鼠表現(xiàn)出代謝變化碱璃，如能量消耗減少、胰島素抵抗勾效、血糖清除率降低和骨骼肌脂質含量增加嘹悼。

不僅在骨骼肌中，Nur77在肝臟中也起著類似的代謝作用层宫。Nur77的高表達驅動肝臟葡萄糖生成杨伙，提高血糖水平，并誘導參與糖異生的基因萌腿。高脂肪喂養(yǎng)的Nur77缺失小鼠也表現(xiàn)出肝臟葡萄糖生成減少和肝臟胰島素抵抗限匣。Nur77激動劑，如胞孢素B (CsnB)毁菱，可以提高小鼠的血糖米死。Nur77還參與肝臟脂質代謝的調節(jié)锌历。在功能獲得方法中，肝臟過表達Nur77通過抑制甾醇調節(jié)元件結合蛋白lc (SREBPIc)和改變其他脂質酶基因表達來降低肝臟甘油三酯峦筒。高脂肪喂養(yǎng)的Nur77缺失小鼠表現(xiàn)出肝臟脂肪變性上調和肝臟脂肪生成基因高表達水平究西。

在脂肪組織中，Nur77在肥胖和糖尿病小鼠的脂肪細胞中的表達水平明顯降低物喷。Nur77對脂肪細胞前體細胞的脂肪分化卤材、脂質積累和脂肪形成也有負調控作用。缺乏nur77的小鼠對高脂肪飲食(HFD)誘導的肥胖表現(xiàn)出更高的易感性脯丝，因此觀察到更高的體重和脂肪量商膊。真正重要的是伏伐，celastrol雷公藤紅素顯著降低了體重宠进，脂肪組織質量，以及由nur77缺陷小鼠抑制的HFD引起的脂肪細胞的大小藐翎。

最近材蹬，研究人員研究了Nur77在胰腺β細胞中的重要作用。Nur77通過減輕內質網(wǎng)(ER)應激和氧化應激誘導的凋亡來保護胰腺β細胞吝镣。相反堤器，葡萄糖和棕櫚酸鹽誘導Nur77在胰腺β-細胞系、Ins-1和MIN6中的表達末贾。Nur77表達水平升高會降低細胞內胰島素含量闸溃，葡萄糖刺激的胰島素分泌對β細胞有害。

因此拱撵，Nur77在調節(jié)關鍵代謝組織的脂質和碳水化合物代謝中具有重要作用辉川。一些小分子，如CsnB和celastrol拴测，已被改進為在nur77依賴途徑中調節(jié)代謝乓旗。這些研究表明，新的nur77靶向藥物在治療代謝性疾病集索、肥胖屿愚、血脂異常和心血管疾病方面可能具有巨大的潛力。

適當?shù)暮Y選模型對藥物開發(fā)至關重要务荆。斑馬魚的基因同源性高妆距，幾個器官的發(fā)育與人類相似。便于獲得充足的胚胎和幼魚函匕，用于全球系統(tǒng)研究和藥物篩選娱据。雖然組學研究已經(jīng)應用于Nur77 mice，但整個動物轉錄組浦箱，特別是代謝改變仍然不清楚吸耿。在目前的研究中祠锣，我們首先生成了nur77基因敲除的斑馬魚，并利用整個斑馬魚幼魚進行了RNA測序(RNA- seq)分析咽安。轉錄組結果可以讓我們對缺乏nur77時基因表達的改變有一個全局的認識伴网。我們的目標是闡明nur77斑馬魚的綜合代謝改變。此外妆棒，nur77敲除突變系應該有助于nur77相關代謝調節(jié)的進一步機制研究和藥物篩選澡腾。

方法與試劑

斑馬魚(Danio rerio)在循環(huán)水培養(yǎng)系統(tǒng)(上海海升生物技術有限公司，上海糕珊，中國)中培養(yǎng)动分，水溫28℃，光照14h红选，黑暗10h澜公。胚胎從自然培養(yǎng)中獲得，按照Kimmel等人的方法在28.5°C的胚胎培養(yǎng)基中培養(yǎng)喇肋。本研究以AB株坟乾、nur77突變體斑馬魚、Tg(gega:GFP)蝶防、Tg(Ins:H2BmCherry)(41)和(Tg Ins:GCaMP6s: eGFP)轉基因系為研究對象甚侣。所有程序均已廈門大學動物護理與利用委員會(協(xié)議號:No. 539)批準。2016年3月10日XMULAC20160089號)间学。

利用CRISPR/Cas9技術建立nur77基因敲除斑馬魚

利用CRISPR/Cas9技術對斑馬魚胚胎進行基因組編輯殷费。利用在線工具CRISPRscan設計sgRNA靶點(CCGGGCAGCTGGACTCCTTC)。用T7試劑盒(MAXIscript T7 Transcription kit, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)合成sgRNA低葫，用RNA純化試劑盒(RNA Clean and Concentrator-5, Zymo Research, Irvine, CA, USA)純化sgRNA详羡。然后將sgRNA和Cas9蛋白(NEB，中國北京)共注射到單細胞期胚胎中氮采。提取胚胎基因組DNA殷绍，評估基因組編輯效率。采用聚合酶鏈反應(PCR)擴增CRISPR靶位點周圍的基因組區(qū)域鹊漠，電泳凝膠圖像檢測突變位點(引物序列5′~ 3′端為ECTCCCTCTTCAGCTCAGAGTTTCT主到， R：TGCAGATGCCGGACTTCCA)。將突變體FO代培養(yǎng)至性成熟躯概，與AB型斑馬魚交配獲得Fl代登钥。提取Fl代的基因組DNA，通過PCR擴增CRISPR靶位點周圍的基因組區(qū)域娶靡，測序得到13 bp基因(突變序列ACCTCCGGGCAGC)的單突變斑馬魚牧牢。進一步雜交獲得nur77突變體的斑馬魚品系。

RNA提取，cDNA文庫制備和測序

使用TRIzol試劑(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA塔鳍，USA)從40只斑馬魚幼魚中提取總RNA伯铣，重復三次。為了去除任何基因組DNA污染轮纫，使用RQI RNase-Free DNase (Promega, Madison, WI腔寡，USA)純化RNA。每個樣品的濃度和質量由Agilent RNA6000納米試劑盒在Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies, Santa Clara, CA掌唾，USA)中測定放前。所有樣品的RNA質量分數(shù)(RIN/RQN)均為10。每個樣品的mRNA通過寡聚體(dT)珠選擇構建cDNA文庫糯彬。用N6隨機引物將總mRNA片段逆轉錄成雙鏈cDNA (Ds cDNA)凭语。合成的雙鏈cDNA經(jīng)過末端修復、5′端磷酸化和3′端腺苷化撩扒。然后將剪接連接到3'端腺苷酸cDNA片段似扔。將連接產(chǎn)物進行PCR擴增以豐富cDNA模板。將這些PCR產(chǎn)物變性后却舀，將單鏈DNA環(huán)化虫几，形成最終的cDNA文庫。所有cDNA文庫在BGISEQ-500RS平臺(華大基因挽拔，深圳，中國)上按照制造商的標準協(xié)議進行測序但校。

RNA序列數(shù)據(jù)的生物信息學分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)BGISEQ-500質控測試螃诅，使用SOAPnuke軟件過濾成干凈讀數(shù)。該過程丟棄含有適應序列的讀出状囱，含有未知堿基“N”大于10%的讀出术裸，以及低質量讀出(讀出中低質量堿基的百分比大于50%)。過濾后亭枷，將干凈的讀數(shù)與斑馬魚基因組(Danio rerio, GRzhll袭艺，http://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index)，使用HISat(v2.0.4)叨粘。經(jīng)過比較猾编，使用斑馬魚單基因清潔讀取的Bowtie2和RSEM (RNA-Seq by Expect Maximization)，通過使用fragments per kilobase per million (FPKM)方法(fragments per kilobase transcript/million測序片段)來量化基因表達升敲。此外答倡，在Ensembl (www.ensembl)中對一些未識別的基因進行了注釋。org)通過BLAST和Synteny分析驴党。這些序列數(shù)據(jù)存儲在NCBI數(shù)據(jù)庫中瘪撇，可通過BioProject ID: PRJNA801348。

差異表達基因分析

DESEQ2用于鑒定差異表達基因(DEGs)。將差異倍數(shù)為22.00且校正后p值為0.05的基因作為有統(tǒng)計學意義的DEG倔既。對于重復樣本恕曲，在變化倍數(shù)為22.00，概率為20.80的條件下渤涌，利用NOISEO計算每個基因在每次比較中的log2倍數(shù)變化(Log2FC)和概率码俩。利用基因本體論(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫進行通路富集分析。顯著富集的基因為q值為S0.001歼捏、FDR為s0.01的基因稿存。

定量RT-PCR

采用定量RT-PCR (qRT-PCR)技術對DEGs進行驗證。提取的RNA用寡核苷酸引物(dT) 和M-MLV (Promega)逆轉錄瞳秽，合成cDNA第一鏈瓣履。qRT-PCR反應在Agilent AriaMx系統(tǒng)(Agilent Technologies)中使用PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Science)進行。擴增程序為95℃10 s, 60℃30 s练俐，共40個循環(huán)袖迎。我們使用了三組野生型或nur77樣本，每個樣本在三個平行副本中進行測試腺晾。本實驗采用2?ΔΔCt法計算mRNA水平燕锥，以β-actin水平作為內參照，計算各基因相對于內參照的水平(倍數(shù))悯蝉。這些數(shù)據(jù)由每組3個生物樣本的平均值提供归形。qRT-PCR中使用的引物列于補充表S1中。

2-[N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1 3-Diazol-4-yl)氨基]-2-脫氧- d -葡萄糖(2-NBDG)攝取試驗

將受精后6天左右的斑馬魚幼魚(dpf)在含有600 μM 2NBDG (B6035, Apexbio, Houston, Texas, USA)的0.3倍Danieau溶液中孵育3小時鼻由，然后麻醉暇榴，立即在M205FCA顯微鏡(Leica, Wetzlar, Germany)下成像。最后蕉世，根據(jù)Lee et al.蔼紧，利用斑馬魚眼球晶狀體的熒光強度來指示葡萄糖攝取。

游離葡萄糖的測定游離葡萄糖

采用葡萄糖檢測試劑盒(Red glucose / glucose Oxidase Assay kit, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)測定狠轻。10只幼魚在100 ul樣品緩沖液中勻漿奸例，離心后吸收上清。按照生產(chǎn)廠家說明向楼，測定相當于1只幼魚(10 μl勻漿)的游離葡萄糖查吊。每個樣品至少有3個獨立的生物重復。

總膽固醇和總甘油三酯的測定

采用總膽固醇檢測試劑盒(A111-1蜜自，南京建成生物工程研究所)和甘油三酯檢測試劑盒(Al10-1-1菩貌，南京建成生物工程研究所)測定斑馬魚的總膽固醇。隨機選取30條6日齡斑馬魚幼魚從野生型(WT)和nur77?/?組中收集重荠。每組有3個獨立的生物重復序列箭阶⌒椴瑁總膽固醇根據(jù)試劑盒說明書測定總甘油三酯。

氨基酸測定

隨機收獲WT組和nur77組6dpf胚70個仇参，每組3個獨立的生物重復序列嘹叫。樣品在6 NHCl中冷凍干燥，110℃下水解24 h诈乒，加入蒸餾水調節(jié)體積至10 ml, 1 ml水解液用氮氣吹干罩扇，懸浮在1 ml 0.02 M HCl中。樣品重懸后怕磨，用0.22 um濾膜過濾喂饥，用日本千代田日立L8900氨基酸自動分析儀(千代田日立，東京肠鲫，日本)測定氨基酸組成员帮。幼魚體內的氨基酸以微克/毫克濕組織表示。

GCaMP6s圖像采集與分析

對分離的胰島進行GCaMP6s測定Tg (Ins: H2BmCherry);Tg(Ins:GCaMP6s)和nur77?/?;Tg (Ins:H2BmCherry);Tg(Ins:GCaMP6s)轉基因動物在6dpf导饲。將分離的胰島分別包埋于含5和20 mM葡萄糖的細胞外液(ECS)中捞高。利用Leica SP8對葡萄糖刺激的Ca2+內流進行成像，并通過Image J進行分析渣锦。

β細胞計數(shù)

在4°C的4%多聚甲醛中過夜固定后硝岗，用1倍PBS加0.1% Tween-20 (PBST)洗滌，并在Aqua-Mount (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI, USA)中平裝袋毙，使其右側面向蓋蓋型檀。將幼魚壓平，只是為了稍微破壞胰島娄猫，以便更好地分辨β細胞贱除。根據(jù)mCherry信號，使用x40透鏡下的蔡司Axiolmager或x40透鏡下的蔡司LSM710共聚焦投影(Carl Zeiss, Oberkohen, baden-Wurberg, Germany)對β細胞計數(shù)媳溺。

胰島素免疫熒光染色

將6 dpf左右的幼魚固定在4%多聚甲醛中，4℃過夜碍讯。經(jīng)沖洗悬蔽、脫水、再水合和丙酮處理后捉兴，將幼魚置于塊液(5% FBS in PBDT, 1倍PBS, 0.1% Tween-20, 1% DMSO)中室溫孵育2小時蝎困。本研究使用的一抗為抗胰島素(豚鼠，Dako A0564, 1:10 00在2% FBS PBDT中)倍啥，在4°C下過夜(O/N)禾乘。在PBDT中沖洗4倍10分鐘后，幼魚與二抗(山羊抗豚鼠虽缕，Invitrogen Al1075, 1:10 00在2% FBS PBDT中)在室溫下孵育2小時始藕。幼魚在Aqua-Mount中平裝，使用蔡司LSM710成像。

轉基因系的建立

Tg(Ins: Nur77;利用minitol2轉座子系統(tǒng)構建cmlc2:eGFP)轉基因細胞系伍派。使用多位點Gateway系統(tǒng)組裝轉基因江耀。擴增人Nur77 cDNA并亞克隆至pME-p5E-Ins、pME-Nur77和p3E-MCS诉植，然后組裝到pDestTol2-CG2目的載體中祥国，獲得Tg的最終轉基因(ins Nur77;cmlc2:eGFP)。cmlc2:EGFP元件用于轉基因載體的鑒定晾腔。Tg質粒(ins:Nur77;cmlc2:eGFP)與Tol2轉座酶mRNA(各25 ng/ul)混合舌稀，并使用描述的標準方案注射到單細胞期斑馬魚胚胎中。

采用PCR方法檢測Ins-Nur77-F:5'CCACCACCATATCCACCATT-3'Ins-Nur77-R:5'TCTTCTCCGCCCACTTGC-3'的eGFP表達灼擂。

統(tǒng)計分析

所有原始數(shù)據(jù)均采用GraphPad prism8軟件(GraphPad軟件壁查，La Jolla, CA, USA)進行分析。結果以均數(shù)SEM表示缤至。用于統(tǒng)計分析的數(shù)據(jù)集沒有排除離群值潮罪。統(tǒng)計采用單因素方差分析，然后進行Bonferroni事后檢驗或t檢驗(SPSS)领斥。P <0.05為顯著性嫉到。

敲除斑馬魚Nur77基因CRISPR/Cas9

在斑馬魚基因組中，只有一個與人類Nur77同源的基因月洛，我們將其命名為Nur77何恶。為了闡明Nur77在斑馬魚中的功能，我們利用CRISPR/Cas9技術生成了Nur77突變斑馬魚嚼黔。我們得到了一個穩(wěn)定的突變系细层，在nur77的外顯子上有13bp的缺失(圖1A)。該突變導致讀框移位和過早終止密碼子唬涧，破壞了Nur77蛋白的所有已知功能域(圖IA;補充圖S1)疫赎。qRT-PCR分析顯示nur77 mRNA水平在nur77斑馬魚中顯著降低(圖1B)。突變體mRNA水平的降低可能是由于無義介導的mRNA衰變碎节。然后捧搞，我們評估了nur7斑馬魚在不同發(fā)育階段的形態(tài)學變化。然而狮荔，在12胎撇、24、48殖氏、72和144 hpf階段晚树，野生型和nur77?/?斑馬魚之間沒有明顯的形態(tài)學表型差異(圖1C)。此外雅采，成年nur77在形態(tài)上正常且可受精(數(shù)據(jù)未顯示)爵憎。

圖1 利用CRISPR/Cas9敲除斑馬魚nur77基因慨亲。(A) Crispr-Cas9靶點和突變等位基因示意圖。Nur77由6個外顯子(帶框)組成纲堵。sgRNA目標外顯子1巡雨，目標區(qū)域的序列與所選等位基因對齊。目標位點用紅色字體表示席函，PAM位點用藍色字體表示铐望。獲得的nur77-/-斑馬魚突變體缺少13個bp堿基，導致蛋白質翻譯子過早停止茂附。(B)通過qRT-PCR分析驗證nur77的表達水平n=3);t檢驗P < 0.05正蛙。(C) 12、24营曼、48乒验、72、144 hpf發(fā)育階段WT和nur77-/-的形態(tài)蒂阱。比例尺表示750 μm锻全。

野生型和nur77?/?幼魚的轉錄組

為了進一步探索Nur77在斑馬魚中的功能，我們對6dpf野生型和nur77?/?幼魚的總RNA進行了高通量RNA測序(RNA-seq)录煤。這些樣本共產(chǎn)生2152萬(M)對總原始reads鳄厌，共檢測到25,9235個基因。平均基因定位率為73.3%(72.2%-74.5%)妈踊，基因唯一定位率在64.4% - 66.0%之間了嚎。主成分分析(PCA)表明，與野生型對照相比廊营，nur77-/-突變體數(shù)據(jù)集聚類明顯(圖2A)歪泳。使用調整后的值SD.001的2倍變化閾值來定義DEGs。比較兩種基因型發(fā)現(xiàn)580個DEGs露筒，其中nur77-/中190個上調呐伞，390個下調(圖2B;補充表S2)。所有差異表達基因均進行了GO功能注釋慎式，并被劃分為生物過程(BPs)荸哟、細胞組分(CCs)和分子功能(MFs) 3個主要功能類別∷膊叮“細胞過程”(20%)、“代謝過程”(14%)和“生物調節(jié)”(11%)是BPs涉及的主要項目(補充圖2A)舵抹》净ⅲ“細胞”(27%)、“膜”(20%)和“細胞器”(10%)是CCs的前3類(補充圖2B)惧蛹∩染龋“結合”(52%)和“催化活性”(26%)是MFs的主要亞類(補充圖2C)刑枝。為了更好地了解nur77?/?幼魚中go注釋的DEGs，我們將其中的580個DEGs進行了KEGG數(shù)據(jù)庫的經(jīng)典信號通路分析迅腔。如圖2C所示装畅，這些DEGs顯著富集于44條不同的信號通路，這些通路與代謝沧烈、人類疾病掠兄、生物系統(tǒng)、細胞過程锌雀、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理最為相關蚂夕。由于代謝相關通路最為豐富，Nur77已知在多種代謝相關和能量需求的組織和細胞器中表達腋逆，包括肝臟婿牍、骨骼肌、脂肪惩歉、心臟和大腦等脂。然后，我們在下面進一步分析了這些途徑撑蚌。

圖2 nur77-/-突變體斑馬魚RNA-seq (RNA測序)分析上遥，(A) 3個野生型和3個nur77-/-突變體RNA-seg數(shù)據(jù)集的主成分分析(PCA)圖，使用主成分1 (PC1)和主成分2 (PC2)進行分析锨并。(B)nur77-/-突變體和對照幼魚差異基因表達分析的火山圖露该，顯示了p值和對數(shù)褶變化之間的關系。紅色表示基因上調第煮，藍色表示基因下調解幼。(C)京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路中DEGs的富集分析。y軸表示途徑包警，x軸表示DEGs數(shù)量撵摆。

斑馬魚中Nur77的敲除受損的氨基酸代謝

對于氨基酸代謝腔呜，在10條氨基酸代謝通路中確定了10個DEGs(圖3A)突硝。為了進一步評估RNA-seq數(shù)據(jù)，我們采用qRT-PCR檢測了所選的氨基酸代謝相關基因(hadhaa, hmgcsl, aox5和ldha)棍郎。我們的qRT-PCR結果與RNA-seq數(shù)據(jù)一致(圖3B)壹瘟。在這10個DEGs中鲫剿，有4個參與了纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解(ko00280)(圖3C;補充表S3)稻轨，包括羥趿榱基CoA脫氫酶三功能多酶復合體亞單位α a (hadhaa)、羥甲基戊二酰CoA合成酶1 (hmgcs1)殴俱、乙醛脫氫酶家族9成員A1 (aldh9a1a.2)和乙醛氧化酶(aox5)政冻。hahaa是線粒體三功能蛋白的雙功能亞基枚抵，負責長鏈脂肪酸的線粒體b氧化。hmgesl催化HMG-CoA的合成明场。上述基因參與纈氨酸汽摹、亮氨酸和異亮氨酸的降解途徑，并參與這些氨基酸的生糖和生酮過程苦锨。

據(jù)我們所知逼泣，Nur77與氨基酸代謝之間的關系幾乎沒有報道。為了進一步檢測Nur77在氨基酸代謝中的作用逆屡，測定了整個幼魚的總氨基酸組成圾旨。如圖3D所示，纈氨酸(Val)魏蔗、亮氨酸(Leu)砍的、異亮氨酸(Ile)均降低。這三種氨基酸水平的降低可能與纈氨酸莺治、亮氨酸和異亮氨酸降解途徑中基因表達水平的降低有關(圖3C)廓鞠。此外，除了酪氨酸(Thr)谣旁、半胱氨酸(Cys)和精氨酸(Arg)之外床佳，我們測定的許多其他氨基酸均減少(圖3D)。所有這些數(shù)據(jù)表明榄审，在nur77?/?幼魚中氨基酸代謝失調砌们。

圖3 Nur77調節(jié)斑馬魚幼體的氨基酸代謝。(A)氨基酸代謝富集轉錄本熱圖搁进。顏色代表高(紅色)浪感、低(藍色)或平均(白色)的表達值，基于每個基因的z分數(shù)-每千堿基每百萬映射讀取(FPKM)值的歸一化片段饼问，z分數(shù)指標顯示在每個圖下影兽。右邊顯示的是折疊變化(log2)。(B)通過qRT-PCR分析驗證氨基酸代謝類別中差異表達基因的表達水平(n = 3)莱革。(C)纈氨酸峻堰、亮氨酸和異亮氨酸降解受到干擾。阻斷區(qū)代表轉錄編碼酶盅视。綠色塊代表下調的基因捐名，黑色塊代表未改變的基因。(D) WT和nur77-/-胚胎的氨基酸組成闹击。結果用均數(shù)表示桐筏，標準誤差n3): p<0.06;"p<0.01: p<0.001，經(jīng)t檢驗p<0.0001。

敲除Nur77損傷斑馬魚脂質代謝

11條脂質代謝途徑中的16個EDG被富集(補充表S4;圖4)梅忌。其中5個參與類固醇生物合成通路(ko00100)， 4個參與甘油脂代謝通路(ko00561)(補充表S4)除破。qRT-PCR分析結果與選定的脂質代謝基因(ugt5al牧氮、cyp2p9、hadhaa瑰枫、cyp51踱葛、sc5d、hmgcs1光坝、Iss尸诽、lipca和sqlea)一致(圖4B)。有趣的是盯另，所有參與膽固醇生物合成途徑的DGEs都下調了(圖4C)性含。角鯊烯環(huán)氧酶a (sqlea)催化膽固醇生物合成的第一個氧合步驟，并被認為是該途徑的限速酶之一鸳惯。甲基甾醇單加氧酶1 (msmol)在肝臟膽固醇生物合成中起作用商蕴。cyp51(固醇14a-去甲基化酶)作為一種細胞色素P450，對固醇的生物合成反應至關重要芝发，并在臨床中作為藥物靶點绪商。羊毛甾醇合成酶(Iss)催化(S)-2,3氧化角鯊烯轉化為羊毛甾醇，是膽固醇辅鲸、類固醇激素和維生素D生物合成中必不可少的限速酶格郁。甾醇- c5 -去飽和酶(sc5d)在膽固醇生物合成中將膽甾醇轉化為7脫氫膽固醇，在肝臟中普遍表達独悴。這些基因的所有改變表達都反映了膽固醇合成代謝的減少例书。

雖然有報道稱，喂食高脂肪飲食的Nur77缺失小鼠更容易肥胖绵患，并且Nur77在肝臟和肌肉的脂質代謝調節(jié)中具有重要作用雾叭，但脂質含量的全身變化尚不清楚。在這里落蝙，我們比較了野生型和nur77?/?幼魚之間的TC和TG含量织狐。nur77?/?幼魚的TC和TG顯著升高，如圖4D筏勒、E所示移迫。nur77?/?較高的膽固醇水平可能抑制了膽固醇的合成代謝，從而降低了膽固醇生物合成途徑基因的表達(圖4D)管行。綜上所述厨埋，這些數(shù)據(jù)表明Nur77敲除損害了斑馬魚的脂質代謝。

圖4 Nur77調節(jié)斑馬魚幼體的脂質代謝捐顷。(A)脂質代謝富集轉錄本熱圖荡陷。顏色代表高(紅色)雨效、低(藍色)或平均(白色)表達值，表達值基于每個基因的每千堿基每百萬映射讀取(FPKM)值的z評分歸一化片段废赞。Z-score指標顯示在每個圖譜的下方徽龟。折疊變化(log2)顯示在右邊。(B)通過gRT-PCR分析驗證脂質代謝類別中差異表達基因的表達水平(n=3)唉地。(C)受干擾的膽固醇生物合成据悔。阻滯區(qū)代表轉錄編碼酶。綠色塊代表下調的基因耘沼，黑色塊代表未改變的基因极颓。(D) WT和nur77-/-斑馬魚(n-3)的全身膽固醇(TC)含量。(E) WT和nur77-/-斑馬魚的全身總甘油三酯(TG)含量群嗤。結果用標準誤差的平均值表示(n=3);P <0.05, P <0.001, t檢驗p < 0.0001菠隆。

敲除Nur77會損害斑馬魚的碳水化合物代謝

在12個碳水化合物代謝途徑中有4個上調的deg和15個下調的deg參與(補充表S5;圖5 a)。我們選擇的碳水化合物代謝基因的qRT-PCR結果與RNA-seq數(shù)據(jù)一致(圖5B)骚烧。在富集的通路中浸赫，前2位為糖酵解/糖異生(ko00010)(9個基因)和胰高血糖素信號通路(ko04922)(6個基因)，均參與糖代謝(補充表S5)赃绊。在糖酵解/糖異生通路中既峡，所有DEGs的表達水平均降低，包括葡萄糖激酶(gck);丙酮酸激酶肌b (pkmb);磷酸果糖激酶碧查，肌a/b (pfkma/b);葡萄糖-6-磷酸異構酶b (gpib);乳酸脫氫酶A;磷酸甘油酸變位酶(pgam2)运敢、類乙酰輔酶a羧化酶(accl);乙醛脫氫酶9串聯(lián)重復序列2 (tandem duplicate 2, aldh9a1a.2);乙酰輔酶a羧化酶樣醛縮酶a、果糖二磷酸(aldoaa)(圖5C)忠售。Gck传惠、pkmb和pfkma/b是糖酵解/糖異生途徑中的關鍵酶。GCK是己糖激酶家族的一員稻扬，它在胰腺β細胞和肝細胞中磷酸化葡萄糖以產(chǎn)生葡萄糖-6-磷酸卦方。Pfkma /b是磷酸果糖激酶的一種異構體，通過糖酵解途徑將果糖-6-磷酸轉化為果糖-1,6-二磷酸泰佳。pkmb催化磷酸烯醇丙酮酸和ADP轉化為丙酮酸和ATP盼砍，這是糖酵解的最后一步。綜上所述逝她，這些數(shù)據(jù)揭示了斑馬魚的Nur77缺陷導致碳水化合物代謝紊亂浇坐，尤其是在葡萄糖代謝方面。

為了證實RNA-seq的數(shù)據(jù)黔宛，我們隨后測定了野生型和nur77?/?幼魚的總游離葡萄糖近刘。如圖5D所示，nur77?/?的葡萄糖水平顯著高于野生型。游離葡萄糖升高可能是由于糖酵解/糖異生障礙觉渴，葡萄糖攝取受損介劫，胰島素分泌減少。由于信號通路分析表明糖酵解/糖異生通路受損(圖5C)疆拘，因此我們進一步研究了nur77?/?斑馬魚的葡萄糖攝取功能蜕猫，并根據(jù)Lee等人進行了2-NBDG攝取測定。正如晶狀體的熒光強度所示哎迄，在nur77?/?組中，葡萄糖攝取沒有顯著增加(圖5E, F)隆圆。這些數(shù)據(jù)表明漱挚，較高水平的游離葡萄糖在nur77?/?幼魚不是由于葡萄糖攝取，但可能受到糖酵解/糖異生或β細胞功能的影響渺氧。

圖5 Nur77調節(jié)斑馬魚幼體的碳水化合物代謝旨涝。(A)碳水化合物代謝富集轉錄本的熱圖。顏色代表高(紅色)侣背、低(藍色)或平均(白色)表達值白华，表達值基于每個基因的每千堿基每百萬映射讀取(FPKM)值的z評分歸一化片段。Z-score指標顯示在每個圖譜的下方贩耐。折痕變化(og2)顯示在右側弧腥。(B)通過qRT-PCR分析驗證碳水化合物代謝(n-3)類別中差異表達基因的表達水平。(C)受干擾的糖酵解/糖異生潮太。塊表示轉錄編碼酶管搪。綠色塊代表下調的基因，黑色塊代表未改變的基因铡买。(D) WT和nur77-/-斑馬魚的總游離葡萄糖含量(n3)更鲁。(E)野生型和nur77-/-突變體幼魚2-NBDG葡萄糖攝取;葡萄糖攝取水平由熒光顯微鏡成像的晶狀體(箭頭)的熒光表示。對照組采用Wildtype和不含2-NBDG的nur77(上圖)奇钞。(F)根據(jù)圖像測量眼睛熒光強度澡为。WT和nur77-/-斑馬魚幼魚熒光強度的定量測定。結果用均值表示景埃，標準誤差n= 3);n = 3媒至，無顯著性;“p< 0.05”，p< 0.01,p<0.001, p<0.0001經(jīng)t檢驗纠亚。

敲除Nur77損傷斑馬魚β細胞功能

然后我們轉向分析RNA-seq數(shù)據(jù)中胰島素信號通路中的EDG塘慕。有趣的是，insb蒂胞、gck和accl顯著降低(圖6A)图呢。我們進一步通過qRT-PCR證實了nur77?/?幼魚中insb的表達水平下降，而insa的表達水平?jīng)]有下降(圖6B, C)。接下來蛤织，我們通過免疫熒光法評估胰島素含量赴叹。從圖6D、E中指蚜，我們發(fā)現(xiàn)nur幼魚的胰島素含量明顯低于野生型幼魚乞巧。我們進一步研究了nur77?/?斑馬魚的b細胞質量是否有變化。我們將nur77?/?與b細胞報告系雜交Tg(Ins:H2BmCherry)摊鸡。nur77?/?中β細胞數(shù)量明顯減少;Tg(Ins: H2BmCherry)(圖6F, G)绽媒。此外，為了測量胰島素分泌免猾，使用鈣內流報告線的實時成像Tg(Ins: GCaMP6s)是辕。當胰腺β細胞響應葡萄糖分泌胰島素時，鈣的內流導致綠色熒光發(fā)射增加猎提。而且获三，熒光強度與胰島素分泌量成正比。如圖6H锨苏、1所示疙教，用5 mM葡萄糖ECS溶液處理6 dpf斑馬魚胚胎時，兩種Tg(Ins:H2BmCherry)的綠色熒光無明顯差異;Tg(Ins:GCaMP6s)和nur77?/?;Tg(Ins: H2BmCherry): Tg(Ins:GCaMP6s)伞租。而經(jīng)20 mM葡萄糖ECS溶液刺激后贞谓，在Tg中產(chǎn)生強烈的綠色信號(Ins:H2BmCherry);Tg(Ins:GCaMP6s)，但在nur77?/?中熒光弱;Tg(Ins:H2BmCherry);Tg(Ins: GCaMP6s)(補充視頻1,2)肯夏。綜上所述经宏，這些數(shù)據(jù)表明敲除nur77會損害β細胞功能，包括insb表達下調驯击、β細胞質量減少和胰島素分泌抑制烁兰。

圖6 Nur77調節(jié)斑馬魚幼魚胰島素分泌和β細胞數(shù)量。(A)胰島素信號通路轉錄本熱圖徊都。顏色代表高(紅色)沪斟、低(藍色)或平均(白色)表達值，基于每個基因的每千堿基每百萬映射讀取(FPKM)值的z分數(shù)歸一化片段暇矫。(B, C) WT和nur77-/-斑馬魚幼魚中胰島素基因的qRT-PCR表達水平驗證主之，(B) insa (n = 3)， (C)和insb (n = 3)李根。(D, E) WT和nur77-/-斑馬魚幼魚中胰島素含量槽奕。(D)對照和nur77-/-α細胞和β細胞的代表性熒光圖像;用Tg(gcg:eGFP)標記α細胞為綠色熒光，用胰島素抗體免疫染色標記β細胞為紅色熒光房轿。(E)對照和nur77-/-的β-細胞熒光強度定量粤攒。幼魚數(shù)(n = 12~18)所森。(F, G) Tg(Ins:H2BmCherry)和nur77-/-;Tg(Ins:H2BmCherry)斑馬魚幼魚胰腺β細胞數(shù)量。(F) 6 dpf時β細胞(紅色)在Tg(Ins:H2BmCherry)和nur77-/-;Tg(Ins:H2BmCherry)中的數(shù)量的代表性圖像夯接。(G)測定4 ~ 7 dpf斑馬魚幼魚(n = 19~50) Tg(Ins:H2BmCherry)和nur77-/-;Tg(Ins:H2BmCherry)中β-細胞數(shù)量焕济。(H, I)葡萄糖刺激β細胞中Tg(Ins:H2BmCherry)、Tg(Ins:GCaMP6s)和nur77-/-盔几、Tg(Ins:H2BmCherry)晴弃、Tg(Ins:GCaMP6s)的GCaMP6s反應。(H) GCaMP6s在β細胞中對Tg(Ins:H2BmCherry)逊拍、Tg(Ins:GCaMP6s)和nur77-/-上鞠、Tg(Ins:H2BmCherry)、Tg(Ins:GCaMP6s)在5或20 mM葡萄糖ECS溶液中反應的代表性圖像;綠色信號為GCaMP6芯丧。(I)定量測定β細胞中Tg(Ins:H2BmCherry)旗国、Tg(Ins:GCaMP6s)和nur77-/-nur77-/-、Tg(Ins:H2BmCherry)注整、Tg(Ins:GCaMP6s)對GCaMP6s的響應(GFP熒光強度)。結果用標準誤差的平均值表示(n = 13~20);n度硝，沒有意義;* * * * * p < 0.01, p < 0.001, t * * * * p < 0.0001肿轨。

β細胞中單獨表達Nur77足以挽救nur77?/?突變體的缺陷

接下來，我們想知道僅僅在β細胞中表達Nur77是否足以挽救nur77?/?突變體的β細胞缺陷蕊程。我們生成了一個轉基因系Tg(Ins:Nur77;cmlc2:eGFP)椒袍，其目標在斑馬魚β細胞中僅在斑馬魚胰島素啟動子控制下表達人類Nur77 cDNA, cmlc2啟動子驅動的eGFP被用作轉基因載體的指示(圖7A)。有趣的是藻茂，當Nur77在野生型背景下的β細胞中靶表達時驹暑，β細胞數(shù)量沒有變化(對照與Tg(Ins: Nur77))(圖7B, C)。然而辨赐，在nur77突變背景下优俘，nur77?/?;Tg(Ins: nur77);Tg(Ins:H2BmCherry)顯著增加了b細胞數(shù)量，其數(shù)量與對照組相似(圖7B, C)掀序。此外帆焕，當我們通過免疫熒光測定胰島素含量時，我們發(fā)現(xiàn)nur77?/?Tg(Ins: nur77)幼魚顯著恢復了它們的胰島素熒光強度(圖7D, E)不恭。其游離葡萄糖水平也恢復到對照組的相似水平(圖7F)叶雹。這些數(shù)據(jù)表明，β細胞功能受損可能與nur77的缺失有關换吧。

圖7 β細胞中靶向表達Nur77可恢復斑馬魚β細胞數(shù)量和胰島素含量折晦。(A) Tg(Ins: Nur77;cmlc2:eGFP)轉基因系及其表達模式。Nur77的表達由斑馬魚胰島素啟動子控制沾瓦，cmlc2驅動的eGFP被用作轉基因載體的指示满着。(B, C) β細胞數(shù)量在Tg(Ins:H2BmCherry)谦炒、nur77-/-、Tg(Ins:H2BmCherry)漓滔、Tg(Ins: nur77)编饺、Tg(Ins:H2BmCherry)、nur77-/-中的代表性圖像(B)和定量(C);Tg(Ins: Nur77);Tg(Ins:H2BmCherry)斑馬魚幼魚响驴。幼魚數(shù)(n = 20~30)透且。(D, E) Tg(gcg:eGFP)、nur77-/-豁鲤、(gcg:eGFP)秽誊、Tg(Ins: nur77)、Tg(gcg:eGFP)和nur77-/-的β細胞胰島素熒光強度的代表性圖像(D)和定量(E);Tg(Ins: Nur77);Tg(gcg:eGFP)斑馬魚幼魚琳骡。用Tg(gcg:eGFP)表示胰腺α細胞锅论，用胰島素抗體免疫染色用紅色熒光表示胰腺β細胞(n = 12~15)。(F) Tg(gcg:eGFP)楣号、nur77-/-最易、(gcg:eGFP)、Tg(Ins: nur77)炫狱、Tg(gcg:eGFP)藻懒、nur77-/-中游離葡萄糖的總含量;Tg(Ins: Nur77);Tg(gcg:eGFP)斑馬魚幼魚(n = 3). ns，無統(tǒng)計學意義;單因素方差分析**p < 0.01视译， **p < 0.001嬉荆。

我們進一步分析了在四個簇中表達的頂級標記基因，發(fā)現(xiàn)一些基因主要特異性地表達在其中一個簇中酷含，例如鄙早，tectb在簇5,zpld1a在簇12,cal1b在簇0和簇7(圖3B, S3)。功能富集分析顯示椅亚，上述4個細胞簇中表達的很多基因具有毛細胞相關的生物學功能(圖3C-F)限番，這表明這些細胞是毛細胞。為了進一步確認毛細胞的聚類和注釋什往，我們進行了全載原位雜交(WISH)扳缕。zpld1a基因主要在嵴毛細胞中表達，根據(jù)我們的分析别威，嵴毛細胞被認為位于簇12(圖3H)躯舔，這與之前的研究一致。至于簇0和7的細胞省古，雖然都是神經(jīng)肥大毛細胞粥庄，但它們之間存在差異。根據(jù)成熟和年輕毛細胞標志物s100s和prox1a在兩個簇中的表達情況豺妓，簇0的細胞被歸類為成熟神經(jīng)肥大毛細胞惜互，簇7被歸類為年輕神經(jīng)肥大毛細胞(圖S4)布讹。

另一方面，我們分析了支持細胞的標記基因klf17训堆，發(fā)現(xiàn)它主要表達在簇1的細胞中(圖S5)描验，這表明這一簇細胞是支持細胞。同樣坑鱼，我們還分析了據(jù)報道在套細胞中表達的基因膘流，如tnfsf10、ponzr6鲁沥、pkhd1l1呼股、fat1b、crb3b画恰、cts12彭谁、ovgp1和cldne，發(fā)現(xiàn)高水平表達這些基因的細胞聚集在簇9中(圖S6)允扇。然而缠局，它們表達了一些已被證明在毛細胞中特異性表達的基因，如myo6b考润、myo7aa(圖S7)甩鳄，這提出了它們是可以分化為毛細胞的支持細胞的可能性。因此额划，我們得出結論，來自簇1和9的細胞分別是支持細胞和套細胞档泽，來自簇14的細胞可能是毛細胞祖細胞俊戳。

討論

討論與結論肥胖癥、非酒精性脂肪性肝病馆匿、動脈粥樣硬化抑胎、糖尿病等代謝性疾病在世界范圍內日益增多，正在成為一個全球性的健康問題渐北。因此阿逃，迫切需要開發(fā)新的治療方法和新的藥物靶點。越來越多的證據(jù)證明赃蛛，孤兒核受體Nur77參與多種代謝過程恃锉，特別是碳水化合物代謝和脂質代謝。雖然Nur77是一個孤兒核受體呕臂，幾個小分子已經(jīng)被確定為Nur77破托。代謝方面，CsnB來自dothiirella sp. HTF3已經(jīng)發(fā)現(xiàn)靶向Nur77以增加空腹小鼠的血糖歧蒋。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)土砂，另一種Nur77激動劑celastrol可以顯著降低HFD小鼠的體重州既、脂肪組織質量和脂肪細胞大小。因此萝映，Nur77作為代謝性疾病的新藥物靶點可能具有很大的潛力吴叶。為了全面了解Nur77和代謝，以及篩選小分子藥物序臂，我們制作了Nur77敲除斑馬魚蚌卤，并應用RNA-seq分析揭示了Nur77的代謝調控網(wǎng)絡。雖然氨基酸缺乏會誘導nur77相關的網(wǎng)狀吞噬來維持細胞內氨基酸水平贸宏，但沒有關于nur77調節(jié)氨基酸代謝的研究報道造寝。這是第一次給出nur77相關氨基酸調控的改變基因的全局視圖。在我們的研究中吭练，幾個關鍵氨基酸代謝基因的轉錄水平顯著降低(圖3A)诫龙。這些基因不僅在氨基酸代謝途徑中發(fā)揮功能，而且在葡萄糖和脂質代謝中也發(fā)揮作用鲫咽。例如签赃，hahaa, hmgcsl, aldh9ala。2分尸、aox5(圖3C)均在纈氨酸锦聊、亮氨酸、異亮氨酸降解途徑中;然而箩绍，這些途徑的下游分子與脂肪酸代謝和三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))相互串擾孔庭。因此，Nur77參與了細胞內氨基酸材蛛、脂質和碳水化合物代謝途徑的串擾圆到。多項研究揭示了Nur77信號通路在調節(jié)哺乳動物脂質代謝中的重要作用。類似地卑吭，我們還觀察到nur77 null幼魚的脂質代謝功能障礙芽淡，表明膽固醇、甘油脂豆赏、類固醇和脂肪酸代謝通路發(fā)生了改變(補充表S4)挣菲。DEGs中有5個參與膽固醇生物合成，包括lss掷邦、cyp51白胀、sqlea、sc5d和hmgcs1(圖4C)抚岗。此外纹笼，脂肪酸代謝中的4個DEGs富集，包括acc苟跪、ppt廷痘、hadhaa和aldh (Supplementary Table S4)蔓涧。據(jù)報道，Nur77參與調節(jié)β-氧化笋额，促進葡萄糖剝奪下黑色素瘤細胞的存活元暴。也有報道稱，Nur77在轉錄水平上調控卵巢卵泡細胞中的類固醇生成酶兄猩。這些基因在膽固醇生物合成和脂肪酸代謝中的表達水平變化可能與敲除nur77的斑馬魚TC和TG含量升高有關(圖4D, E)茉盏。根據(jù)我們的數(shù)據(jù)，無論是在肝臟還是脂肪組織中枢冤，Nur77缺失小鼠在高脂肪飲食后鸠姨，TC和TG都會升高。綜上所述淹真，Nur77功能的破壞導致脂質代謝異常讶迁。

19個EDG在碳水化合物代謝中富集，其中大部分與葡萄糖穩(wěn)態(tài)有關(圖5A)核蘸。的確巍糯，nur7斑馬魚突變體的總游離葡萄糖升高(圖5D)，正常血糖是通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)調節(jié)肝臟葡萄糖產(chǎn)生和肌肉和脂肪組織的葡萄糖攝取來維持的(6668)客扎。導致血糖升高的因素有多種祟峦，如葡萄糖攝取增加、糖酵解減少徙鱼、糖異生增加宅楞、胰島素抵抗和胰島素缺乏。通路分析表明糖酵解/糖異生通路受損(圖5C)袱吆。參與糖酵解的基因咱筛，包括ldha、pkmb杆故、pgam2和gok，在nur7斑馬魚突變體中都減少了溉愁，這表明糖分解代謝減少了处铛。然而，參與糖異生的兩種主要限速酶pepck和gopc在nur77斑馬魚中沒有變化(圖5C)拐揭。這些數(shù)據(jù)表明糖酵解的減少可能導致葡萄糖升高撤蟆。此外，我們還通過2-NBDG攝取試驗檢測了葡萄糖攝取堂污，但野生型和nur77斑馬魚之間沒有顯著差異(圖5E, F)家肯。

我們進一步證明，nur77?/?斑馬魚中葡萄糖的增加與β細胞功能受損有關(圖6,7)盟猖。在敲除nur77的斑馬魚幼魚中讨衣，β細胞數(shù)量顯著減少(圖6F, G)换棚。此外，我們發(fā)現(xiàn)敲除Nur77下調了insb的表達反镇。降低了斑馬魚β細胞中的胰島素含量固蚤，并減少了胰島素分泌(圖6)。與我們的研究結果一致歹茶，研究報告了Nur77的整體敲除導致新生和幼齡小鼠b細胞面積減少夕玩。敲低Nur77抑制了Ins-1細胞系中?-細胞的增殖，阻礙了線粒體中ATP的產(chǎn)生惊豺，從而抑制了葡萄糖刺激的胰島素分泌燎孟。Nur77被認為可以防止活性氧(ROS)或內質網(wǎng)應激誘導的?-細胞凋亡。然而尸昧，一項研究報道揩页，Nur77的遺傳缺失在小鼠的β細胞中與WT幼崽相比沒有表現(xiàn)出任何形態(tài)學差異。然而彻磁，這一結論僅基于胰島素免疫染色碍沐。

此外，我們證明了Nur77在β細胞中的靶向表達挽救了β細胞功能的缺陷衷蜓，并恢復了正常的葡萄糖水平d圖)累提。雖然Nur77調節(jié)b細胞功能的詳細機制需要進一步闡明，但已有研究表明Nur77與許多重要的b細胞相互作用轉錄因子磁浇，如mafA和Nkx6.1斋陪。據(jù)報道，脂肪酸刺激增加了Nur77的表達置吓，然后Nur77與FoxOl相互作用降低細胞內mafA蛋白的濃度无虚，從而阻止胰島素基因的激活，導致細胞內胰島素濃度下降和胰島素分泌受損衍锚。大鼠胰腺中Nkx6.1的過表達通過Nur77及其同源的Norl誘導β細胞增殖友题。Nur77在斑馬魚b細胞中的靶表達可以恢復?-細胞功能，這可能是由于Nur77與這些β細胞轉錄因子一起重現(xiàn)戴质。

結論

總之度宦，我們對野生型和nur77?/?突變型幼魚進行了全生物體RNA測序。通過生物信息學分析告匠，我們發(fā)現(xiàn)與野生型相比戈抄，nur77?/?中代謝相關通路中許多基因的表達改變了兩倍以上。這些基因主要與氨基酸后专、脂質和碳水化合物代謝有關划鸽。進一步通過實驗方法，我們發(fā)現(xiàn)nur77?/?突變體表現(xiàn)出TC和TG增加，總氨基酸改變和葡萄糖升高裸诽。此外嫂用，我們證明葡萄糖升高不是由于葡萄糖攝取的改變，而是由糖酵解/糖異生障礙和?-細胞功能受損引起的崭捍，包括insb表達下調尸折、?細胞質量減少和胰島素分泌抑制。此外殷蛇，我們還驗證了在β細胞中靶向表達Nur77足以挽救全局nur77?/?突變體的β細胞缺陷实夹。這些結果為調控Nur77信號的全球代謝網(wǎng)絡以及Nur77在b細胞功能中的作用提供了新的信息。因此粒梦，nur77敲除斑馬魚模型將成為進一步研究nur77相關代謝調控機制和篩選nur77相關小分子化合物的系統(tǒng)亮航、經(jīng)濟、有效的動物模型匀们。

基金：本研究獲得福建省自然科學基金(資助號:2020J01042 ~ JL 2019J01036 ~ YX)資助缴淋。國家自然科學基金資助項目(81670709至ML)，福建省海洋生物技術重點實驗室資助項目(2021MB02至ML)泄朴，廈門市自然科學基金資助項目3502Z20184027重抖。

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