雜志：Redox Biology

影響因子：11.4（2022）

年份：2020

通訊作者：Jens Kroll

通訊作者單位：Department of Vascular Biology and Tumor Angiogenesis, European Center for Angioscience (ECAS), Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, Mannheim, Germany

摘要

甲基乙二醛（MG）形成的增加與糖尿病及其并發(fā)癥有關(guān)奠蹬。在斑馬魚中，敲除主要的MG解毒系統(tǒng)乙二醛酶1嗡午，導(dǎo)致MG升高有限囤躁，但乙醛脫氫酶（ALDH）活性和aldh3a1的表達(dá)顯著升高，提示Aldh3a1在糖尿病中的代償作用荔睹。為了評估Aldh3a1在葡萄糖穩(wěn)態(tài)和糖尿病中的作用狸演，我們使用CRISPR-Cas9生成了aldh3a1?/?斑馬魚突變體。用斑馬魚轉(zhuǎn)基因報(bào)告株系分析了血管系統(tǒng)和胰腺形態(tài)僻他。分別進(jìn)行相應(yīng)的活性羧基類物質(zhì)（RCS）宵距、葡萄糖、轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)篩選吨拗，并測定ALDH活性以供進(jìn)一步驗(yàn)證满哪。aldh3a1?/?斑馬魚幼魚表現(xiàn)出視網(wǎng)膜血管舒張性改變婿斥，葡萄糖穩(wěn)態(tài)受損，這可通過pdx1沉默誘導(dǎo)的高血糖而加重哨鸭。出乎意料的是民宿，MG沒有改變，但另一種與Aldh3a1高親和力的脂質(zhì)過氧化RCS像鸡， 4-羥基壬烯醛(4-HNE)在Aldh3a1突變體中增加勘高。4-HNE通過胰腺破壞引起的高血糖導(dǎo)致視網(wǎng)膜表型，可以通過l -肌肽治療來挽救坟桅。此外华望，在2型糖尿病患者中，血清4-HNE升高并與疾病進(jìn)展相關(guān)仅乓。因此赖舟，我們的數(shù)據(jù)表明，從遺傳易感性到病理進(jìn)展夸楣，4-HNE解毒功能受損和4-HNE濃度升高可作為生物標(biāo)志物宾抓，也是糖尿病的可能誘導(dǎo)劑。

關(guān)鍵詞：Aldh3a1豫喧；活性碳基物種石洗；4-羥基壬烯醛；葡萄糖穩(wěn)態(tài)紧显；糖尿病

引言

20-79歲人群的糖尿病患病率正在迅速上升讲衫，從2000年的1.51億（占全球人口的4.6%）上升到2019年的4.63億（9.3%），預(yù)計(jì)到2045年將達(dá)到7億（10.9%）孵班。糖尿病患者發(fā)生微血管和大血管并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)增加涉兽，這可導(dǎo)致失明、腎衰竭和下肢截肢篙程。例如枷畏，糖尿病性視網(wǎng)膜病變（DR）是糖尿病患者常見的微血管并發(fā)癥，也是工作年齡人群視力下降的主要原因虱饿。由于嚴(yán)重DR患者因身體拥诡、情感和社會(huì)健康狀況下降以及衛(wèi)生保健資源增加而導(dǎo)致生活質(zhì)量下降，因此早期診斷和及時(shí)治療DR對于預(yù)防視力障礙和失明至關(guān)重要氮发。

甲基乙二醛（MG）是一種活性碳基（RCS）渴肉，是晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）的主要前體。糖尿病患者血漿和組織中MG升高折柠，和AGEs與微血管并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)宾娜。除了乙二醛酶批狐、MG中心解毒系統(tǒng)外扇售，MG還可以通過醛酮還原酶和醛脫氫酶（ALDH）進(jìn)行解毒前塔。最近的一項(xiàng)研究顯示敲除乙二醛酶1（Glo1）只導(dǎo)致斑馬魚的MG升高了1.5倍。而在glo1突變體中承冰，ALDH活性增加了2倍华弓，aldh3a1的表達(dá)顯著增加，這表明aldh3a1是相應(yīng)RCS解毒的替代蛋白困乒。

除了MG外寂屏，醛脫氫酶還具有RCS底物的譜，如乙醛和4-羥基壬烯醛（4-HNE）娜搂。4-HNE作為最突出的脂質(zhì)過氧化特異性醛迁霎，在過去40年的中受到了廣泛的關(guān)注，在病理?xiàng)l件下導(dǎo)致細(xì)胞凋亡百宇、線粒體功能障礙考廉、炎癥和蛋白酶體功能障礙等損傷作用。由于4-HNE具有較高的反應(yīng)性携御，它與多種疾病的進(jìn)展有關(guān)昌粤，包括但不限于阿爾茨海默病（AD）啄刹、帕金森蹭套（PD）、心臟病誓军、動(dòng)脈粥樣硬化袱讹、癌癥和糖尿病。

4-HNE在糖尿病中的作用尚不清楚昵时，初步數(shù)據(jù)也表明存在濃度依賴性效應(yīng)廓译。低于細(xì)胞毒性量，4-HNE通過活性過氧化物酶體增殖激活受體δ（PPARδ）復(fù)合物對高糖發(fā)生反應(yīng)债查，最終增加INS-1E細(xì)胞的胰島素分泌非区。4-HNE與糖尿病腎病、神經(jīng)病變和視網(wǎng)膜病變密切相關(guān)盹廷。然而征绸，為了分析內(nèi)源性4-HNE增加的體內(nèi)損傷機(jī)制，目前還缺乏合適的動(dòng)物模型俄占。醛脫氫酶3家族管怠，成員A1（Aldh3a1）是一種代謝酶，主要將有毒的脂質(zhì)過氧化醛氧化為相應(yīng)的羧酸缸榄。一些研究已經(jīng)證明渤弛，ALDH3A1對4-HNE具有較高的親和力，但對丙二醛（MDA）的解毒能力較低甚带，以支持其多面功能她肯。然而佳头，目前尚不清楚永久敲除Aldh3a1是否會(huì)導(dǎo)致4-HNE濃度的增加并最終導(dǎo)致糖尿病和器官損傷。

因此晴氨，本研究旨在評估斑馬魚體內(nèi)RCS水平及其敲除Aldh3a1對葡萄糖代謝和視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的影響康嘉，同時(shí)探討糖尿病患者血清中4-HNE的臨床相關(guān)性。我們的數(shù)據(jù)表明籽前，從遺傳易感性到病理進(jìn)展亭珍，4-HNE解毒功能受損和4-HNE濃度升高不僅是生物標(biāo)志物，也是糖尿病的可能誘發(fā)因素枝哄。

結(jié)果

ALDH3A1酶系統(tǒng)存在于人類肄梨、小鼠和斑馬魚中，但該酶蛋白在不同物種中的相似性尚未被描述挠锥。首先峭范，我們對氨基酸序列進(jìn)行了比對，結(jié)果顯示斑馬魚Aldh3a1與人類Aldh3a1的蛋白質(zhì)相似性為61.6%瘪贱，與小鼠的相似性為57.6%纱控；作為酶編碼基因，半胱氨酸和谷氨酸的活性位點(diǎn)相同（圖1A）菜秦。然后甜害，采用RT-qPCR方法，更好地了解斑馬魚中aldh3a1 mRNA水平在發(fā)育和器官分布方面的潛在表達(dá)差異球昨。結(jié)果表明尔店，受精后96h，ahdh3a1 mRNA比24 hpf增加3倍主慰。而在成年魚中嚣州，大腦和眼睛是表達(dá)最多的器官，與心臟相比共螺，它們分別顯著增加了11倍和7倍（圖1B）该肴。總之藐不，這些數(shù)據(jù)已經(jīng)確定了斑馬魚幼魚和成魚器官中aldh3a1的存在匀哄，并確定了以斑馬魚為模型研究aldh3a1酶系統(tǒng)的可能性。

圖1 不同物種的Aldh3a1序列比對及在斑馬魚中aldh3a1 mRNA的表達(dá)雏蛮。(A) 氨基酸比對結(jié)果顯示涎嚼，不同物種之間具有很高的相似性和相同的活性位點(diǎn)（紅色框）：第一行，斑馬魚Aldh3a1挑秉；第二行法梯，人類ALDH3A1；第三行犀概，小鼠ALDH3A1立哑。(B) 野生型斑馬魚aldh3a1 mRNA表達(dá)熱圖在幼魚中從24 hpf到96 hpf呈上升趨勢夜惭，其中大腦和眼成年器官表達(dá)量最高。高表達(dá)和低表達(dá)分別顯示為粉紅色和藍(lán)色刁憋。用RT-qPCR檢測基因的表達(dá)量滥嘴，并歸一化至b2m木蹬。將24只hpf野生型幼魚和心臟（成魚器官）的平均值標(biāo)準(zhǔn)化為1只至耻；幼魚：n=3窩，30只幼魚镊叁，成魚器官：n=4尘颓，每個(gè)樣本一個(gè)器官。統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析晦譬，然后采用Sidak多重比較檢驗(yàn)疤苹，**p < 0.01，***p < 0.001敛腌。RT-qPCR卧土，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)；hpf像樊，受精后數(shù)小時(shí)尤莺；b2m，β2微球蛋白生棍。

斑馬魚中Aldh3a1基因敲除的產(chǎn)生

由于目前還不存在Aldh3a1敲除斑馬魚模型颤霎，為了探索Aldh3a1在斑馬魚和糖尿病中的作用，我們采用CRISPR-Cas9技術(shù)生成了aldh3a1?/?斑馬魚涂滴。我們設(shè)計(jì)了一個(gè)針對aldh3a1第2外顯子的CRISPR-guideRNA（gRNA）（圖2A）友酱，并將aldh3a1 gRNA與Cas9 mRNA注射到斑馬魚單細(xì)胞期胚胎的細(xì)胞中。在將F0陽性鑲嵌突變體與野生型雜交后柔纵，我們鑒定了aldh3a1的不同突變缔杉，選擇11個(gè)堿基插入（圖2A）作為移碼突變進(jìn)行進(jìn)一步繁殖和實(shí)驗(yàn)，通過基因分型PCR（圖2B）進(jìn)行區(qū)分搁料，從而形成終止密碼子（圖2C）壮吩。在96 hpf時(shí)，純合子和野生型斑馬魚幼魚的大體形態(tài)無差異（圖2D）加缘。并對F2第一代進(jìn)行了基因型計(jì)數(shù)鸭叙。4月齡時(shí)，野生型拣宏、異型和純合子成魚的數(shù)量分別為14條沈贝、27條和12條，符合孟德爾遺傳(圖2E)勋乾，表明aldh3a1?/?突變體沒有生存逆境宋下。為了評估在aldh3a1突變體中插入11個(gè)堿基是否導(dǎo)致翻譯后aldh3a1蛋白無功能嗡善，以乙醛為底物測定了總ALDH活性，aldh3a1突變體展現(xiàn)出30%顯著降低（圖2F）学歧。以上這些都證明了aldh3a1基因敲除突變體的成功產(chǎn)生罩引。

圖2 利用CRISPR-Cas9技術(shù)生成Aldh3a1敲除斑馬魚。(A)在aldh3a1的第2外顯子中設(shè)計(jì)Aldh3a1-CRISPR靶點(diǎn)枝笨，選擇CRISPR/cas9誘導(dǎo)的11個(gè)核苷酸插入進(jìn)行進(jìn)一步研究袁铐。進(jìn)行基因型分析，色譜圖顯示aldh3a1野生型横浑、雜合子和純合子測序結(jié)果剔桨。(B) 基因分型-pcr凝膠顯示了aldh3a1野生型、純合子和雜合子斑馬魚突變系的不同條帶徙融。藍(lán)色箭頭洒缀、紫色箭頭和白色三角形分別表示aldh3a1野生型、純合子和雜合子斑馬魚的基因分型-pcr產(chǎn)物欺冀。紅色框表示標(biāo)記树绩，下帶為200 bp，上帶為300 bp隐轩。PCR產(chǎn)物大薪确埂：野生型，255 bp龙助；純合子砰奕，266 bp。(C) 氨基酸序列顯示在aldh3a1-/-的第2外顯子上有一個(gè)終止密碼子提鸟。(D) 顯微鏡圖像顯示军援，與96 hpf時(shí)aldh3a1+/+幼魚相比，aldh3a1-/-幼魚大體形態(tài)正常称勋。黑色比例尺:500 μm胸哥。(E) 不同基因型的成魚數(shù)量與第一代F2的孟德爾遺傳結(jié)果一致：aldh3a1+/+ = 14、aldh3a1+/-= 27和aldh3a1-/-= 12赡鲜。(F) aldh3a1-/-斑馬魚在96 hpf時(shí)斑馬魚裂解液中酶活性降低空厌，n=6組，每組有46-50只幼魚银酬。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Student’s-t檢驗(yàn)嘲更，*p < 0.05乾吻。Bp纤勒，堿基對。PAM芦岂，原間隔子-鄰近基序。

內(nèi)源性pdx1表達(dá)沉默增強(qiáng)了aldh3a1?/?Tg（fli1：EGFP）斑馬魚幼魚的血管改變

我們之前的研究已經(jīng)證實(shí)宠哄，高組織葡萄糖誘導(dǎo)了斑馬魚幼魚的幾種畸形和不協(xié)調(diào)的血管結(jié)構(gòu)壹将。為了研究Aldh3a1基因敲除和高血糖條件下可能對血管發(fā)育的影響，我們建立了一個(gè)攜帶Tg（fli1：EGFP）斑馬魚報(bào)告基因的Aldh3a1突變系來進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)毛嫉。在正常情況下诽俯，在96 hpf時(shí)，aldh3a1+/+和aldh3a1?/?斑馬魚幼魚的超分支無差異承粤，但異常節(jié)段間血管（ISVs）略有增加（圖3）暴区。由于胰腺和十二指腸同源盒1（Pdx1）是胰腺發(fā)育的必要轉(zhuǎn)錄因子，包括β細(xì)胞成熟和十二指腸分化密任，因此我們使用pdx1嗎啡肽瞬時(shí)沉默其表達(dá)來介導(dǎo)高血糖并模擬糖尿病狀態(tài)颜启。而在嗎啉介導(dǎo)的pdx1沉默中偷俭，與aldh3a1+/+幼魚相比浪讳，aldh3a1?/?幼魚表現(xiàn)出增強(qiáng)的血管改變，超分支數(shù)量增加和異常的ISVs（圖3）涌萤。

圖3 在aldh3a1/Tg（fli1：EGFP）斑馬魚幼魚中淹遵，內(nèi)源性pdx1表達(dá)的沉默增強(qiáng)了軀干血管的改變。注射pdx1嗎啡啉沉默內(nèi)源性pdx1表達(dá)负溪，導(dǎo)致96 hpf時(shí)aldh3a1-/-Tg（fli1：EGFP）斑馬魚幼魚干血管中異常isv和超分支的形成增強(qiáng)透揣。(A) 代表性光學(xué)顯微鏡圖像為斑馬魚幼魚的大體形態(tài)，黑框表示共聚焦圖像中看到的區(qū)域川抡。白色箭頭表示異常的isv辐真，白色三角表示超分支。白色比例尺= 100 μm崖堤，黑色比例尺= 500 μm侍咱。(B–C) 圖中異常isv和超分支形成的定量；每組n=15-17密幔。將6 ng的嗎啡啉：Control-Mo和SB-pdx1-Mo分別注入斑馬魚胚胎的單細(xì)胞期楔脯。統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析后的Sidak多重比較檢驗(yàn)，然后采用Sidak多重比較檢驗(yàn)胯甩，**p<0.05昧廷、***p<0.01、****p < 0.0001. pdx1：胰腺和十二指腸同源盒1偎箫、ISV：節(jié)段間血管木柬、Mo:嗎啡啉、NS淹办，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義眉枕。

視網(wǎng)膜血管的擴(kuò)張和收縮的自動(dòng)調(diào)節(jié)減弱被認(rèn)為是DR的早期跡象。為了了解aldh3a1敲除和高血糖對視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)的短期影響，我們分析了120 hpf時(shí)Tg（fli1：EGFP）斑馬魚幼魚的視網(wǎng)膜玻璃樣網(wǎng)絡(luò)齐遵。aldh3a1?/?幼魚展現(xiàn)內(nèi)視環(huán)(IOC)分支變寬寂玲，通過直徑增加來量化，但與aldh3a1+/+相比梗摇，沒有變化(圖4)拓哟，這意味著aldh3a1突變體的視網(wǎng)膜血管收縮功能早期受損。嗎啡肽介導(dǎo)的pdx1沉默導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管生成性血管改變伶授，在aldh3a1?/?幼魚中断序，IOC分支直徑和芽的數(shù)量增加（圖4）∶优耄總之违诗，這些結(jié)果表明Aldh3a1缺失后血管發(fā)生中度改變，在高血糖條件下可增強(qiáng)疮蹦。

圖4 aldh3a1-/-Tg（fli1：EGFP）斑馬魚內(nèi)源性pdx1表達(dá)沉默增強(qiáng)視網(wǎng)膜透明樣血管改變诸迟。注射pdx1嗎啡啉沉默內(nèi)源性pdx1表達(dá)，導(dǎo)致120 hpf時(shí)aldh3a1-/-Tg（fli1：EGFP）斑馬魚幼魚IOC分支直徑擴(kuò)大愕乎，芽形成增加阵苇。(A) 在對照-Mo或SB-pdx1-Mo注射后，aldh3a1+/+和aldh3a1-/-幼魚中分離的透明樣血管的代表性共聚焦掃描感论。在120 hpf時(shí)绅项，玻璃狀網(wǎng)絡(luò)有一個(gè)籃狀結(jié)構(gòu)，在中央玻璃狀動(dòng)脈（白色盒狀）分支比肄，并連接到包含晶狀體的內(nèi)環(huán)狀玻璃體血管（白色箭頭）快耿，在成熟的成人視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)中也定期稱為IOC。幾個(gè)芽（白色三角洲）相互連接著籃狀的血管拱廊芳绩，并直接表明血管生成掀亥。白色比例條= 20 μm。(B–C) 圖中IOC分支直徑和芽形成的定量示括，每組n=13-15铺浇。將6 ng的嗎啡啉：Control-Mo和SB-pdx1-Mo分別注入斑馬魚胚胎的單細(xì)胞期。統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析垛膝，然后采用Sidak多重比較檢驗(yàn)鳍侣，**p < 0.01，***p < 0.001吼拥，****p < 0.0001倚聚。Mo、嗎啉凿可、IOC惑折、內(nèi)視圈授账、NS，不顯著惨驶。

ALDH抑制白热、aldh3a1短暫沉默和永久敲除破壞了斑馬魚幼魚的初級內(nèi)分泌胰腺

由于尚未有攜帶胰腺轉(zhuǎn)基因報(bào)告基因的aldh3a1突變體的生成，因此對于aldh3a1在初級胰腺中的功能探索及其與Pdx1的相互作用粗卜，ALDH活性抑制和aldh3a1沉默策略至關(guān)重要屋确。選擇兩種常見的ALDH抑制劑，棉酚和N续扔，N-二乙基氨基苯甲醛（DEAB）進(jìn)行孵育試驗(yàn)攻臀。此外，為了通過反義方法短暫降低aldh3a1在斑馬魚中的表達(dá)纱昧，我們設(shè)計(jì)了兩個(gè)嗎啡啉刨啸，SB-aldh3a1-Mo#1和SB-aldh3a1-Mo#2，并分別靶向aldh3a1-201的內(nèi)含子3-外顯子4和外顯子4-內(nèi)含子4連接（圖S1A）识脆。通過RT-PCR驗(yàn)證了嗎啉的有效性（圖S1B）设联，顯微圖像顯示注射后正常的大體形態(tài)，表明aldh3a1嗎啉沒有引起其他脫靶或毒性作用（圖S1C）存璃。

因?yàn)镠b9（Mnx）參與了脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞命運(yùn)規(guī)范和胰腺β細(xì)胞分化仑荐，我們首先使用Tg（hb9：GFP）轉(zhuǎn)基因報(bào)告細(xì)胞系（也稱為Tg[mnx1：GFP]）分析了原發(fā)性胰腺區(qū)域的大小雕拼。DEAB處理和兩種嗎啡啉介導(dǎo)的aldh3a1沉默導(dǎo)致初級胰腺的破壞纵东，通過減少72 hpf時(shí)斑馬魚幼魚的尺寸來量化（圖5A-B）。然后利用Tg（ins：nfsB-mCherry）轉(zhuǎn)基因報(bào)告系進(jìn)行β細(xì)胞大小分析啥寇，不僅為β細(xì)胞再生提供了合適的模型偎球，而且是早期胰腺早期生長過程中操縱細(xì)胞相互作用的替代策略。定量后辑甜，注射SB-aldh3a1-Mo#2和DEAB處理后衰絮，早期β細(xì)胞體積明顯減少，注射SB-aldh3a1-Mo#1的斑馬魚幼魚呈后代變化趨勢（圖5A和C）磷醋。這些結(jié)果表明猫牡，aldh3a1沉默和ALDH抑制介導(dǎo)的初級形態(tài)被破壞。

胰腺在胰島素分泌中起著重要作用邓线，因此調(diào)節(jié)葡萄糖淌友。為了闡明Aldh3a1缺失導(dǎo)致的胰腺發(fā)育不良的后果，我們采用基于RT-qPCR的方法測定了胰島素原（ins）骇陈、胰島素原b（insb）和pdx1 mRNA的表達(dá)震庭。我們發(fā)現(xiàn)，在48 hpf時(shí)你雌，aldh3a1沉默和敲除ALDH活性抑制的ins和pdx1顯著減少器联。Insb，另一個(gè)參與葡萄糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的胰島素編碼基因，在發(fā)育過程中也作為促生長拨拓、存活和神經(jīng)營養(yǎng)因子肴颊，沒有改變，表明Insb不能彌補(bǔ)胰島素分泌的減少（圖5 D-E渣磷，圖S2）苫昌。此外，在aldh3a1?/?幼魚中幸海，胰腺發(fā)育相關(guān)基因ISL LIM同源盒1（isl 1）和ISL LIM同源盒2a（isL2a）mRNA呈明顯的下降趨勢而與aldh3a1+/+幼魚相比祟身，在48 hpf ISL LIM同源盒2b（isl2b）mRNA明顯降低（圖S3)。

圖5 在斑馬魚幼魚中物独，ALDH抑制袜硫、aldh3a1短暫沉默和永久敲除破壞了初級胰腺。(A)DEAB處理抑制ALDH挡篓，內(nèi)源性aldh3a1表達(dá)沉默導(dǎo)致Tg（hb9：GFP）原代胰腺尺寸減少婉陷，Tg（ins：nfsB-mCherry）斑馬魚幼魚β細(xì)胞團(tuán)面積減少。白色框表示原發(fā)性胰腺官研；灰色框表示β細(xì)胞塊面積秽澳；白色刻度條= 100 μm，灰色刻度條= 50 μm戏羽。(B–C) 在圖中定量原發(fā)性胰腺(B)和β細(xì)胞質(zhì)量(C)的面積大小担神，每組n=12-33。(D–E).與pdx1嗎啉介導(dǎo)的沉默(E)相似始花，在48 hpf時(shí)妄讯，aldh3a1沉默(D)和aldh3a1永久敲除(E)斑馬魚幼魚的ins mRNA表達(dá)均顯著降低，而insb沒有改變酷宵。用RT-qPCR檢測mRNA的表達(dá)情況亥贸，并歸一化至b2m。對照mo注射(D)和aldh3a1+/+斑馬魚幼魚(E)的平均值標(biāo)準(zhǔn)化為1浇垦，n=3-6組炕置，每組30只幼魚。每個(gè)嗎啡啉6 ng分別注入斑馬魚胚胎的單細(xì)胞階段男韧。統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析朴摊，然后采用Sidak多重比較檢驗(yàn)，*p < 0.05煌抒，***p < 0.001仍劈，****p < 0.0001。

此外寡壮，為了了解受損的胰腺是如何在轉(zhuǎn)錄組水平上反映出來的贩疙，我們在48 hpf時(shí)對aldh3a1+/+和aldh3a1?/?的幼魚進(jìn)行了全基因組RNA-Seq檢測（圖6A）讹弯。RNA-Seq概述，包括質(zhì)量控制这溅、主成分分析（PCA）组民、調(diào)控基因火山圖和Top 20 KEGG通路分析，顯示aldh3a1突變體與野生型之間具有可比性特性（圖S4 A-D）悲靴。與ins表達(dá)減少的結(jié)果一致臭胜，我們通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)胰島素信號通路顯著減少（歸一化富集評分，?1.72癞尚；調(diào)整p = 0.003耸三；圖6B-C和表S6）。有趣的是浇揩，aldh3a1突變體的內(nèi)分泌胰腺發(fā)育通路顯著下調(diào)仪壮，而非外分泌胰腺發(fā)育通路（圖6C-F）。綜上所述胳徽，這些結(jié)果進(jìn)一步表明积锅，Aldh3a1是初級胰腺發(fā)育、形態(tài)和胰島素分泌功能的重要調(diào)控因子养盗。

圖6 aldh3a1-/-斑馬魚幼魚的胰島素信號通路和內(nèi)分泌通路下調(diào)缚陷，而外分泌胰腺發(fā)育通路不下調(diào)。(A)幼魚RNA-Seq示意圖往核。每組30只幼魚箫爷，5組aldh3a1+/+和6組aldh3a1-/-斑馬魚幼魚進(jìn)行RNA分離。(B–C) RNA-Seq熱圖(B)顯示胰島素信號通路相對mRNA表達(dá)铆铆，通過KEGG分析顯示在aldh3a1-/-斑馬魚顯著下調(diào)(C)蝶缀，**p= 0.003。(D–F).RNA-Seq熱圖顯示外分泌(D)薄货、內(nèi)分泌(E)和全(F)胰腺發(fā)育通路中mRNA相對表達(dá)，GSEA分析內(nèi)分泌胰腺發(fā)育通路而非外分泌通路發(fā)育途徑顯著下調(diào)(C)碍论。高表達(dá)和低表達(dá)分別顯示為粉紅色和藍(lán)色谅猾。調(diào)整p值：*p < 0.05，**p < 0.01鳍悠；NS税娜，不顯著；GSEA藏研，基因集合富集分析敬矩；KEGG，京都基因和基因組百科全書蠢挡。

敲除Aldh3a1的斑馬魚幼魚表現(xiàn)出葡萄糖穩(wěn)態(tài)受損弧岳，并可通過內(nèi)源性pdx1表達(dá)沉默而進(jìn)一步加重

基于以上研究發(fā)現(xiàn)凳忙，Aldh3a1可以調(diào)節(jié)原發(fā)性胰腺的形態(tài)和功能，我們推測Aldh3a1的缺失可能導(dǎo)致胰腺功能障礙導(dǎo)致的葡萄糖穩(wěn)態(tài)失衡禽炬。在正常條件下涧卵，對aldh3a1突變體和pdx1沉默條件下進(jìn)行了一系列的代謝組學(xué)篩選和葡萄糖測定。在96 hpf時(shí)腹尖，aldh3a1?/?幼魚的丙酮酸循環(huán)和糖酵解輸出呈下降趨勢（圖7A-B）柳恐。此外，在96 hpf時(shí)热幔，aldh3a1?/?斑馬魚幼魚中的氨基酸譜顯示了幾種還原的糖生成氨基酸乐设，包括天冬酰胺（Asn）、甘氨酸（Gln）和蛋氨酸（Met）（圖7C）绎巨。令人驚訝的是伤提，對照嗎啉干預(yù)的aldh3a1?/?幼魚與aldh3a1+/+ pdx1沉默幼魚的ATP和ADP水平相同，而pdx1沉默的aldh3a1?/?幼魚的ATP和ADP水平顯著最低（圖7D）认烁。這一結(jié)果表明肿男，aldh3a1突變體的能量代謝受損，并伴有高血糖而惡化却嗡，這可能是葡萄糖穩(wěn)態(tài)受損的直接反映舶沛。通過RNA-Seq GO通路富集分析進(jìn)一步證實(shí)了所有這些代謝組學(xué)的變化，所有核心基因在所涉及的7個(gè)通路中均顯示logFC值均下調(diào)（圖7E）窗价。我們還注意到硫醇如庭、糖水平和脂肪酸的一些變化（圖S5），表明aldh3a1除了具有葡萄糖調(diào)節(jié)外撼港，還具有代謝組學(xué)功能坪它。

然后，在48 hpf時(shí)帝牡，測定aldh3a1?/?幼魚的葡萄糖水平增加約40%往毡，作為葡萄糖穩(wěn)態(tài)受損的直接指標(biāo)；pdx1沉默后靶溜，兩種基因型的葡萄糖水平均升高开瞭，aldh3a1?/?的葡萄糖水平比aldh3a1+/+幼魚增加約30%，表明效應(yīng)強(qiáng)度增強(qiáng)（圖7F）罩息。最后嗤详，我們分析了糖尿病條件下aldh3a1的表達(dá)情況。通過RT-qPCR方法瓷炮，我們發(fā)現(xiàn)在pdx1表達(dá)沉默后葱色，48 hpf野生型幼魚ALDH基因的aldh3a1 mRNA增加了3倍（圖S6）。這一結(jié)果進(jìn)一步表明娘香，Aldh3a1是糖尿病患者葡萄糖穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子苍狰。

圖7 敲除aldh3a1的斑馬魚幼魚表現(xiàn)出葡萄糖穩(wěn)態(tài)受損办龄，并可通過內(nèi)源性pdx1表達(dá)沉默而進(jìn)一步加重。(A)RNA-Seq GSEA分析顯示舞痰，在48 hpf時(shí)土榴，檸檬循環(huán)和糖酵解/糖異生表達(dá)下調(diào)，(B) 丙酮酸中間產(chǎn)物在96 hpf時(shí)呈下降趨勢响牛。(C) 在96 hpf時(shí)玷禽，aldh3a1-/-幼魚的氨基酸譜顯示出幾種還原的糖原氨基酸，包括Asn呀打、Gln和Met矢赁。(D) 96hpf時(shí)，aldh3a1-/-的幼魚中ADP和ATP水平顯著下降贬丛，pdx1沉默時(shí)撩银，ATP和ADP水平顯著最低；(E) 通過RNA-Seq GO通路富集分析進(jìn)一步證實(shí)了這些代謝組學(xué)變化豺憔，所有核心基因在相關(guān)的7個(gè)通路中l(wèi)ogFC值均下調(diào)额获。(F) 在48 hpf時(shí)，aldh3a1-/-幼魚的葡萄糖水平升高恭应，而pdx1沉默增強(qiáng)了受損的葡萄糖穩(wěn)態(tài)抄邀。每個(gè)嗎啡啉6 ng分別注入斑馬魚胚胎的單細(xì)胞階段。統(tǒng)計(jì)分析采用配對樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析昼榛，然后采用Sidak多重比較檢驗(yàn)境肾，*p < 0.05，**p < 0.01胆屿，***p < 0.001奥喻。

4-HNE的升高導(dǎo)致Aldh3a1缺失后葡萄糖穩(wěn)態(tài)失衡

為了檢驗(yàn)Aldh3a1是否可以彌補(bǔ)Glo1的損失的假設(shè)，作為MG解毒的替代酶非迹，同時(shí)也為了確定導(dǎo)致原發(fā)性胰腺和葡萄糖穩(wěn)態(tài)損害的相關(guān)因素环鲤，我們測量了相應(yīng)的酶活性和RCS的濃度。出乎意料的是彻秆，在96 hpf時(shí)楔绞，aldh3a1突變體的ALDH和Glo1都沒有改變解毒MG的能力（圖8A）。此外唇兑，野生型和aldh3a1突變體之間的MG水平?jīng)]有改變，這表明MG對aldh3a1敲除導(dǎo)致的血管表型不是必需的（圖8A）桦锄。此外扎附，該基因型上的乙二醛和3-脫氧葡萄糖酮（3-DG）均未發(fā)生改變（圖S7）。

然后结耀，我們用4-HNE作為底物和aldh3a1突變體的4-HNE濃度來測量ALDH活性留夜。在96 hpf時(shí)匙铡，Aldh3a1的缺失導(dǎo)致斑馬魚幼魚體內(nèi)4-HNE依賴的ALDH活性降低了約30%，內(nèi)部4-HNE濃度增加了70%（圖8B）碍粥。此外鳖眼，4-HNE主要與半胱氨酸促進(jìn)1,4-邁克爾添加加合物的形成，在96 hpf時(shí)嚼摩，aldh3a1?/?幼魚的游離半胱氨酸減少了約20%（圖8C）钦讳。這表明超過生理數(shù)量的半胱氨酸與超過4-HNE結(jié)合，導(dǎo)致aldh3a1突變體后游離半胱氨酸水平下降枕面。為了評估4-HNE水平升高是否導(dǎo)致aldh3a1?/?幼魚的表型愿卒，進(jìn)行了一系列4-HNE孵育試驗(yàn)，選擇10 μM進(jìn)行實(shí)驗(yàn)潮秘，因?yàn)樗鼈冇行砜唏R魚幼魚孵育后表現(xiàn)出正常的大體形態(tài)（表S1）。首先枕荞，檢測ins柜候、insb和pdx1的表達(dá)情況。經(jīng)過4-HNE處理后躏精，Ins和pdx1顯著降低（圖8D）渣刷，這與aldh3a1的瞬時(shí)敲除和永久敲除相一致。此外玉控，與aldh3a1突變體相似飞主，在96 hpf的野生型幼魚中檢測到一些減少的糖原氨基酸，包括Asn和Met（圖8E）高诺。然后碌识，經(jīng)過4-HNE處理后，在120 hpf時(shí)虱而，野生型幼魚的葡萄糖水平升高了2.5倍（圖8F）筏餐。最后，與Aldh3a1敲除相比牡拇，10 μM 4-HNE的孵育顯示出相似的軀干血管形態(tài)（圖S8）魁瞪。

圖8 4-HNE解毒缺陷和4-HNE的升高導(dǎo)致Aldh3a1缺失后葡萄糖穩(wěn)態(tài)失衡。(A)aldh3a1-/-斑馬魚幼魚的ALDH活性無變化惠呼，以MG為底物時(shí)Glo1活性無變化导俘，在96 hpf時(shí)MG量無變化。(B–C) 當(dāng)aldh3a1-/-以4-HNE為底物時(shí)剔蹋，斑馬魚幼魚的ALDH活性降低旅薄，在96 hpf時(shí)4-HNE量增加，游離半胱氨酸減少泣崩，但pdx1突變體的ALDH活性和4-HNE量沒有顯著變化少梁。(D–F).10 μM 4-HNE處理野生型斑馬魚幼魚引起：(D) 在48 hpf時(shí)洛口，ins和pdx1 mRNA的表達(dá)降低。用RT-qPCR分析mRNA的表達(dá)情況凯沪，并歸一化至b2m第焰；(E) 在96hpf時(shí)，糖原性氨基酸Asn和Met減少妨马；(F) 在120 hpf時(shí)葡萄糖升高挺举。(G) 在96hpf時(shí)，pdx1沉默的斑馬魚幼魚的4-HNE和ALDH依賴的4-HNE解毒能力沒有改變身笤。(H) 簡明的機(jī)制流程圖顯示了Aldh3a1缺失后4-HNE解毒缺陷的后果豹悬。n=3~7組，每組30~50只幼魚 液荸。統(tǒng)計(jì)分析采用配對樣本t檢驗(yàn)瞻佛。*p < 0.05，**p < 0.01娇钱，***p < 0.001伤柄。

外源性4-HNE破壞胰腺，通過高血糖誘導(dǎo)透明樣血管改變文搂，并可通過RCS清除劑治療來挽救

由于pdx1沉默導(dǎo)致了斑馬魚幼魚的高血糖（圖7F）适刀，并且在4-HNE處理后檢測到pdx1的表達(dá)量降低（圖8D），我們檢測到pdx1突變體中4-HNE濃度和ALDH依賴的4-HNE解毒能力煤蹭。然而笔喉，它們都沒有明顯的變化（圖8G），表明高血糖在這種情況下不能調(diào)節(jié)4-HNE的量硝皂，提示4-HNE作為上游化合物常挚，抑制pdx1的表達(dá)，破壞胰腺稽物，增加葡萄糖奄毡。為了進(jìn)一步證明4-HNE與胰腺破壞、高血糖和血管改變之間的因果關(guān)系贝或，并排除4-HNE的非特異性副作用吼过，我們觀察了4-HNE孵化期胰腺形態(tài)和透明質(zhì)血管，并通過RCS清掃劑和抗高血糖干預(yù)檢查是否存在拯救作用咪奖。選擇l -肌肽作為RCS的抗氧化劑和清除劑盗忱，保護(hù)組織免受4-HNE引起的氧化損傷。此外羊赵，我們選擇了PK11195作為抗高血糖藥物售淡，它對高血糖斑馬魚幼魚的血糖水平有較強(qiáng)的降低作用。4-HNE處理后的斑馬魚幼魚顯示出早期原發(fā)性胰腺的尺寸降低（圖9A-C）慷垮，這與aldh3a1沉默后的變化一致揖闸。1 mM -肌肽處理對Tg(hb9:GFP)和Tg(ins:nfsB-mCherry)幼魚在10 μM 4-HNE孵育后造成的胰腺破壞均有恢復(fù)趨勢(圖S9和S10);5 mM和10 mM L -肌肽能明顯恢復(fù)胰腺形態(tài)(圖9 A-C，圖S9和S10)料身。然而汤纸，PK11195對4-HNE誘導(dǎo)的胰腺功能障礙無拯救作用（圖9A-C）。

伴隨著外部4- HNE干預(yù)引起的高血糖(圖8F)芹血，我們還觀察到與aldh3a1?/?斑馬魚幼魚在120 hpf時(shí)相似但嚴(yán)重的視網(wǎng)膜玻璃樣血管表型贮泞，分支直徑增加，血管互聯(lián)形成顯著增加幔烛，通過更多的芽(圖9D-F)進(jìn)行量化啃擦。10 μM PK11195處理顯著恢復(fù)了芽的血管生成方面，并在10 μM 4-HNE孵育下增加了視網(wǎng)膜透明體網(wǎng)絡(luò)的分支直徑(圖9D-F)饿悬。因此令蛉，我們確定了血管生成的視網(wǎng)膜透明樣網(wǎng)絡(luò)很可能是由4- HNE孵育后的高血糖引起的。此外狡恬，我們還闡明了Aldh3a1敲除后4-HNE的解毒功能受損珠叔，而4-HNE濃度的增加是胰腺破壞的觸發(fā)器，最終導(dǎo)致高血糖和血管生成血管改變（圖8G）弟劲。

圖9 外源性4-HNE破壞胰腺祷安，誘導(dǎo)透明樣血管改變，并可分別通過L-肌肽和PK11195治療得到挽救兔乞。(A)10 μM 4-HNE處理誘導(dǎo)Tg（hb9：GFP）原發(fā)胰腺尺寸降低汇鞭，Tg（ins：nfsB-mCherry）斑馬魚幼魚β細(xì)胞質(zhì)量趨勢降低，5 mM肌肽挽救庸追，而10 μM PK11195干預(yù)霍骄。灰色框表示β細(xì)胞質(zhì)量面積锚国；白色白度條= 100 μm腕巡，灰度條= 50 μm。(B–C) 圖中早期胰腺(B)和β細(xì)胞質(zhì)量(C)的面積大小血筑，每組=17-26绘沉。(D) 4-HNE孵育導(dǎo)致Tg（fli1：EGFP）斑馬魚幼魚在120hpf)的透明樣血管系統(tǒng)中IOC分支直徑（白色箭頭）和芽（白色三角洲）增加，通過10 μM PK11195干預(yù)挽救豺总。白色比例條= 20 μm车伞。(E–F) 圖中IOC分支直徑和芽的定量，每組n=10-20喻喳。統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析另玖，然后采用Sidak多重比較檢驗(yàn)，**<0.05，**p < 0.01谦去，***p < 0.001慷丽，****p < 0.0001。

糖尿病患者血清4-HNE水平升高

為了評估4-HNE水平是否也與人類糖尿病的發(fā)生有關(guān)鳄哭，我們對患者的血清進(jìn)行了4-HNE的測量要糊。本研究納入海德堡大學(xué)醫(yī)院20例患者，根據(jù)病史分為對照組（n=9）和2型糖尿沧鼻稹（T2DM锄俄，n=11）。各組患者的年齡勺拣、性別奶赠、BMI、LDL药有、TG等生化結(jié)果等特征相匹配（表S2）毅戈。我們發(fā)現(xiàn)T2DM患者的血清4-HNE水平顯著高于對照組（Fig. 10A）。為進(jìn)一步研究4- HNE與糖尿病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系塑猖，我們以糖化血紅蛋白和空腹血糖作為簡單線性回歸分析的參考參數(shù)竹祷。4-HNE的積累與糖化血紅蛋白（圖10B）和空腹血糖水平（圖10C）均顯著正相關(guān)，提示4-HNE在糖尿病進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用羊苟。再加上發(fā)現(xiàn)4-HNE阻斷斑馬魚的胰腺并導(dǎo)致葡萄糖穩(wěn)態(tài)失衡塑陵，我們的臨床證據(jù)進(jìn)一步支持了4-HNE在糖尿病中的基本功能（圖10D）。

圖10 T2DM患者血清4-HNE水平升高蜡励。(A)T2DM患者血清4-HNE水平明顯高于對照組令花，采用非配對t檢驗(yàn)，*p = 0.032凉倚。(B–C) 簡單線性分析顯示兼都，4-HNE與HbA1c (B)和空腹血糖(C).呈顯著正相關(guān)。x軸表示血清4-HNE水平稽寒，y軸表示患者住院期間由海德堡大學(xué)測量的HbA1c(B)和空腹血糖(C)扮碧。11例T2MD患者和9例對照組被納入分析。(D) T2MD患者血清4-HNE水平升高杏糙。

討論

在本研究中慎王，我們首次建立了Aldh3a1敲除斑馬魚模型，并證明了4-HNE濃度升高對斑馬魚葡萄糖穩(wěn)態(tài)和視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的影響宏侍，以及4-HNE與人類糖尿病的相互作用赖淤。Aldh3a1缺失導(dǎo)致的內(nèi)源性4-HNE濃度升高，原發(fā)胰腺破壞導(dǎo)致葡萄糖穩(wěn)態(tài)受損谅河，導(dǎo)致中度視網(wǎng)膜血管舒張表型咱旱，實(shí)驗(yàn)性糖尿病條件通過加重葡萄糖穩(wěn)態(tài)損害增強(qiáng)視網(wǎng)膜血管改變确丢。我們的臨床證據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了這些研究結(jié)果，顯示血清4-HNE升高與糖尿病的進(jìn)展呈正相關(guān)吐限。

糖尿病是一組以長期高血糖水平為特征的代謝紊亂癥鲜侥。隨著全球發(fā)病率的增加，找出導(dǎo)致糖尿病高血糖的主要觸發(fā)因素變得越來越重要毯盈。與1型糖尿病(T1DM)不同剃毒，β細(xì)胞的自身免疫破壞清楚地描述了其機(jī)制，絕對胰島素缺乏使得生存需要外源性胰島素治療搂赋。2型糖尿病始于外周組織的胰島素抵抗（IR），與細(xì)胞質(zhì)量減少和細(xì)胞胰島素分泌能力受損有關(guān)益缠。在IR的背后脑奠，一些危險(xiǎn)因素可能通過細(xì)胞質(zhì)量的減少，從細(xì)胞凋亡幅慌，到去分化宋欺，并比2型糖尿病發(fā)病早10年。然而胰伍，這些高危因素是如何詳細(xì)參與其中的齿诞，它們是如何共同作用的，以及是否存在促進(jìn)2型糖尿病胰島素抵抗的“核心因素”骂租，仍需進(jìn)一步探索祷杈。了解“因素”對葡萄糖發(fā)揮生物學(xué)作用的機(jī)制，可能有助于預(yù)防糖尿病渗饮，并確定有效的治療策略但汞。

據(jù)我們所知，目前還沒有研究報(bào)道ALDH3A1是否能調(diào)節(jié)葡萄糖代謝互站。我們的斑馬魚研究強(qiáng)烈表明私蕾，在Aldh3a1缺失后，內(nèi)部4-HNE水平升高會(huì)導(dǎo)致高血糖胡桃，提供了一種與糖尿病相關(guān)的新酶踩叭。當(dāng)機(jī)體遭受高血糖時(shí)，4-HNE通常被認(rèn)為是一種“護(hù)衛(wèi)”翠胰。因?yàn)楦哐菑哪ち字嗅尫懦龇敲复龠^氧化的多不飽和脂肪酸(PUFA)容贝，而PUFA的過氧化反應(yīng)產(chǎn)生生物活性醛，其中4-HNE最為突出亡容。在斑馬魚中嗤疯，我們發(fā)現(xiàn)，由于Aldh3a1酶系統(tǒng)的缺失闺兢，超過4-HNE會(huì)抑制胰腺發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子Pdx1的表達(dá)茂缚，破壞胰腺原發(fā)結(jié)構(gòu)戏罢，最終導(dǎo)致葡萄糖穩(wěn)態(tài)受損。這就導(dǎo)致了一個(gè)假設(shè)脚囊，4-HNE只是一個(gè)標(biāo)記還是高血糖的真正制造者龟糕？為了回答這個(gè)問題，我們使用一種已知的降糖藥PK11195來評估降低血糖水平是否可以阻斷4-HNE的主要作用悔耘。4-HNE引起的視網(wǎng)膜血管生成血管改變可通過抗高血糖治療來挽救讲岁；強(qiáng)調(diào)4-HNE升高是調(diào)節(jié)高血糖水平的上游代謝物。這項(xiàng)研究并不是糖尿病的標(biāo)志物衬以，而是確定了4-HNE缓艳，至少在斑馬魚中，是一種誘導(dǎo)高血糖的代謝因子看峻。與斑馬魚的高血糖誘導(dǎo)劑相一致阶淘，4-HNE水平的升高可能是糖尿病和糖尿病并發(fā)癥患者的一個(gè)臨床特征。Lucia La Sala等人發(fā)現(xiàn)互妓，T2DM患者的4-HNE水平明顯高于正常糖耐量患者溪窒。Morana Jaganjac等人觀察到，2型糖尿病的進(jìn)展與脂肪細(xì)胞中4-HNE水平的升高相關(guān)冯勉。然而澈蚌，4-HNE在2型糖尿病發(fā)病中的關(guān)鍵作用還需要進(jìn)一步的研究。結(jié)果表明灼狰，4-HNE濃度升高可誘導(dǎo)大鼠-細(xì)胞凋亡和胰島素分泌受損宛瞄，這可能是4-HNE與IR后的T2DM相關(guān)的可能機(jī)制。更重要的是伏嗜，4-HNE作為脂質(zhì)過氧化的主要最終產(chǎn)物坛悉，被認(rèn)為是氧化應(yīng)激的生物活性標(biāo)記物，并作為“活性氧（ROS）的第二信使”參與多種應(yīng)激相關(guān)疾病的氧化還原信號轉(zhuǎn)導(dǎo)承绸。人體中4-HNE的積累表明脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激的存在裸影，這兩者在一定意義上對T2DM的發(fā)生和發(fā)展起著基礎(chǔ)作用。

此外军熏，在臨床背景下轩猩，2型糖尿病的進(jìn)展與4-HNE過量之間的相關(guān)性程度尚不清楚。我們的臨床發(fā)現(xiàn)顯示荡澎，血清4-HNE水平與糖化血紅蛋白和空腹血糖相關(guān)均践，并提供了一些有意義的意義。首先摩幔，它表明人類在葡萄糖穩(wěn)態(tài)方面與斑馬魚具有相似的4-HNE解毒機(jī)制彤委。利用Aldh3a1敲除斑馬魚是研究血糖積累對糖尿病器官損傷的合適疾病模型。此外或衡，我們的研究結(jié)果建議新的臨床指標(biāo)對糖尿病評估：與以前的高危因素相比焦影，篩查患者血清4-HNE升高车遂，改變ALDH活動(dòng)或ALDH3A1突變，和動(dòng)態(tài)監(jiān)測變化斯辰，可能是有趣的尋找糖尿病前期的人狀態(tài)舶担，以及預(yù)防糖尿病甚至并發(fā)癥的發(fā)展。最后彬呻，這項(xiàng)工作為糖尿病的治療提供了一個(gè)新的策略衣陶。傳統(tǒng)的治療依賴于降糖藥和胰島素增敏劑，大多數(shù)糖尿病患者需要終生服用藥物闸氮，以達(dá)到適當(dāng)?shù)难强刂萍艨觥Ｊ褂肁LDH活性增敏劑、肌肽等4-HNE清清劑治療糖尿病是否有效湖苞，甚至通過消除4-HNE毒性作用恢復(fù)胰腺功能拯欧，值得進(jìn)一步研究。

值得注意的是财骨，即使沒有任何高危因素，一些人也可能更容易由于多種遺傳易感性而患上糖尿病藏姐。雖然已經(jīng)鑒定出超過36個(gè)糖尿病相關(guān)基因隆箩，但只有大約10%的2型糖尿病遺傳力可以很好地解釋。據(jù)我們所知羔杨，沒有ALDH3A1突變的糖尿病報(bào)告捌臊。然而，本研究提供了關(guān)于功能失調(diào)的Aldh3a1如何損害葡萄糖穩(wěn)態(tài)的全面轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)篩選兜材。在“易感人群”中研究ALDH3A1突變對糖尿病基因組研究具有重要意義理澎。

總之，本研究為4-HNE濃度升高通過斑馬魚aldh3a1突變體胰腺功能障礙參與高血糖和糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生及其在糖尿病患者中的相關(guān)性提供了專利證據(jù)曙寡，為今后糖尿病的早期診斷篩查糠爬、病理生理和治療研究提供了新的方向。

材料和方法

所有患者均在海德堡大學(xué)醫(yī)院的糖尿病研究部門招募管嬉，并給予書面知情同意怯伊。招募和檢測是海德堡糖尿病和并發(fā)癥研究（HEIST-DiC）的一部分筛婉，該研究已獲當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)批準(zhǔn)（倫理編號S-383/2016，ClinicalTrials.gov標(biāo)識符NCT03022721）镀琉。

所有關(guān)于動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)程序均由當(dāng)?shù)卣?dāng)局、卡爾斯魯厄醫(yī)學(xué)注冊中心和曼海姆醫(yī)學(xué)院批準(zhǔn)（許可證編號：G-98/15蕊唐、G-160/14和I-19/02）屋摔，并按照批準(zhǔn)的指南進(jìn)行。

斑馬魚飼養(yǎng)和斑馬魚品系

斑馬魚品系Tg（fli1：EGFP）替梨、Tg（hb9：GFP）(也稱為Tg（mnx1：GFP）[56]和Tg（ins：nfsB-mCherry）在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行飼養(yǎng)和分期钓试。將胚胎/幼魚保存于28.5?C的E3培養(yǎng)基中装黑，含/不含PTU（2.5ml，25ml）亚侠，以抑制色素沉著曹体。成年斑馬魚在光照13h/11h黑暗周期下飼養(yǎng)，早上喂活蝦硝烂，下午喂魚片食物箕别。

Morpholinos 

嗎啉包括SB-pdx1-Mo、SB-aldh3a1-Mo#1滞谢、SB-aldh3a1- Mo#2和Control-Mo（GENE工具串稀，LLC）。所有嗎啉在0.1 M氯化鉀中稀釋至6 μg/μl狮杨。如前所述母截，將一納升的嗎啉注射到胚胎單細(xì)胞階段的卵黃囊中。

突變體生成

為了通過CRISPR/Cas9技術(shù)生成突變體橄教，使用ZiFiT靶標(biāo)4.2設(shè)計(jì)了一個(gè)針對aldh3a1外顯子2的引導(dǎo)RNA（gRNA）清寇，并克隆到t7驅(qū)動(dòng)的啟動(dòng)子表達(dá)載體（pT7- gRNA；Ad基因）（Aldh3a1-CRISPR-for&rev护蝶，表S4）华烟。利用pT3TSnCas9n載體（Addgene）進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得Cas9 mRNA持灰。注射用mRNA的合成是通過使用mMESSAGE mMACHINE T3轉(zhuǎn)錄試劑盒和gRNA的MEGA短腳T7試劑盒盔夜，同時(shí)遵循制造商的協(xié)議（Invitrogen）。在單細(xì)胞階段注射1納升0.1 M含有g(shù)RNA（200 pg/nL）和Cas9 mRNA（200 pg/nL）的0.1 M KCl溶液堤魁。對F0魚進(jìn)行了種系傳播和選擇性繁殖分析喂链。通過PCR產(chǎn)物的Sanger測序（Aldh3a1-Genotyping#1.1&1.2）或凝膠電泳（Aldh3a1-Genotyping#1.3&1.4）進(jìn)行基因分型（表S4）。突變通過色譜圖的評估和使用Yost工具進(jìn)行分析妥泉。

幼魚胰腺和血管改變的顯微鏡觀察和分析

為了對胰腺結(jié)構(gòu)進(jìn)行體內(nèi)分析椭微，Tg（hb9：GFP）和Tg（ins：nfsB-mCherry）幼魚在72 hpf時(shí)用0.0003%三卡因麻醉。圖像是用倒置顯微鏡（徠卡DMI 6000 B）和相機(jī)（徠卡DFC420C）和徠卡LAS應(yīng)用套件3.8和4.13拍攝的涛漂。原發(fā)性胰腺和β細(xì)胞質(zhì)量尺寸分別在20x和8x處成像赏表。使用ImageJ進(jìn)行定量。

為了對斑馬魚軀干血管系統(tǒng)進(jìn)行體內(nèi)成像匈仗，Tg（fli1：EGFP）幼魚在96 hpf時(shí)用0.0003%三卡因麻醉瓢剿，側(cè)臥。圖像采用DM6000 B顯微鏡拍攝悠轩，徠卡TCS SP5 DS掃描儀间狂，600 Hz，1024×512像素火架，1 μm厚的z堆棧鉴象。為了定量改變的干血管忙菠，我們跳過了每個(gè)斑馬魚幼魚的前5個(gè)ISVs，并計(jì)算了接下來的17對變化纺弊。新血管的發(fā)展被稱為“超分支”牛欢，節(jié)間血管的改變或錯(cuò)過與其他血管的連接（認(rèn)為異常和計(jì)數(shù)1點(diǎn)）或顯示輕微畸形（薄、厚或方向錯(cuò)誤的淆游；考慮部分異常傍睹，計(jì)數(shù)0.5點(diǎn)）被歸為“異常ISVs”并計(jì)數(shù)。

為了進(jìn)行斑馬魚視網(wǎng)膜透明樣血管系統(tǒng)的體內(nèi)成像犹菱，Tg（fli1：EGFP）幼魚在120 hpf下用0.0003%三卡因麻醉拾稳，然后在4?C下用4% PFA/PBS固定過夜。固定的幼魚在雙蒸餾水（ddH2O）中洗滌3次20 min腊脱，在07?C的0.5%胰蛋白酶/EDTA溶液（25200-056访得，Gibco）中孵育90 min，用0.1 M TRIS (Nr陕凹。用1M鹽酸溶液調(diào)整至pH值7.8悍抑。幼魚透明樣血管在立體鏡下解剖，并根據(jù)Jung的方案在PBS中顯示以進(jìn)行可視化杜耙。共聚焦圖像的表型評估獲得使用共聚焦顯微鏡（DM6000 B）和掃描儀（徠卡TCS SP5 DS）传趾，使用20×0.7物鏡，1024×256像素泥技，0.5 μm z步。用Image J在兩個(gè)不同位置測量IOC分支直徑磕仅，用新血管生成計(jì)數(shù)新血管珊豹，并在每個(gè)樣本的透明體圓周長內(nèi)稱為“芽”。

斑馬魚胚胎/幼魚的藥物治療

受精的斑馬魚胚胎轉(zhuǎn)移到6孔板中榕订，每孔約30個(gè)胚胎加入5毫升蛋水店茶。在24 hpf時(shí)，用鋒利的鑷子去除斑馬魚胚胎的絨毛膜劫恒，并在蛋水中加入0,003%的PTU贩幻。對于4-HNE干預(yù)和挽救實(shí)驗(yàn)，10 μM 4-HNE（393,204两嘴；西格瑪-奧爾德里奇）丛楚，10 μM PK11195（C0424；西格瑪-奧爾德里奇）憔辫，1 mM趣些，5 mM或10 mM的L-肌肽（C9625；西格瑪-奧爾德里奇）治療從3 hpf開始贰您，并持續(xù)到結(jié)束坏平。對于ALDH抑制拢操，0.25 μM或1 μM高糖醇（G8761-100MG；西格瑪-奧爾德里奇）和DEAB（D86256-100G舶替；西格瑪-奧爾德里奇）處理在3 hpf開始令境，并持續(xù)到結(jié)束；每天更換培養(yǎng)基顾瞪。

斑馬魚幼魚全身葡萄糖的測定

采集不同發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的斑馬魚幼魚并快速冷凍舔庶。每組約20-25只幼魚在超聲勻漿器的葡萄糖檢測緩沖液中均質(zhì)，強(qiáng)度90%玲昧，15s 2次栖茉。葡萄糖含量根據(jù)制造商的說明（葡萄糖測定試劑盒，CBA086孵延，Sigma-Aldrich）進(jìn)行測定吕漂。

斑馬魚幼魚和患者的4-HNE測定

收集96 hpf中的斑馬魚幼魚并迅速冷凍。每組約40-50只幼魚用超聲超聲器尘应，強(qiáng)度90%惶凝，15s 2次。用試劑盒中的樣品稀釋緩沖液稀釋1：20后犬钢，對患者血清進(jìn)行檢測苍鲜。

4-HNE的數(shù)量根據(jù)制造商的說明（4-羥基烯ELISA Kit，E4645玷犹，生物視覺）確定混滔。

酶活性測定

在96 hpf時(shí)，每次測量約有50只斑馬魚幼魚用0.003%三卡因麻醉并迅速冷凍歹颓。ALDH活性在25?C下75mM Tris-HCl（pH 9.5）中測定坯屿，含有10mM DL-2-amino-1propanal、0.5mM NADP和2 mM MG/4 4-HNE/5 mM乙醛巍扛，通過測定340 nm下NADP的形成速率领跛。用分光光度法測定glo1活性，監(jiān)測S-D-乳酰谷胱甘肽形成通過在235 nm處的吸光度變化撤奸。

MG吠昭、3-DG和乙二醛的測量

在96 hpf時(shí)，每次測量約有50只斑馬魚幼魚用0.003%三卡因麻醉并迅速冷凍胧瓜。MG矢棚、3-DG和乙二醛的測定方法如前所述。

代謝組學(xué)分析

檢測是與海德堡生物研究中心的代謝組學(xué)核心技術(shù)平臺(tái)合作完成的贷痪。在96 hpf時(shí)幻妓，每次測量約有50只斑馬魚幼魚用0.003%三卡因麻醉并迅速冷凍。腺苷化合物、硫醇肉津、游離氨基酸强胰、脂肪酸和初級代謝物的測定如前所述。

逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)分析（RT-qPCR）

使用RNeasy Mini Kit按照制造商的協(xié)議（Qiagen）從TG（fli1：EGFP）斑馬魚幼魚/成魚器官中分離總RNA妹沙。根據(jù)制造商的協(xié)議（Thermo科學(xué)公司）偶洋，使用Maxima第一鏈cDNA合成試劑盒從1 μg RNA中進(jìn)行第一鏈cDNA生成。斑馬魚的引物設(shè)計(jì)采用NCBI或羅氏通用探針文庫分析設(shè)計(jì)中心進(jìn)行設(shè)計(jì)距糖，引物列于表S5玄窝。所有樣品均使用Power SYBR?GoreerPCR主混合試劑盒在96孔反應(yīng)板上使用。qPCR反應(yīng)采用QuantStudio 3實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行悍引。

RNA序列分析

在48 hpf時(shí)恩脂，從aldh3a1+/+和aldh3a1?/?的幼魚中分離到RNA。文庫的構(gòu)建和測序使用BGISEQ-500（北京基因組研究所趣斤，www.bgi.com俩块，BGI）進(jìn)行測序∨欤基因表達(dá)分析由醫(yī)學(xué)研究中心（ZMF）的微陣列分析核心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行玉凯。簡而言之，主要程序是用R和生物導(dǎo)體使用NGS分析包系統(tǒng)pipeR联贩。使用FastQC（巴布拉哈姆生物信息學(xué)）對原始測序reads進(jìn)行質(zhì)量控制漫仆。使用trim_galore（版本0.6.4）刪除了低質(zhì)量的reads。將得到的reads與UCSC中的斑馬魚基因組版本danRer11進(jìn)行比對泪幌，并使用卡利斯托版本0.46.1進(jìn)行計(jì)數(shù)盲厌。使用limma包中的voom函數(shù)將計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為log2-每百萬計(jì)數(shù)（logCPM）。差異表達(dá)分析采用limma軟件包進(jìn)行祸泪，以α = 0.05的R.A假陽性率和FDR校正為顯著性水平狸眼。

蛋白質(zhì)序列比對

來自斑馬魚（X1WBM4_DANRE）、人類（AL3A1_HUMAN）和小鼠（AL3A1_MOUSE）的Aldh3a1蛋白的氨基酸序列來自UniProt數(shù)據(jù)庫（http://www.unip rot.org/）浴滴。為了進(jìn)行比較，我們選擇了這些基因岁钓，并使用uniprot-自己的比對工具（http://www.uniprot.org/align/）進(jìn)行比對升略。

軟件

對于斑馬魚aldh3a1外顯子/內(nèi)含子區(qū)域，氨基酸和其他示意圖生成屡限，網(wǎng)站Ensembl（https://www.ens embl.org/）品嚣，Biorender（https://biorender.com/），Smart (http://smart. servier.com/)和Biorender（https://www.benchling.com/）被使用钧大。采用Leica LAS V3.8和V4.13軟件翰撑，定量分析主干血管系統(tǒng)、原發(fā)性胰腺和β細(xì)胞塊面積尺寸啊央。使用徠卡的LAS AF Lite軟件進(jìn)行截屏眶诈，Gimp進(jìn)行圖像切割涨醋，ImageJ進(jìn)行視網(wǎng)膜血管分析。采用“GCMS解決方案”軟件對GC/MS分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理逝撬。

統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均值和標(biāo)準(zhǔn)差（均值± SD）表示浴骂。不同組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義采用Student’s-t檢驗(yàn)或單因素方差分析（然后是事后Bonferroni，Sidak的多重比較）宪潮。臨床結(jié)果采用正態(tài)性檢驗(yàn)后的連續(xù)變量比較采用簡單t檢驗(yàn)溯警，分類變量比較采用χ2檢驗(yàn)。采用簡單線性分析方法計(jì)算糖化血紅蛋白狡相、空腹血糖與4-HNE之間的相關(guān)性梯轻。采用GraphPad Prism 8.3.0進(jìn)行分析，p值為0.05視為顯著性：**<0.05尽棕，***<0.01喳挑，***p < 0.001，****p < 0.0001萄金。

基金：該研究得到了德國基金會(huì)（CRC 1118和IRTG 1874/2）的資助蟀悦。作者感謝國家留學(xué)基金委（CSC 201706280041）的支持。作者感謝伊麗莎白·洛德博士的技術(shù)援助氧敢，霍恩博士的斑馬魚維護(hù)日戈，格諾特·波舍特博士和埃琳娜·海登賴希博士的代謝組實(shí)驗(yàn)援助，伊麗莎白·克里曼克教授的患者血液采集幫助孙乖。凱倫·比貝克博士協(xié)助RT-qPCR浙炼，卡羅萊納·德拉·托雷博士協(xié)助RNA質(zhì)量控制。作者感謝卓越集群“細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)”（海德堡大學(xué)）的代謝組學(xué)核心技術(shù)平臺(tái)和德國基金會(huì)（ZUK 40/2010-3009262）對基于UPLC的代謝物定量的支持唯袄。作者感謝曼海姆核心設(shè)施活細(xì)胞成像中心（DFG INST 91027/10-1FUGG）和斑馬魚核心設(shè)施曼海姆的支持弯屈。

原文網(wǎng)址：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2213231720309289

注：因文章篇幅有限，所有相關(guān)引用文獻(xiàn)恋拷，以及補(bǔ)充圖资厉、表可以點(diǎn)擊至原文查閱。