彭濤1,2, 周唯君1,2, 劉含1,2, 趙硯馳1,2, 李化1,2, 張鵬1,2, 周艷華1,2, 舒莉萍1,2

核糖體蛋白L15(ribosomal protein L15歇万，RPL15)屬于真核生物核糖體60S亞基的一個(gè)組成部分，分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)勋陪，主要定位于核仁并呈點(diǎn)狀分布贪磺。RPL15在核仁中的定位有利于核仁結(jié)構(gòu)的形成與維持，也可能參與rRNA的成熟過程[1]诅愚。核糖體蛋白除了主要參與蛋白質(zhì)合成過程外寒锚，也可通過參與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄违孝、RNA加工刹前、DNA修復(fù)等過程在細(xì)胞增殖、凋亡雌桑、發(fā)育的調(diào)控和惡性轉(zhuǎn)化等方面發(fā)揮作用腮郊。RPL15與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。研究表明筹燕，RPL15在胃癌轧飞、食管癌、結(jié)腸癌中過度表達(dá)[2]撒踪，與此相反过咬，在皮膚鱗狀細(xì)胞癌和胰腺導(dǎo)管腺癌中表達(dá)卻下調(diào)[3]。極光激酶抑制劑Danusertib可通過負(fù)性調(diào)控RPL15這個(gè)下游關(guān)鍵靶位點(diǎn)制妄，引起具有紅系分化潛能的K562細(xì)胞發(fā)生程序性死亡[4]掸绞。與此同時(shí)，研究表明RPL15基因被證實(shí)在先天性純紅細(xì)胞再生障礙性貧血(Diamoncl-Blackfan anemia耕捞，DBA)患者中存在突變[5]衔掸。但目前RPL15基因在紅系造血發(fā)育疾病發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制尚未闡述清晰，進(jìn)一步深入認(rèn)識RPL15基因?qū)t系造血發(fā)育的作用機(jī)制具有重要意義俺抽。通過比較發(fā)現(xiàn)人與斑馬魚Rpl15蛋白有79%的同源性敞映，更重要的是斑馬魚體外受精、體外發(fā)育磷斧、胚胎透明及產(chǎn)卵量大等優(yōu)勢振愿，使其成為研究疾病發(fā)生發(fā)展的良好模式生物捷犹。近幾年CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)因其系統(tǒng)設(shè)計(jì)簡單、成本低廉冕末、快捷高效等優(yōu)點(diǎn)萍歉，在斑馬魚基因編輯領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[6-7]。因此档桃，本研究選擇斑馬魚為研究對象枪孩，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對rpl15基因進(jìn)行敲除，通過測序篩選陽性突變體藻肄，觀察敲除rpl15斑馬魚的表型變化蔑舞，初步探討了敲除rpl15對斑馬魚紅系造血發(fā)育的影響，為研究rpl15在紅系造血疾病發(fā)生發(fā)展中的作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)仅炊。

1 材料與方法1.1 材料

Tubingen(本課題組飼養(yǎng))品系野生型斑馬魚斗幼，飼養(yǎng)于28.5 ℃恒溫自動(dòng)循環(huán)水系統(tǒng)中澎蛛，光暗周期比為12 h ∶12 h抚垄。取雌雄斑馬魚按1 ∶(1~2) 的比例放入產(chǎn)卵缸內(nèi)，用隔板分隔開谋逻，次日光照10 min后拔板呆馁，0.5 h后收集受精卵，胚胎置于28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)毁兆。

質(zhì)粒pSP6-2sNLS-spCas9由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院上海血液病研究所袁浩博士惠贈(zèng)浙滤；轉(zhuǎn)錄試劑盒(MEGAshortscript T7 Transcription kit)、mRNA純化試劑盒(mirVanaTM miRNA isolation kit)气堕、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit)和Cas9蛋白(TrueCutTM Cas9 Protein v2)試劑盒均購自美國Thermo Fisher Scientific公司纺腊；T7E1限制性內(nèi)切酶購自New England Biolabs(NEB)公司；PCR引物茎芭、DNA序列及DNA Marker購自Invitrogen公司揖膜；PCR試劑盒和普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒購自天根生化科技有限公司；斑馬魚血紅蛋白O-dianisidine染色試劑盒梅桩、斑馬魚中性粒細(xì)胞染色試劑盒購自蘇州木芮生物科技有限公司壹粟。

超微量分光光度計(jì)(NanoDrop one)購自Thermo Fisher Scientific公司；顯微注射儀(PLI-100)購自Harvard Apparatus公司宿百；Real-time PCR儀(C1000)購自Bio-Rad公司趁仙；體式顯微鏡(SMZ645)購自Nikon公司。

1.2 斑馬魚rpl15基因敲除

根據(jù)靶位點(diǎn)預(yù)測網(wǎng)站http://crispr.dbcls.jp/預(yù)測符合設(shè)計(jì)條件的rpl15基因的gRNA垦页。隨后通過靶位點(diǎn)評估網(wǎng)站http://www.oligoevaluator.com/什猖，在斑馬魚rpl15第一外顯子和第三外顯子處選取5個(gè)沒有脫靶且高效的靶位點(diǎn)(表 1)。同時(shí)設(shè)計(jì)各靶序列的鑒定引物另患。

采用PCR產(chǎn)物體外轉(zhuǎn)錄的方法合成gRNA犀斋。具體方法如下：在選取的靶位點(diǎn)序列前方添加T7啟動(dòng)子序列5′-TAATACGACTCACTATA-3′及識別堿基G律胀，后方添加部分骨架序列5′-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3′，然后以上述合成pT7-gRNAn (n=1貌矿、2炭菌、3、4逛漫、5) DNA片段作為正向引物(表 2)黑低，反向引物為gRNA骨架通用引物PRgRNA：5′-AAAAAAAGCACCGACTCGGT-3′。以pSP6-2sNLS-spCas9質(zhì)粒作為模板酌毡，通過PCR擴(kuò)增出轉(zhuǎn)錄所需DNA片段克握，PCR反應(yīng)條件為94 ℃，3 min; 30×(94 ℃枷踏，30 s菩暗；60 ℃，30 s旭蠕；72 ℃停团，1 min)；72 ℃掏熬，5 min佑稠，4 ℃保存。通過瓊脂糖凝膠電泳及測序檢測PCR產(chǎn)物是否正確旗芬，將測序結(jié)果正確的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后舌胶，用T7轉(zhuǎn)錄試劑盒體外轉(zhuǎn)錄gRNA。純化回收轉(zhuǎn)錄的gRNA并進(jìn)行濃度測定疮丛，gRNA原液分裝凍存于-80 ℃幔嫂。

分別將Cas9蛋白(250~300 pg/nL)與gRNA (25~35 pg/nL)等體積混勻后顯微注射到單細(xì)胞期野生型Tuebingen品系斑馬魚受精卵中。每個(gè)gRNA靶點(diǎn)注射200枚斑馬魚單細(xì)胞期受精卵誊薄，每枚受精卵注射1~2 nL混合物履恩。同時(shí)留取100枚注射等量體積DEPC水的同批胚胎作為對照。取受精后小時(shí)數(shù)(hours post-fertilization, hpf) 為72~96的F0存活胚胎和對照組存活胚胎各10枚暇屋，提取各組胚胎基因組DNA似袁。以基因組DNA為模板，采用相應(yīng)鑒定引物進(jìn)行PCR反應(yīng)(表 3)咐刨，得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收昙衅。T7E1酶切檢測敲除效率，將發(fā)生突變的PCR產(chǎn)物送TA克隆測序定鸟，檢測每條魚體細(xì)胞主要的突變類型而涉。

將有效的gRNA和Cas9蛋白混合物顯微注射入野生型(wild type, WT)斑馬魚單細(xì)胞期受精卵中，于48~72 hpf在體式顯微鏡下觀察并記錄異常表型联予。用50 mmol/L的NaOH和1 mol/L的Tris-HCL提取單個(gè)具有明顯突變表型斑馬魚胚胎的基因組啼县，用相應(yīng)鑒定引物進(jìn)行PCR反應(yīng)材原。擴(kuò)增產(chǎn)物送測序確認(rèn)體細(xì)胞突變類型。

1.3 rpl15突變體表型的驗(yàn)證

收取48 hpf和72 hpf的野生型及rpl15突變型幼魚各10尾季眷，采用斑馬魚血紅蛋白O-dianisidine染色試劑盒進(jìn)行檢測余蟹，具體方法參考試劑盒說明書。

收取72 hpf的野生型及rpl15突變型幼魚各10尾子刮，采用斑馬魚中性粒細(xì)胞染色試劑盒進(jìn)行檢測威酒，具體方法參考試劑盒說明書。

收集72 hpf的野生型和rpl15突變型幼魚各10尾挺峡，分別提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA葵孤。針對斑馬魚原始造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子scl、定向造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子c-myb橱赠、髓系轉(zhuǎn)錄因子pu. 1尤仍、紅系轉(zhuǎn)錄因子gata 1、中性粒細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子mpo狭姨、巨噬/單核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子l-plastin宰啦、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子rag 1、α-globin送挑、熱休克蛋白70(heat shock protein 70绑莺，hsp 70)暖眼、抑癌基因p53和雙微染色體2基因(murine double mimute 2惕耕，mdm 2)及內(nèi)參基因gapdh設(shè)計(jì)qRT-PCR引物(表 4)。

各實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次诫肠，使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析司澎。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 成功制備gRNA

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示栋豫，成功轉(zhuǎn)錄出gRNA1挤安、gRNA2、gRNA3丧鸯、gRNA4及gRNA5(圖 1)蛤铜。超微量分光光度計(jì)測定gRNA1、gRNA2丛肢、gRNA3围肥、gRNA4及gRNA5濃度分別為85、101蜂怎、50穆刻、83及76 ng/μL。

圖1 體外轉(zhuǎn)錄合成gRNA

M: DNA標(biāo)準(zhǔn)(DL600)杠步；1: rpl15-gRNA1氢伟；2：rpl15-gRNA2榜轿；3：rpl15-gRNA3；4：rpl15 -gRNA4朵锣；5：rpl15 -gRNA

2.2 分析rpl15 -gRNA5有效性

將gRNA1谬盐、gRNA2、gRNA3诚些、gRNA4及gRNA5與Cas9蛋白混合物顯微注射到斑馬魚單細(xì)胞期受精卵设褐，提取72 hpf胚胎(10枚/組)基因組，并進(jìn)行鑒定DNA片段的擴(kuò)增泣刹。T7E1酶切純化后的PCR產(chǎn)物助析，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示僅有g(shù)RNA5有效(圖 2A)。同時(shí)PCR產(chǎn)物測序結(jié)果顯示在rpl15 -gRNA5靶位點(diǎn)(黑色框所標(biāo)注序列)附近出現(xiàn)重疊峰(圖 2B)椅您，確定rpl15 -gRNA5可有效誘導(dǎo)靶位點(diǎn)發(fā)生突變外冀。采用gRNA5和Cas9蛋白混合物批量顯微注射斑馬魚單細(xì)胞期受精卵，孵育3~5 d收集胚胎提取DNA并利用gRNA5靶位點(diǎn)鑒定引物進(jìn)行PCR掀泳，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆測序雪隧，篩選出有移碼突變的F0代斑馬魚并檢測體細(xì)胞主要的突變類型，顯示靶位點(diǎn)附近有插入员舵、缺失及單個(gè)堿基突變(圖 2C)脑沿。

圖 2 測序及T7E1酶切檢測gRNA5的作用

A: T7E1酶切鑒定gRNA5靶位點(diǎn)發(fā)生突變M: DNA標(biāo)準(zhǔn)(DL 600)；1:野生型斑馬魚組马僻；2: gRNA5/Cas9蛋白混合物注射組庄拇；B: PCR產(chǎn)物測序峰圖WT: 野生型斑馬魚組；MU(MIX) : gRNA5/Cas9混合物注射組韭邓；黑色方框標(biāo)記gRNA5靶位點(diǎn)序列措近；黑色線標(biāo)記基因組序列開始突變的位置；C: 代表性體細(xì)胞突變類型下劃線表示靶位點(diǎn)序列女淑；綠色表示PAM序列瞭郑；黃色表示單個(gè)突變后的堿基；藍(lán)色表示插入堿基鸭你；紅色虛線表示缺失堿基

2.3 篩選出rpl15突變體

顯微注射rpl15 -gRNA5和Cas9蛋白混合物到斑馬魚單細(xì)胞期受精卵屈张，提取具有明顯異常表型斑馬魚胚胎的基因組并進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物送測序袱巨。結(jié)果顯示具有明顯異常表型的斑馬魚胚胎均為rpl15基因突變體阁谆，其中包括MU1突變體(圖 3A)。通過比對氨基酸序列及移碼突變在Rpl15蛋白的位置(圖 3B)瓣窄，確定MU1突變屬移碼突變笛厦，且突變體只翻譯了120個(gè)氨基酸，破壞了Rpl15的功能域俺夕。以上結(jié)果表明通過顯微注射rpl15-gRNA5和Cas9蛋白混合物可成功篩選得到rpl15基因突變體裳凸。因此贱鄙，后續(xù)將選擇具有明顯突變表型的斑馬魚胚胎進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

圖 3 斑馬魚rpl15突變體的鑒定

A：gRNA5作用靶位點(diǎn)測序結(jié)果WT：野生型斑馬魚姨谷；MU1：rpl15突變體逗宁；黑色方框標(biāo)記靶位點(diǎn)序列；B：rpl15突變型氨基酸序列及其所在蛋白質(zhì)序列位置WT：野生型斑馬魚序列梦湘；MU1：rpl15突變體序列瞎颗；紅色方框表示第1個(gè)產(chǎn)生移碼突變的氨基酸是第119位氨基酸；121位氨基酸(終止密碼子)表示突變體翻譯到這個(gè)位點(diǎn)終止捌议，藍(lán)色實(shí)線表示移碼突變發(fā)生在Rpl15蛋白功能結(jié)構(gòu)域中

通過對比觀察野生型和突變型斑馬魚的發(fā)育形態(tài)發(fā)現(xiàn)哼拔，突變型斑馬魚胚胎，在受精后有明顯的發(fā)育延遲瓣颅，達(dá)到相同的發(fā)育時(shí)期較野生型斑馬魚晚3~4 h倦逐。突變型斑馬魚胚胎于48、72宫补、96 hpf均表現(xiàn)出明顯的形態(tài)異常檬姥，具體包括體長縮短、向腹側(cè)彎曲的尾巴粉怕、頭部和眼睛較小及心包水腫(圖 4A)健民。約95%的突變型斑馬魚于7~10 d發(fā)生死亡(圖 4B)。

圖 4 rpl15突變對斑馬魚表型影響(×40)

A：rpl15突變型胚胎48贫贝、72及96 hpf表型黑色箭頭示“心包水腫”改變部位秉犹；紅色箭頭示尾部彎曲部位；e：眼睛部位平酿；B：突變型胚胎生存曲線凤优；C：72 hpf時(shí)突變型和野生型斑馬魚血紅蛋白染色結(jié)果統(tǒng)計(jì)數(shù)值表示不同血紅蛋白減少程度的胚胎數(shù)量悦陋，與野生型比較O-dianisidine染色陽性結(jié)果程度分為正常(黑色)蜈彼、中度減少(灰色)和重度減少(白色)3個(gè)水平，野生型組斑馬魚O-dianisidine染色均呈正常陽性結(jié)果俺驶；D：48 hpf和72 hpf突變型及野生型斑馬魚血紅蛋白O-dianisidine染色結(jié)果黑色箭頭示染色結(jié)果區(qū)域

48 hpf和72 hpf斑馬魚血紅蛋白O-dianisidine染色顯示幸逆，突變型斑馬魚較野生型斑馬魚的血紅蛋白染色陽性情況明顯減少(圖 4C、D)暮现。

2.5 rpl15突變體造血相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的變化

血紅蛋白染色發(fā)現(xiàn)rpl15敲除后斑馬魚存在血紅蛋白合成減少的現(xiàn)象还绘，通過比較rpl15敲除前后scl、c-myb栖袋、pu. 1拍顷、gata1、mpo塘幅、l-plastin昔案、rag1和α-globin的mRNA水平的表達(dá)變化尿贫，進(jìn)一步驗(yàn)證斑馬魚rpl15突變體對紅系造血發(fā)育的影響是否具有特異性。結(jié)果顯示踏揣，突變型胚胎的gata 1和α-globin的表達(dá)水平較野生型胚胎顯著下調(diào)(P < 0.05庆亡，P < 0.01)；突變型胚胎的scl捞稿、c-myb又谋、pu. 1、mpo娱局、l-plastin和rag 1的表達(dá)水平較野生型胚胎差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05彰亥，圖 5A)。斑馬魚中性粒細(xì)胞染色結(jié)果顯示衰齐，rpl15突變型胚胎與野生型胚胎染色結(jié)果無明顯差異(圖 5B)剩愧。表明rpl15突變體對斑馬魚紅系造血發(fā)育的損害具有特異性。

圖 5 rpl15突變體對斑馬魚造血發(fā)育的影響(×40)

A：造血相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的mRNA水平變化WT：72 hpf的野生型魚娇斩；MUT：72 hpf的rpl15突變型斑馬魚仁卷；a：P < 0.05, b：P < 0.01，與野生型比較犬第；B：斑馬魚中性粒細(xì)胞染色結(jié)果黑色箭頭示染色結(jié)果陽性區(qū)域

通過比較rpl15敲除前后gata 1分子伴侶hsp70锦积、p53和mdm2的mRNA水平的表達(dá)變化，來分析rpl15突變損害斑馬魚紅系發(fā)育的相關(guān)調(diào)控機(jī)制歉嗓。結(jié)果顯示丰介，突變型胚胎的p53和mdm2的表達(dá)水平較野生型胚胎顯著增加(P < 0.01，P < 0.05)鉴分；hsp 70表達(dá)顯著下調(diào)(P < 0.05哮幢，圖 6)。初步表明p53相關(guān)通路及gata1分子伴侶hsp70可能參與了rpl15缺失對斑馬魚紅系造血影響的調(diào)控志珍。

圖 6 Real-time PCR檢測rpl15突變胚胎p53橙垢、mdm2、hsp70的mRNA表達(dá)水平

WT: 72 hpf的野生型斑馬魚伦糯；MUT：72 hpf的rpl15突變型斑馬魚柜某；a: P < 0.01, b: P < 0.05，與野生型比較

人的RPL15基因突變已在先天性純紅細(xì)胞再生障礙性貧血患者中被發(fā)現(xiàn)敛纲。迄今為止幾乎所有驅(qū)動(dòng)DBA遺傳病變的基因均在核糖體蛋白基因家族中被發(fā)現(xiàn)喂击。因此，DBA被認(rèn)為是一種核糖體疾病淤翔。近些年翰绊，與DBA疾病相關(guān)的核糖體蛋白突變研究在小鼠上陸續(xù)開展。目前，利用Cre/loxP系統(tǒng)策略成功構(gòu)建了條件性敲除Rps19监嗜、Rpl11基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型琳要，表現(xiàn)出與DBA患者相似的生長遲緩和貧血的表型[8]。然而秤茅，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型存在實(shí)驗(yàn)周期長稚补、成本高和不適用于對潛在治療藥物進(jìn)行高通量篩選的缺點(diǎn)。與小鼠相比框喳，斑馬魚則憑借胚胎透明课幕、易于觀察、產(chǎn)卵量大和發(fā)育快的優(yōu)勢五垮，使其成為觀察早期造血發(fā)育和用于大規(guī)模篩選潛在治療藥物的理想模型乍惊。目前，利用嗎啉環(huán)修飾的反義寡核苷酸(morpholino放仗，MO)技術(shù)下調(diào)rps19润绎、rpl5、rpl35A诞挨、rps24和rps7基因均較好地重現(xiàn)了DBA表型[9-11]莉撇。同時(shí)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)也成功構(gòu)建了rpl11、rps9和rps29基因突變的DBA疾病相關(guān)斑馬魚模型[12-14]惶傻。鑒于rpl15在DBA疾病發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制研究仍不明確棍郎，且在斑馬魚上rpl15敲除模型的建立仍有空缺，因此本課題致力于研究rpl15對斑馬魚造血的影響银室，從而進(jìn)一步探究其在DBA發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制作用涂佃。

本研究利用CRISPR/Cas9定向基因編輯技術(shù)敲除斑馬魚rpl15基因，共設(shè)計(jì)了5條gRNA蜈敢，分別與Cas9蛋白共注射到單細(xì)胞期斑馬魚受精卵中辜荠。結(jié)果顯示，gRNA5對rpl15具有高效的編輯作用抓狭。通過批量顯微注射gRNA5/Cas9蛋白混合物到單細(xì)胞期斑馬魚受精卵中伯病，成功篩選獲得rpl15突變體。其中包括MU1突變型個(gè)體辐宾，該個(gè)體產(chǎn)生了移碼突變且提前終止翻譯狱从，從而破壞了Rpl15的功能域。研究表明叠纹，已建立的DBA疾病相關(guān)斑馬魚模型具有頭部發(fā)育不全、尾巴彎曲敞葛、體長縮短誉察、心包水腫和體內(nèi)血紅蛋白合成減少等表型。與之前結(jié)果相一致惹谐，本研究在rpl15突變體也觀察到了相同的表型持偏，而且rpl15突變體表現(xiàn)出了更為嚴(yán)重的心包水腫現(xiàn)象驼卖。這與研究報(bào)道的人RPL15基因突變的DBA患者出現(xiàn)非常嚴(yán)重的早期胎兒水腫癥狀一致[15]。此外本研究證實(shí)rpl15突變體原始造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子scl鸿秆、定向造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子c-myb酌畜、髓系轉(zhuǎn)錄因子pu. 1、中性粒細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子mpo卿叽、巨噬/單核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子l-plastin及淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子rag 1的mRNA表達(dá)水平與對照組相比無明顯差異桥胞，同時(shí)中性粒細(xì)胞染色也證實(shí)rpl15突變型胚胎與野生型胚胎的中性粒細(xì)胞生成情況無明顯差異，但紅系轉(zhuǎn)錄因子gata 1和α-globin的mRNA表達(dá)水平與對照組相比均顯著下調(diào)考婴，提示rpl15突變體特異性的損害了斑馬魚紅系造血發(fā)育贩虾。這些結(jié)果表明，利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯斑馬魚rpl15構(gòu)建DBA疾病相關(guān)斑馬魚模型具有重要意義沥阱。

斑馬魚DBA疾病相關(guān)模型研究報(bào)道證實(shí)缎罢，核糖體突變體胚胎形態(tài)發(fā)育異常及貧血表型的形成與p 53通路密切相關(guān)。大量研究證實(shí)在斑馬魚DBA疾病相關(guān)模型中下調(diào)p53均可一定程度挽救突變體形態(tài)發(fā)育上的缺陷考杉。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)抑制p53的表達(dá)可以部分挽救rpl18策精、rpl11和rps9等突變體中紅系造血發(fā)育的缺陷[13, 16]。本研究結(jié)果顯示崇棠，rpl15突變體p53和mdm2基因的mRNA水平顯著增高蛮寂。當(dāng)rpl15發(fā)生突變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致游離核糖體蛋白在核仁內(nèi)累積易茬，從而與mdm2發(fā)生結(jié)合[17]酬蹋。在與上述游離核糖體蛋白結(jié)合后，Mdm2泛素連接酶的活性受到抑制抽莱，而這會(huì)激活p53的表達(dá)范抓，從而導(dǎo)致相應(yīng)細(xì)胞周期停滯和凋亡的發(fā)生[18]。表明p53通路可能在斑馬魚rpl15突變體表型的形成中發(fā)揮重要作用食铐。此外研究表明匕垫，紅系分化過程中HSP70可從細(xì)胞質(zhì)遷移到細(xì)胞核，以保護(hù)GATA1免受caspase-3介導(dǎo)的分裂虐呻，從而正常調(diào)控紅系分化發(fā)育[19-20]象泵。本研究結(jié)果顯示，rpl15突變體的gata1斟叼、hsp70的mRNA水平顯著下調(diào)偶惠。hsp70轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)可能將導(dǎo)致Gata1受到caspase-3的裂解，從而致使rpl15突變體的紅系造血發(fā)育受損朗涩。

綜上所述忽孽，本研究發(fā)現(xiàn)通過CRISPR/Cas9技術(shù)編輯斑馬魚rpl15基因，可以獲得具有形態(tài)發(fā)育異常并伴有貧血表型的突變體。初步認(rèn)為p 53通路和hsp70可能參與調(diào)控rpl15突變體表型的形成兄一，有助于進(jìn)一步探究rpl15在相關(guān)疾病發(fā)生厘线、發(fā)展中的作用。

參考文獻(xiàn)