摘要

背景:冠狀動脈阻塞后的缺血性心臟病導(dǎo)致心臟組織死亡和纖維化疤痕的形成。與成年哺乳動物相比陪腌，斑馬魚的心臟在損傷后可以再生辱魁，這使得研究潛在機制成為可能。成年斑馬魚心臟損傷后最早的反應(yīng)之一是冠狀動脈血管重建術(shù)偷厦。這一過程中的缺陷導(dǎo)致心肌細胞再生受損和瘢痕形成商叹。因此，識別和研究促進冠狀動脈血運重建的因素具有很大的治療潛力只泼。

方法:我們使用整體成像剖笙、免疫組織化學(xué)和組織學(xué)來評估斑馬魚心臟再生的各個方面。深入的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析使我們能夠確定Vegfc(血管內(nèi)皮生長因子C)信號的靶標(biāo)和潛在效應(yīng)物请唱。我們使用新生成的功能喪失和功能獲得遺傳工具來研究Emilin2a(彈性蛋白微纖維界面2a)和Cxcl8a(趨化因子(C-X-C)基序配體8a)- cxcr1(趨化因子(C-X-C)基序受體1)信號在心臟再生中的作用弥咪。

結(jié)果:我們首先表明，再生的冠狀動脈內(nèi)皮細胞在成年斑馬魚心臟損傷時上調(diào)vegfc十绑，并且vegfc信號是其再生過程中增殖所必需的聚至。值得注意的是，阻斷Vegfc信號還能顯著減少心肌細胞的去分化和增殖本橙。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析扳躬，我們確定了emilin2a是Vegfc信號的靶點，并發(fā)現(xiàn)操縱emilin2a的表達可以調(diào)節(jié)冠狀動脈血運重建和心肌細胞增殖甚亭。機制上贷币，Emilin2a在心外膜源性細胞中誘導(dǎo)趨化因子基因cxcl8a的表達，而cxcl8a受體基因cxcr1在冠狀動脈內(nèi)皮細胞中表達亏狰。我們進一步表明役纹，在心臟再生過程中，Cxcl8a-Cxcr1信號傳導(dǎo)也是冠狀動脈內(nèi)皮細胞增殖所必需的暇唾。

結(jié)論:這些數(shù)據(jù)表明促脉，心臟損傷后辰斋，冠狀動脈內(nèi)皮細胞上調(diào)vegfc，促進冠狀動脈網(wǎng)絡(luò)重建和心臟再生瘸味。在機制上宫仗，Vegfc信號上調(diào)心外膜emilin2a和cxcl8a的表達，促進心臟再生硫戈。這些研究有助于理解斑馬魚冠狀動脈血運重建的機制锰什，對促進受傷人類心臟的血運重建和再生具有潛在的治療意義。

關(guān)鍵詞:冠狀血管丁逝、內(nèi)皮細胞汁胆、心肌梗死、再生霜幼、斑馬魚嫩码。

前言

缺血性心臟病是由冠狀動脈狹窄引起的流向心臟的血液減少引起的。冠狀動脈阻塞導(dǎo)致心肌梗死(MI)罪既，導(dǎo)致下游組織死亡铸题。這些事件導(dǎo)致心臟纖維化和重塑，因此琢感，鑒于成年哺乳動物心臟無法再生丢间，這給醫(yī)學(xué)帶來了重大挑戰(zhàn)。在人類心肌梗死后驹针，新的毛細血管通過血管生成從原有的毛細血管中生長出來烘挫，以幫助受傷組織重新充氧。此外柬甥，在動脈生成過程中饮六，心外膜側(cè)支通過預(yù)成型側(cè)支的擴大和增寬而發(fā)育，以幫助缺血區(qū)域苛蒲。與側(cè)支形成程度較小的患者相比卤橄，側(cè)支形成程度較大的患者在心肌梗死后表現(xiàn)出更好的預(yù)后。這些觀察結(jié)果促使研究人員開發(fā)血管生成和動脈生成療法來治療心肌梗死臂外，然而窟扑，臨床試驗證明是無效的。因此漏健，了解在再生環(huán)境中調(diào)節(jié)冠狀動脈網(wǎng)絡(luò)重建的機制可能最終導(dǎo)致有益的臨床結(jié)果辜膝。在過去的二十年里，斑馬魚被廣泛用作研究心臟再生的模式生物漾肮，因為它的心臟具有非凡的再生能力。最近的研究表明茎毁，受損組織的冠狀動脈血運重建對于完整的再生反應(yīng)至關(guān)重要克懊。在斑馬魚心臟損傷后忱辅，冠狀動脈內(nèi)皮細胞(cECs)迅速進入細胞周期并重建損傷組織。再生的冠狀動脈從先前存在的血管表面和心室內(nèi)發(fā)芽谭溉，形成一個支架墙懂，供心肌細胞重新填充受傷的組織。阻斷這一過程會減少心肌細胞的增殖和受傷組織的再生扮念，以及增加疤痕损搬。考慮到冠狀動脈血運重建的重要性柜与，確定有助于這一過程的分子具有巨大的治療潛力巧勤。

最近的研究強調(diào)了血管分泌因子在組織穩(wěn)態(tài)和修復(fù)中的重要性。血管分泌分子由內(nèi)皮細胞分泌弄匕，可對鄰近組織產(chǎn)生各種影響颅悉。在眾多血管分泌分子中，Vegfc(血管內(nèi)皮生長因子C)在心室冷凍損傷和切除后其基因表達水平均顯著上調(diào)迁匠，并且在成年小鼠心臟心肌梗死后剩瓶，腹腔注射VEGFC可以改善心輸出量和表現(xiàn)。Vegfc調(diào)節(jié)小鼠和斑馬魚發(fā)育過程中以及成年斑馬魚心臟中的淋巴管生成城丧。VEGFC還調(diào)節(jié)不同發(fā)育環(huán)境下的血管新生延曙。例如，添加VEGFC可以刺激雞胚胎和小鼠角膜的血管新生發(fā)芽亡哄。在斑馬魚中枝缔，使用morpholinos抑制vegfc可減少節(jié)間血管發(fā)芽。相反磺平，在斑馬魚胚胎中魂仍，過表達一種構(gòu)成活性形式的人類VEGFC導(dǎo)致節(jié)段間血管過度增生，進一步強調(diào)了vegfc在調(diào)節(jié)血管新生中的作用拣挪。最近的研究也表明VEGFC在調(diào)節(jié)冠狀動脈發(fā)展中起重要作用擦酌。Vegfc突變小鼠的心室顯示心外膜下冠狀動脈的覆蓋范圍和分支顯著減少。此外菠劝，冠狀動脈疾病患者的隊列研究進一步表明赊舶，高水平循環(huán)VEGFC的患者預(yù)后更好。此外赶诊，心肌內(nèi)給藥VEGFC促進了豬心肌梗死后側(cè)支動脈的形成笼平。然而，VEGFC信號誘導(dǎo)心臟損傷后冠狀動脈血運重建或側(cè)支形成的機制尚不清楚舔痪。

本研究表明寓调，成年斑馬魚心臟損傷后，Vegfc信號通過正向調(diào)節(jié)emilin2a(一種編碼細胞外基質(zhì)(ECM)成分的基因)的表達锄码，促進cEC和心肌細胞增殖夺英。使用組織特異性功能增益工具晌涕，我們發(fā)現(xiàn)Emilin2a也是一種誘導(dǎo)cEC增殖和疤痕消退的促再生因子。在機制上痛悯，Emilin2a誘導(dǎo)心外膜源性細胞(EPDCs)中趨化因子基因cxcl8a的表達余黎，而其受體cxcr1在再生的cECs中表達。我們的研究結(jié)果進一步表明载萌，Cxcl8a-Cxcr1信號同樣是冠狀動脈血運重建和疤痕消退所必需的惧财。總的來說扭仁，這些結(jié)果強調(diào)了血管分泌分子Vegfc在調(diào)節(jié)基質(zhì)相關(guān)因子中的作用垮衷，從而為成年斑馬魚的心臟再生創(chuàng)造更寬松的環(huán)境。

材料和方法

斑馬魚的處理符合機構(gòu)(MPG)和國家動物福利立法斋枢，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程進行維護(https://zfin.org)帘靡。涉及動物的程序按照達姆施塔特地區(qū)委員會獸醫(yī)部門的規(guī)定進行并經(jīng)其批準(zhǔn)。本研究大部分使用長度為27-28毫米的3個月大的雄性和雌性斑馬魚瓤帚。除圖S2E-F外描姚，在所有情況下都使用了野生型(WT)。我們使用了先前發(fā)表的細胞系Tg(hsp701:slft4)bns82戈次、Tg(hsp701:vegfaa121-F17A)bns100(以下簡稱Tg(hsp701:dn-vegfaa))轩勘、Tg(-0.8flt1:RFP)hu5333、Tg(my17:DsRed)s879怯邪、TgBAC(tcf21:NTR-mCherry) pd10879(以下簡稱Tg(tcf21:mCherry))绊寻、TgBAC(tcf21:CreERT2)pd42、Tg(-5.2lyve1b:DsRed)nz101悬秉、Tg(flt1:Mmu.Fos-GFP)wz2澄步、vegfchu5055、vegfdbns257和cxcr1sa14414和泌。如前所述進行冷凍損傷村缸。通過將斑馬魚置于預(yù)熱系統(tǒng)水(39?C)中每12小時進行1小時的熱休克處理，誘導(dǎo)hsp70l驅(qū)動轉(zhuǎn)基因的表達武氓。Tg (hsp70l: sflt4);TgBAC(tcf21:CreERT2)梯皿、Tg(hsp701:loxP-CFP-loxPemilin2a-p2A-mCherry);在冷凍損傷前連續(xù)3天，在成年斑馬魚中腹腔注射10μl 1.25 mM 4-羥他莫昔芬(Sigma (Cat#H7904))或載體(乙醇)县恕，然后在39?C下每天熱休克1小時东羹，每12小時。Tg(-0.8flt1:RFP)斑馬魚用SB225002 (Sigma (Cat#182498-32-4))或DMSO注射20μl 0.01 mM DMSO (Sigma (Cat#D4540))或20μl 0.01 mM SB225002(溶解在DMSO中忠烛，用水稀釋)属提。在心內(nèi)注射Qdots 705 (Qtracker Q21061MP, Thermo Fisher Scientific)時，先用0.02%的三卡因麻醉斑馬魚美尸。切開一個小切口露出心室垒拢，用微注射器將5μl Qdots 705注射到心臟組織中旬迹。斑馬魚被留在水中恢復(fù)。然后在注射后90分鐘內(nèi)解剖心臟求类。

突變和轉(zhuǎn)基因系的構(gòu)建

為建立Tg(hsp701:emilin2a, cryaa:CFP)bns504系，在單細胞期向WT斑馬魚胚胎注射25 pg/nl的hsp701:emilin2a, cryaa:cerulean質(zhì)粒DNA和I-Sce酶(NEB (Cat# R0694S))屹耐。將注射后的胚胎培養(yǎng)至成年尸疆，通過檢測CFP在幼魚眼中的表達來篩選奠基者。為了建立Tg(hsp701:loxP-CFP-loxP-emilin2a-p2A-mCherry)bns510系(以下簡稱Tg(hsp701:LCLemilin2a-p2A-mCherry))惶岭，在單細胞期向WT斑馬魚胚胎注射30 pg/nl的hsp701:loxP-CFP-loxP-emilin2a-p2A-mCherry質(zhì)粒DNA和50 ng/μl的Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA寿弱。培養(yǎng)注射胚胎，進行2次39℃高溫沖擊按灶，每次1小時症革，通過異種雜交篩選胚胎中CFP的表達。如前所述鸯旁，使用CRISPR-Cas9技術(shù)使用兩個gRNAs分別靶向外顯子1和9噪矛，序列為AGCAGTGCGGACCAAGGCCA和TACCCGTCAAGTCTGTTCCA，生成emilin2abns556全位點缺失等位基因铺罢。使用該方法艇挨，刪除了31.1 kb的基因組區(qū)域，并使用DyNAmo Flash SYBR Green qPCR主混合物(Thermo Fisher Scientific (Cat# F415S))和以下程序進行PCR鑒定突變體:在50°C孵育2分鐘韭赘，在95°C預(yù)擴增10分鐘缩滨，然后在95°C和60°C分別進行40次擴增10秒和30秒。引物序列列于表S2泉瞻。使用序列為CCTTGATGACAACTGGAC的gRNA生成了cxcl8avu660等位基因脉漏，該基因在第3外顯子上缺失了28個堿基對，插入了12個堿基袖牙。合成gRNA時只磷，將2.5 μL含BSA的2x NEB緩沖液2與1μL 10μM的通用寡核苷酸t(yī)tttgcaccgactcggtgccacttttcaagttgataacactccttttcaagttgattctctaaaa和1 μL 10μM的位點特異性寡核苷酸t(yī)aatacactcactataggccttgatgacaactggacgttttagagctagaaatagcaag混合。寡核苷酸使用以下程序退火:98?C 1分鐘附较，冷卻到37?C孩灯，斜坡速度為- 0.1?C/s。500 μM的dNTP和T4 DNA聚合酶(NEB (Cat# M0203S))加入到退火混合物中碉怔，在12?C下孵育20分鐘烘贴。在75℃下孵育20分鐘，使T4 DNA聚合酶失活撮胧。使用MEGA短腳本T7試劑盒(Invitrogen (Cat# AM1354))按照制造商的方案合成gRNA桨踪。使用PrimeStar (Takara (Cat# R045))進行PCR鑒定突變體，程序如下:95°C預(yù)擴增2分鐘芹啥，然后在95°C锻离、60°C和72°C分別進行40次擴增铺峭，擴增時間為10秒、60°C和72°C(引物序列列于表S2)汽纠，然后對ms11酶擴增子進行限制性酶解(NEB (Cat# R0571S))卫键。

組織學(xué)分析、成像和定量

解剖斑馬魚心臟虱朵，在4%多聚甲醛室溫下固定1小時莉炉。將心臟包埋在OCT (Tissue-Tek)中，切成8μm的切片碴犬。對于每個生物重復(fù)絮宁，使用3個非淺表非連續(xù)正中矢狀面切片進行成像和定量。如前所述進行免疫染色服协。使用的一抗:抗me2 (Santa Cruz Biotechnology, Cat#sc-313, AB_631920)绍昂， 1:20)，抗n2.261 (DSHB, RRID: AB_531790, 1:20)偿荷，抗gfp (Aves Labs (Cat#GFP-1010, AB_2307313)窘游， 1:50)，抗rfp (Rockland (Cat# 600-401-379,AB_2209751)遭顶， 1:20)张峰，抗pcna (Santa Cruz Biotechnology, Cat#sc-56, AB_628110, 1:500)和抗fli1a (Abcam (Cat#ab133485, AB_2722650)， 1:100)棒旗。使用的二抗:Alexa Fluor 488山羊抗雞IgG (H+L) (Thermo Fisher Scientific(Cat# A-11039, AB_142924)喘批， 1:500)， Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG (H+L) (Thermo Fisher Scientific(Cat#A-11029, AB_138404)铣揉， 1:500)饶深， Alexa Fluor 568山羊抗小鼠IgG (H+L) (Thermo Fisher Scientific(Cat# A-11004, AB_2534072)， 1:500)逛拱， Alexa Fluor 647山羊抗兔IgG (H+L) (Thermo Fisher Scientific(Cat# A-21244, AB_2535812)敌厘， 1:500)。對照實驗通過從免疫染色過程中省略一抗來進行朽合。使用LSM700顯微鏡(蔡司)獲得共聚焦圖像俱两。對于cEC的增殖分析，使用ZEN Blue軟件計算損傷組織和損傷邊界區(qū)域200μm內(nèi)cEC總數(shù)的比值曹步，計算增殖cEC的百分比宪彩。對于CM去分化和增殖分析，使用ZEN Blue軟件計算去分化/增殖CM的百分比讲婚，以傷害邊界區(qū)100μm內(nèi)CM總數(shù)的比率計算尿孔。對于冠狀動脈覆蓋分析，使用ImageJ軟件在至少4個生物重復(fù)的全量圖像中計算熒光強度百分比與受傷組織背景熒光的比值。Qdots整體成像采用蔡司Lightsheet Z.1顯微鏡活合，圖像處理采用ZEN Blue軟件雏婶。使用AFOG(酸性品紅橙G)染色試劑盒(Biognost (Cat#: AFOG100T))按照制造商的方案進行AFOG染色，不進行H&E染色白指。使用尼康SMZ25立體顯微鏡拍攝圖像留晚。對于疤痕面積分析，使用ImageJ軟件在至少4個生物重復(fù)的每個腦室的3個非連續(xù)切片中計算疤痕面積與總腦室面積的比值告嘲。對于原位雜交倔丈，將解剖的心臟在無菌的4%多聚甲醛中固定在4?C過夜。心臟在PBS中洗滌兩次状蜗，持續(xù)5分鐘，然后通過depc水中的乙醇梯度孵育15-30分鐘:50%鹉动、70%轧坎、80%、95%和100%泽示，室溫下缸血。心臟在50%二甲苯乙醇和100%二甲苯中洗滌30分鐘，室溫下械筛，在50?C的100%石蠟中洗滌3次捎泻，持續(xù)1小時。將心臟包埋在石蠟中埋哟，在4?C保存笆豁，切片成8μm的切片，并在室溫下保存赤赊。切片在二甲苯中洗滌兩次闯狱，持續(xù)10分鐘，然后在depc水中的乙醇梯度中再水化2分鐘:100%抛计、95%哄孤、80%、70%和50%吹截。然后用TBST (Tris 50mM pH 7.4, NaCl 150mM, 0.05% Tween-20)洗滌2次瘦陈，共5分鐘。然后載玻片在無菌的4% PFA中孵育20分鐘波俄，然后在TBST中洗滌2次晨逝。將載玻片用TBS (Tris 50mM pH7.4, NaCl 150mM) + CaCl2 2mm)稀釋的0.5μg/mL蛋白酶K在37℃下孵育15分鐘，然后用冷Tris/Glycine (Tris 50mM pH7.4, 50mM Glycine)洗滌5分鐘以停止反應(yīng)弟断。載玻片在TBST中洗滌兩次咏花，然后在無菌的4% PFA中重新固定5分鐘，并用TBST洗滌。載玻片浸泡在三乙醇胺(0.1 M, pH 8.0)中昏翰，加入乙酸酐至0.25%苍匆，攪拌12分鐘。該步驟之后棚菊，在60?C - 65?C條件下浸踩，使用雜交緩沖液(50%甲酰胺，5X SSC, 0.1% Tween-20, 50μg/ml肝素统求，500μg/ml酵母t-RNA, 460μl 1M檸檬酸)進行兩次TBST洗滌和切片預(yù)雜交至少1小時检碗。探針(雜交緩沖液中1μg/ml)在60?C - 65?C下變性15分鐘，并在60?C - 65?C下過夜码邻。在60?C - 65?C條件下折剃，用50%甲酰胺在2X SSC中洗滌30分鐘∠裎荩幻燈片被洗在60?C - 65 C?15分鐘一次2 x SSC和兩次0.1 x SSC,其次是TBST洗在RT,幻燈片在37?C 15分鐘洗一次2 x SSC和兩次在1 x SSC,其次是TBST洗在RT,幻燈片孵化在屏蔽解決方案(TBST + 0.5% BSA)至少1小時沿Antidigoxigenin(羅氏(貓# 11093274910),1:1000阻礙解決方案)應(yīng)用于幻燈片在RT至少2個小時怕犁。然后用TBST沖洗5次。將預(yù)過濾的BM Purple (Roche (Cat#: 11442074001))添加到載玻片中己莺，在黑暗潮濕的室中孵育最多2小時奏甫。信號出現(xiàn)后，用TBST洗滌載玻片凌受，在4% PFA中固定5分鐘阵子，然后裱片。使用尼康SMZ25立體顯微鏡拍攝圖像胜蛉。表S2列出了用于生成反義探針的引物挠进。

vegfc mRNA注射

從24 hpf胚胎cDNA中擴增出全長的vegfc cDNA，克隆到PCS2+中腾么。用Not1酶(NEB (Cat# R3189S))線性化后奈梳，使用mMessage mMachine SP6轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen (Cat# AM1340))體外轉(zhuǎn)錄vegfc mRNA。在單細胞期向WT胚胎注射100 pg vegfc mRNA解虱。然后從48個注射和未注射vegf的hpf胚胎中提取RNA進行RT-qPCR攘须。

細胞分類

使用Pierce初級心肌細胞分離試劑盒(Thermo Fisher Scientific (Cat# 88281))，按照制造商的說明進行以下修改殴泰，解剖和消化成年斑馬魚心室:在30?C下進行孵育于宙，輕輕搖晃(300 rpm) 45分鐘，然后在含有0.25% BSA的1X HBSS中重懸浮細胞悍汛。細胞懸液通過40uM尼龍網(wǎng)過濾捞魁，并使用BD FACSAria?III (BD Biosciences)儀器進行分類。采用30mW 405nm激勵离咐，配以450/50 nm帶通濾光片谱俭，剔除DAPI (Sigma (Cat#D954))陽性細胞奉件，選擇活細胞。分類心外膜細胞(Tg(tcf21:mCherry)+)時昆著，采用50mW 561nm激發(fā)县貌，配以610/20nm帶通濾光片檢測mCherry熒光;冠狀動脈內(nèi)皮細胞(Tg(-0.8flt1:RFP)+)、心肌細胞(Tg(myl7:DsRed)+)和非心肌細胞(Tg(myl7:DsRed)-)的RFP和DsRed熒光在50mW 561 nm的激勵下與586/15帶通濾光片配合測量凑懂。分類后的細胞用500μl Trizol重懸煤痕，提取RNA。

RT-qPCR

對于定量RT-PCR (RT-qPCR)接谨，從手術(shù)或冷凍損傷的心臟的整個心室中提取RNA摆碉，每個生物重復(fù)使用一個心室，或從損傷的組織中提取RNA脓豪，每個生物重復(fù)使用4個心室巷帝。使用RNA清潔濃縮器提取試劑盒(Zymo (Cat# R1013))按照制造商的方案進行RNA提取。250ng RNA使用Maxima第一鏈cDNA合成試劑盒(Thermo Fisher Scientific (Cat# K1641))按照制造商的協(xié)議進行cDNA合成扫夜。對于分類的細胞锅睛，使用RNeasy Mini kit (Qiagen)提取RNA, 100 ng RNA用于cDNA合成。使用DyNAmo Flash SYBR Green qPCR主混合試劑(Thermo Fisher Scientific (Cat# F415S))和CFX Connect Real-Time BioRad機器進行RT-qPCR反應(yīng)历谍，程序如下:在95°C下預(yù)擴增7分鐘，然后在95°C下擴增5秒辣垒，在60°C下擴增20秒望侈，使用熔化曲線從60°C到92°C，每5秒增加1.0°C勋桶。引物序列列于表S2脱衙。將rpl13a作為管家基因的mRNA水平歸一化，并使用log 2ΔΔCt方法計算折疊變化84例驹。rpl13a在腦室的RT-qPCR表達的平均Ct值為18.5-20捐韩。所有RT-qPCR在分類細胞上rpl13a表達的平均Ct值為23-25。對于HUVECs實驗鹃锈，mRNA水平針對GAPDH作為管家基因進行標(biāo)準(zhǔn)化荤胁。所有RT-qPCR數(shù)據(jù)的平均Ct值列于表S3。

RNA序列

在24hpci時解剖WT和Tg(hsp701:sflt4)心臟屎债。去除心房和動脈球仅政，僅用心室進行RNA測序。每個生物重復(fù)使用3個心室池盆驹。使用miRNeasy micro kit (QIAGEN)結(jié)合柱上dna酶切(dase - free DNase Set, QIAGEN)分離總RNA圆丹。用LabChip Gx Touch 24 (Perkin Elmer)檢測總RNA和文庫完整性。使用500 ng總RNA作為輸入躯喇，按照制造商的方案(Vazyme)制備VAHTS鏈RNA-seq文庫辫封。測序在NextSeq500儀器(Illumina)上使用v2化學(xué)進行，每個文庫平均有43M個reads，單端設(shè)置為1x75bp倦微。使用FastQC(可在http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/ projects/ FastQC上在線獲得)評估生成的原始讀取的質(zhì)量妻味、適配器內(nèi)容和重復(fù)率。Trimmomatic版本0.38用于在10個核苷酸的窗口中修剪質(zhì)量下降到Q20平均值以下的讀數(shù)璃诀。在隨后的分析中弧可，只使用了30到150個核苷酸之間的讀數(shù)。使用STAR 2.6.1d劣欢，參數(shù)為“outFilterMismatchNoverLmax 0.1”棕诵，將修剪和過濾后的reads與Ensembl斑馬魚基因組版本DanRer11 (GRCz11.92)進行比對，將不匹配與映射長度的最大比例增加到10%凿将。使用Subread包中的featurets 1.6.3工具統(tǒng)計與基因匹配的reads數(shù)校套。只有至少部分位于外顯子內(nèi)的reads被接受并聚集在每個基因上，而重疊多個基因或?qū)R多個區(qū)域的reads被排除在進一步的分析之外牧抵。使用DESeq2 version 1.18.1對差異表達基因進行鑒定笛匙。共檢測了17221個基因。只有倍數(shù)變化最小值為±0.585,benjamin - hochberg校正p值≤0.05犀变，且5個reads的最小組合平均值為顯著差異表達的基因才被認為是顯著差異表達妹孙。Log2倍變化0.585反映了1.5倍的上下調(diào)節(jié)，并構(gòu)成了消除微小變化的穩(wěn)健截斷获枝〈勒基于Ensembl基因標(biāo)識符(Activities at The Universal Protein Resource (UniProt))，使用UniProt數(shù)據(jù)(發(fā)布日期:06.06.2014)豐富了Ensembl注釋省店。構(gòu)建了熱圖嚣崭，顯示了兩種情況下表達差異最大的前50個基因。這些基因的DESeq2(1.18.1)標(biāo)準(zhǔn)化表達計數(shù)在每個條件下平均懦傍，并在R studio(1.4.1717)中使用ComplexHeatmap包繪制雹舀，使用堪拉距離和分層聚類的z分?jǐn)?shù)。Z-score粗俱，一個值高于或低于所有值的平均值的標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)说榆，是通過將規(guī)范化讀數(shù)插入R studio生成的，R studio使用scale()函數(shù)計算Z-score寸认。

細胞培養(yǎng)

人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)從Lonza或Life technologies購買娱俺，使用到第六代。HUVECs在內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基(EBM-2, Lonza)中培養(yǎng)废麻，培養(yǎng)基中添加胎牛血清荠卷、氫化可的松、人堿性成纖維細胞生長因子烛愧、血管內(nèi)皮生長因子油宜、r3 -胰島素樣生長因子掂碱、抗壞血酸、人表皮生長因子慎冤、GA-1000和肝素(EGM-2 BulletKit, Lonza)疼燥，以及100單位/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素。劃痕實驗是通過在24孔板上每孔播種30,000個細胞蚁堤，并在播種后24小時使用移液管尖端進行劃痕實驗醉者。刮傷后6小時收集細胞進行RNA分離。

RNA干擾

在HUVECs中披诗，VEGFC被siRNA雙鏈靶向(Mission esiRNA, Sigma (Cat# EHU013781))撬即。使用Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen (Cat# 13778030))按照制造商的標(biāo)準(zhǔn)方案進行轉(zhuǎn)染(最終siRNA濃度:10 pmol/well)。在所有RNAi實驗中呈队，細胞接種于24孔板中剥槐，并在達到80%匯合時進行轉(zhuǎn)染。用10%巰基乙醇(Gibco)裂解細胞宪摧，在裂解緩沖液(Invitrogen)中裂解細胞粒竖，轉(zhuǎn)染24小時后分離RNA進行RT-qPCR。

統(tǒng)計分析

cEC增殖几于、熒光強度百分比蕊苗、CM去分化和增殖以及疤痕面積相對于心室面積百分比的數(shù)據(jù)分布采用Shapiro-Wilks正態(tài)檢驗(閾值:alpha值= 0.05)進行評估，數(shù)據(jù)采用Student 's t檢驗或Mann - Whitney非參數(shù)檢驗進行比較統(tǒng)計沿彭，見圖圖岁歉。RT-qPCR分析至少使用了4個生物重復(fù)。對于細胞分類膝蜈，每個樣本至少匯集了15個心室。所有RT-qPCR表達數(shù)據(jù)經(jīng)Mann-Whitney非參數(shù)檢驗分析熔掺，P<0.05為顯著性饱搏。未采用實驗范圍內(nèi)的多重檢驗校正。誤差柱表示平均值±SD置逻，柱表示中位數(shù)推沸。所有統(tǒng)計分析均在GraphPad Prism 8中進行。

隨機化和盲法程序

涉及突變型和WT斑馬魚的實驗隨機化如下:突變型和WT斑馬魚被安置在同一個水箱中券坞，用于實驗鬓催，成像，分析恨锚，然后進行基因分型宇驾。然而，在涉及藥物治療的實驗中(即4-OHT vs. EtOH猴伶，或DMSO vs. SB25002)课舍，由于無法區(qū)分對照組和實驗組塌西，或者攜帶熱休克驅(qū)動轉(zhuǎn)基因的斑馬魚在幼魚階段(即早在實驗之前)進行熒光分類，因此沒有進行盲法筝尾。腦室損傷小于20%的斑馬魚被排除在實驗和分析之外捡需。沒有使用功率計算來確定樣本量，樣本量是基于該領(lǐng)域以前的出版物筹淫。

結(jié)果

在斑馬魚胚胎發(fā)生過程中站辉，vegfc在背主動脈中表達，并調(diào)節(jié)發(fā)育性血管生成损姜。在成年斑馬魚中饰剥，心臟損傷后可誘導(dǎo)vegfc表達。為了深入了解心臟再生過程中vegfc表達的時間模式薛匪，我們對冷凍損傷后48小時和96小時(hpci)以及冷凍損傷后7天(dpci)的斑馬魚心室進行了實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)分析捐川。我們觀察到，與假手術(shù)組心室相比逸尖，vegfc在這些時間點上調(diào)古沥，在96 hpci時表達水平最高(圖1A)，這與cEC增殖的峰值相吻合娇跟。為了確定哪些細胞類型在心臟再生過程中表達vegfc岩齿，我們對野生型(WT)心室進行了原位雜交，并在損傷組織周圍(再生冠狀動脈和EPDCs所在的位置)96 hpci處觀察vegfc表達(圖1B)苞俘。為了更好地確定心臟再生過程中vegfc表達的來源盹沈，我們分別使用Tg(-0.8flt1:RFP)和TgBAC(tcf21:mCherry)系對分類的cECs和EPDCs進行了RT-qPCR分析。這些分析顯示吃谣，與假手術(shù)組(96 hps)心臟相比乞封，96 hpci時分類cECs中vegfc表達上調(diào)(圖1C)，但在分類EPDCs(圖S1A和S1B)中沒有岗憋。我們還使用Tg(my17:DsRed)系分析了vegfc在分類的成人心肌細胞中的表達肃晚，發(fā)現(xiàn)心臟損傷前后vegfc的表達非常低(圖S1C)。這些結(jié)果表明仔戈，在斑馬魚心臟再生過程中关串，cECs上調(diào)了vegfc的表達。

圖1 vegfc信號通路促進斑馬魚心臟損傷后冠狀動脈內(nèi)皮細胞(cEC)增殖监徘。A, RT-qPCR分析冷凍損傷后48小時和96小時(hpci)和冷凍損傷后7天(dpci)與假手術(shù)組心臟組織中vegfc mRNA的水平(n=4)晋修。B，未損傷(B')和96 hpci (B'')心臟切片上vegfc的原位雜交表達凰盔。箭頭指向vegfc的表達墓卦。C,RT-qPCR分析96 hpci時，在分類的?0.8flt1:RFP+細胞(cECs户敬；n=4)中和假手術(shù)組心臟（96 hps）的vegfc mRNA水平趴拧。D溅漾，熱休克治療示意圖(箭頭)和心臟冷凍損傷。96 hpci時Tg(- 0.8flt1:RFP) (Ctrl著榴；D')和Tg(- 0.8flt1:RFP)添履；Tg(hsp701:sflt4) (D'')冷凍損傷的斑馬魚心臟切片的免疫染色;RFP(冠狀動脈，洋紅色)脑又、PCNA(增殖標(biāo)志物暮胧，綠色)和DNA (DAPI，藍色)染色切片问麸。箭頭指向PCNA+ cECs往衷。E,96 hpci時Tg(-0.8flt1:RFP) (n=3)和Tg(-0.8flt1:RFP)；Tg(hsp701:sflt4) (n=3)心室邊界區(qū)PCNA+ cECs的百分比严卖。F席舍，熱休克治療(箭頭)和心臟冷凍損傷示意圖。Tg(flt1:Mmu.Fos-GFP) (Ctrl哮笆；F')和Tg(flt1:Mmu.Fos-GFP);Tg(hsp701:sflt4) (F'')在7 dpci時冷凍損傷心臟的整體圖像来颤。G, 7 dpci時Tg(flt1:Mmu.Fos-GFP) (Ctrl；n=4)和Tg(flt1:Mmu.Fos-GFP)稠肘；Tg(hsp701:sflt4) (n=6)心室損傷組織中GFP熒光強度的百分比福铅。黑色(B)、白色(D)和橙色(F)虛線描繪了受損組織项阴。統(tǒng)計檢驗:非參數(shù)Mann-Whitney檢驗(A滑黔、C)， Student’s t檢驗(E环揽、G)略荡。比例尺:100μm (B、D歉胶、F)汛兜。RT-qPCR數(shù)據(jù)的Ct值列于表S3。D表示dpci;h, hpci跨扮。

Vegfc信號通路促進斑馬魚心臟冷凍損傷后cEC增殖

心肌損傷后cECs中vegfc的上調(diào)表明在再生過程中起作用。為了驗證這一假設(shè)验毡，我們使用了Tg(hsp701:sflt4)系衡创。熱休克后，可溶性受體sFlt4(可溶性Fms相關(guān)受體酪氨酸激酶4)的表達被誘導(dǎo)晶通，它作為一個誘餌來阻斷Vegfc信號傳導(dǎo)璃氢。與Tg(hsp701:sflt4)系一起，我們使用Tg(- 0.8flt1:RFP)和Tg(flt1:Mmu.Fos-GFP)系來觀察冠狀動脈狮辽，它們專門標(biāo)記斑馬魚心室中的cECs(圖S1D)一也。熱休克方案優(yōu)化后(圖S1E)巢寡，我們對Tg(hsp70:sflt4)、Tg(- 0.8flt1:RFP)和Tg(- 0.8flt1:RFP)(對照組)進行每日熱休克椰苟，并分析它們的心室(圖1D)抑月。我們量化了96 hpci時cEC的增殖，發(fā)現(xiàn)阻斷Vegfc信號導(dǎo)致cEC增殖顯著減少(圖1D和1E)舆蝴，這也導(dǎo)致7 dpci時受損組織的冠狀血管覆蓋率降低(圖1F和1G)谦絮，在對照組斑馬魚中，損傷組織通過再生冠狀動脈廣泛再生洁仗。此外层皱，我們觀察到cxcr4a和apln的表達水平下降(圖S1F)，這兩個基因已被證明可以調(diào)節(jié)斑馬魚的冠狀動脈再生赠潦。

在心臟再生過程中叫胖，心肌細胞去分化和增殖以補充受損組織，這一過程部分受到cECs的調(diào)控她奥。因此瓮增，我們推斷通過阻斷Vegfc信號通路改變血運重建可能導(dǎo)致心肌細胞再生缺陷。為了驗證這種可能性方淤，我們對冷凍損傷的Tg(hsp701:sflt4)和非轉(zhuǎn)基因的斑馬魚進行了熱休克治療钉赁，直到96 hpci，此時血管重建非承活躍你踩，并分析了7 dpci時心肌細胞的去分化和增殖。我們發(fā)現(xiàn)讳苦，阻斷Vegfc信號可導(dǎo)致心肌細胞去分化和損傷邊界區(qū)增殖的減少(圖2A至2D和圖S1G)带膜。為了更深入地了解這些心肌細胞表型，我們分析了vegfr1鸳谜、vegfr2和vegfr3在分類的心肌細胞中的表達膝藕，并觀察到損傷前后的mRNA水平非常低或沒有檢測到(圖S1H和S1I)，這表明由于心肌細胞中Vegfc信號的減少咐扭，它們不太可能發(fā)生芭挽。接下來，為了測試通過阻斷Vegfc信號傳導(dǎo)減少冠狀動脈血供重建是否會影響疤痕的消退蝗肪，我們誘導(dǎo)sflt4的表達直到96 hpci袜爪，即cEC增殖的高峰期12，并分析30和90 dpci時的疤痕面積薛闪。我們發(fā)現(xiàn)辛馆，在30(圖S1J和S1K)和90(圖2E和2F) dpci時，與接受相同處理的非轉(zhuǎn)基因斑馬魚相比豁延，Vegfc信號被阻斷的心室顯示出明顯更大的疤痕面積昙篙，這與最近使用Vegfc+/um18斑馬魚以及Tg(hsp701:sflt4)斑馬魚的研究結(jié)果一致腊状。

圖2 阻斷Vegfc信號導(dǎo)致斑馬魚心臟損傷后心肌細胞(CM)去分化和增殖減少。A苔可，熱休克治療(箭頭)和心臟冷凍損傷示意圖缴挖。非轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Ctrl；A')和Tg(hsp701:sflt4) (A'')斑馬魚冷凍損傷后7天(dpci)心臟切片的免疫染色;MEF2 (CMs和品紅色)硕蛹、PCNA(增殖標(biāo)記物醇疼，綠色)和DNA (DAPI藍色)染色切片。箭頭指向PCNA+ CMs法焰。B秧荆，7 dpci時非轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Ctrl；n=6)和Tg(hsp701:sflt4)(n=6)心室邊界區(qū)PCNA+ CMs的百分比埃仪。C乙濒，熱休克治療示意圖(箭頭)和心臟冷凍損傷。7 dpci時非轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Ctrl卵蛉；C')和Tg(hsp701:sflt4) (C'')冷凍損傷斑馬魚心臟切片的免疫染色;MEF2 (cm颁股，洋紅色)、N2.261(胚胎肌球蛋白重鏈傻丝，綠色)和DNA (DAPI甘有，藍色)染色。箭頭指向N2.261+ CMs葡缰。D, 非轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Ctrl亏掀；n=7)和Tg(hsp701:sflt4) (n=7)心室邊界區(qū)N2.261+ CMs的百分比。E泛释，熱休克治療示意圖(箭頭)和心臟冷凍損傷滤愕。AFOG染色非轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Ctrl；E')和Tg(hsp701:sflt4) (E'')心室在90 dpci時的切片怜校。橙色间影、肌肉;紅、纖維蛋白;藍色是膠原蛋白茄茁。F魂贬，非轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Ctrl；n=4)和Tg(hsp701:sflt4) (n=5)在90 dpci時心室的疤痕面積相對于心室面積的百分比裙顽。白色(A和C)和黑色(E)虛線描繪了受損組織付燥。統(tǒng)計檢驗:Student’s t檢驗(B、D锦庸、F)机蔗。比例尺:100μm (A蒲祈、C甘萧、E)萝嘁。

Vegfc調(diào)節(jié)斑馬魚發(fā)育和心臟再生過程中的淋巴管生成。為了排除在全局Vegfc信號干擾下觀察到的再生表型是由于淋巴缺陷引起的扬卷，我們對3個月大(≈27-28mm長)的斑馬魚進行了損傷牙言，根據(jù)報告基因表達，在斑馬魚中怪得，淋巴僅在動脈球中觀察到咱枉，而在腦室中尚未出現(xiàn)。為了進一步測試在這些階段和再生過程中淋巴管的存在徒恋，我們在心肌內(nèi)注射了Qdots蚕断，這些Qdots被淋巴管吸收和清除，使其可見入挣。這些實驗是在攜帶標(biāo)記淋巴管的Tg(lyve1b:DsRed)轉(zhuǎn)基因的動物身上進行的。通過這種方法，我們證實了3個月大的斑馬魚腦室橱鹏、WT動物的再生實驗以及Vegfc信號阻斷后淋巴的缺失(圖S2A和S2B)情竹。與我們之前對年齡較大(即8個月大)的動物進行的實驗類似(圖1D和1E)，我們觀察到與對照組相比滋恬，3個月大的Tg(hsp701:sflt4)斑馬魚在96 hpci下cEC增殖顯著降低(圖S2C和S2D)聊训。這些數(shù)據(jù)表明，阻斷Vegfc信號后血運重建的減少與心室淋巴的存在與否無關(guān)恢氯。然而带斑，為了研究沒有腦室淋巴管的斑馬魚，我們在接下來的研究中使用了長度為27-28 mm的動物酿雪。

由于Flt4 (Vegfr3)是Vegfc和Vegfd的主要受體遏暴，因此Tg(hsp701:sflt4)斑馬魚的心臟再生缺陷可能至少部分是由于Vegfd信號的改變。為了驗證這一可能性指黎，我們對WT朋凉、發(fā)育不全的vegfc-/-和vegfd-/-斑馬魚進行了冷凍損傷，并分析了96個hpci損傷心室中的cEC增殖情況醋安。值得注意的是杂彭，vegfc-/-腦室中cEC增殖減少，但vegfd-/-腦室中沒有cEC增殖減少(圖S2E和S2F)吓揪，這與先前的研究結(jié)果一致亲怠，vegfd-/-斑馬魚不表現(xiàn)出心臟再生缺陷。這些數(shù)據(jù)表明柠辞，sflt4過表達后cEC再生中觀察到的缺陷是由于阻斷了Vegf信號通路团秽，盡管不能完全排除對其他Vegf信號通路的影響。總的來說，這些發(fā)現(xiàn)表明习勤，在斑馬魚心臟再生過程中踪栋，阻斷Vegfc信號通路會損害冠狀動脈血管重建以及心肌細胞去分化和增殖。

Vegfc信號誘導(dǎo)ECM基因emilin2a表達促進冠狀動脈血運重建

為了深入了解Vegfc信號如何調(diào)控冠狀動脈再生的機制图毕，我們使用Tg(hsp701:sflt4)系和非轉(zhuǎn)基因斑馬魚系作為對照夷都，阻斷Vegfc信號后，對冷凍損傷的心室進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析予颤。我們在24hpci時提取了受傷的心室囤官，并比較了它們的轉(zhuǎn)錄組(圖3A)，將斑馬魚WT心臟再生過程中顯著下調(diào)的基因與上調(diào)的基因進行了交叉比對蛤虐，這些數(shù)據(jù)來自已發(fā)表的數(shù)據(jù)集15(圖S3A)党饮。我們確定了10個候選基因(圖S3A)。接下來驳庭，我們進行RT-qPCR分析劫谅，以評估它們在24 hpci(進行RNAseq的時間點)和96 hpci(觀察到cEC表型減少的時間點)時WT和Tg(hsp701:sflt4)心室中的表達水平;圖S3B和S3C)。在這些候選基因中嚷掠，emilin2a是唯一一個在阻斷Vegfc信號傳導(dǎo)時表現(xiàn)出一致且顯著下調(diào)的基因(圖3B和圖S3B和S3C)捏检。為了驗證emilin2a是否是Vegfc信號的靶點，我們將Vegfc mRNA注射到單細胞期WT胚胎中不皆，發(fā)現(xiàn)在48 hpf時emilin2a的表達顯著增加(圖S3D)贯城。由于Vegfc信號調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的發(fā)芽，我們推斷emilin2a表達的變化可能是血運重建減少的結(jié)果霹娄。為了驗證這種可能性能犯，我們分析了Tg(hsp701: nd-Vegfaa)斑馬魚腦室中emilin2a的表達，Tg(hsp701: nd-Vegfaa)是一種熱休克誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因系犬耻，表達一種主要的陰性形式的Vegfaa踩晶，可以阻斷血管再生。我們對WT枕磁、Tg(hsp701:sflt4)和Tg(hsp701:dn-vegfaa)斑馬魚每天進行1小時熱休克渡蜻，連續(xù)3天，并通過RT-qPCR分析未損傷腦室上emilin2a的表達计济。雖然emilin2a在Tg(hsp701:sflt4)心室中的表達顯著下調(diào)茸苇，但在Tg(hsp701:dn-vegfaa)心室中的表達保持不變(圖S3E)，進一步表明emilin2a是Vegfc信號的靶標(biāo)沦寂，而不僅僅是內(nèi)皮標(biāo)志物学密。為了探索VEGFC-EMILIN2軸在人內(nèi)皮細胞中也起作用的可能性，我們在培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)中敲除VEGFC传藏，觀察到EMILIN2表達顯著降低(圖3C)腻暮⊥兀總之，這些結(jié)果表明EMILIN2是斑馬魚和人類內(nèi)皮細胞中VEGFC信號的效應(yīng)者哭靖。

圖3 Vegfc信號刺激emilin2a表達遗增，促進斑馬魚心臟再生中的冠狀動脈內(nèi)皮細胞(cEC)增殖。A款青，熱圖顯示非轉(zhuǎn)基因野生型(WT)與Tg(hsp701:sflt4)心臟在冷凍損傷(hpci)后24小時的差異表達基因』粽基因大致分為兩類:一類包含Tg(hsp70l:sflt4)心室中上調(diào)的基因抡草，另一類包含Tg(hsp70l:sflt4)心室中下調(diào)的基因。B,RT-qPCR分析Tg(hsp70l:sflt4)心室在24和96 hpci的emilin2a mRNA水平與非轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Ctrl)心臟的對比(n=4)蔗坯。C, RT-qPCR分析siVEGFC處理(n=4)后人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)中VEGFC和EMILIN2 mRNA水平與對照組(n=4)的比較康震。D, RT-qPCR分析48和96 hpci以及冷凍損傷后7天(dpci)損傷組織中emilin2a mRNA水平(n=4)。E, emilin2a在未損傷(E')和96 hpci (E'')心臟切片上的原位雜交表達宾濒。箭頭指向emilin2a表達腿短。F, RT-qPCR分析分類tcf21:mCherry+細胞(外膜來源細胞[EPDCs]；n=4)和分類?0.8flt1:RFP+細胞(cECs绘梦；n=4)在96 hpci和96 hps時的emilin2a mRNA水平橘忱。G、RT-qPCR分析分類-0.8flt1:RFP+細胞(cECs卸奉；n=5)和分類tcf21:mCherry+細胞(EPDCs,n=5)在96 hpci和96 hps時的emilin2a mRNA水平钝诚。H, 96 hpci條件下Tg(-0.8flt1:RFP)；emilin2a+/+(H')和Tg(- 0.8flt1:RFP)榄棵；emilin2a-/-(H'')斑馬魚冷凍損傷心臟切片的免疫染色;RFP(冠狀動脈凝颇，洋紅色)、PCNA(增殖標(biāo)志物疹鳄，綠色)和DNA (DAPI拧略，藍色)染色切片。箭頭指向PCNA+ cECs瘪弓。I垫蛆、96 hpci時，Tg(-0.8flt1:RFP);emilin2a+/+(n=5)和Tg(-0.8flt1:RFP);emilin2a-/-(n=5)心室邊界區(qū)PCNA+ cECs的百分比腺怯。J, 7 dpci時emilin2a+/+ (J')和emilin2a-/-(J'')斑馬魚冷凍損傷心臟切片的免疫染色;MEF2(心肌細胞[CMs]月褥，洋紅色)、PCNA(增殖標(biāo)志物瓢喉，綠色)和DNA (DAPI宁赤，藍色)染色切片。箭頭指向PCNA+ CMs栓票。K, 7 dpci時emilin2a+/+(n=4)和emilin2a-/-(n=4)心室邊界區(qū)PCNA+ CMs的百分比决左。L, 90 dpci時emilin2a+/+ (L')和emilin2a-/-(L'')心室切片的AFOG染色愕够。橙色、肌肉;紅佛猛、纖維蛋白;藍色是膠原蛋白惑芭。M, 90 dpci時emilin2a+/+(n=4)和emilin2a-/-(n=4)心室疤痕面積相對于心室面積的百分比。黑色(E和L)和白色(H和J)虛線描繪了受損組織继找。統(tǒng)計檢驗:非參數(shù)Mann-Whitney檢驗(B遂跟、C、D婴渡、F幻锁、G)， Student’s t檢驗(I边臼、K哄尔、M)。比例尺:100μM (E柠并、H岭接、J、L)臼予。RT-qPCR數(shù)據(jù)的Ct值列于表S3鸣戴。D表示dpci;h, hpci。

EMILIN2(彈性蛋白微纖維界面2)是一種糖蛋白粘拾，屬于EMI結(jié)構(gòu)域賦予的蛋白質(zhì)超家族葵擎，由EMILIN1、EMILIN2半哟、MMRN1和MMRN2組成酬滤。先前的研究表明，emilin2a在24 hpf時斑馬魚胚胎的背主動脈中表達寓涨。然而盯串，它在心臟再生中的作用尚不清楚。

接下來戒良，我們分析了冷凍損傷后不同時間點emilin2a的表達模式体捏，發(fā)現(xiàn)在96 hpci時，emilin2a在損傷組織中表達強烈上調(diào)(圖3D)糯崎，這與vegfc表達(圖1A)和cEC增殖的峰值相吻合几缭。通過對心室切片的原位雜交，我們在96 hpci時觀察到emilin2a在損傷組織周圍的表達沃呢，與vegfc表達相似年栓，而在未損傷的心室中未檢測到表達(圖3E)。我們進一步通過RT-qPCR分析了emilin2a在分類cECs(?0.8flt1:RFP+)和分類EPDCs (tcf21:mCherry+)上的表達薄霜，發(fā)現(xiàn)emilin2a在損傷后兩種細胞類型中均有表達(圖3F)某抓，而在心臟損傷前后心肌細胞中表達極低(圖S3F)纸兔。我們還比較了兩種細胞類型(EPDCs和cECs)之間emilin2a的表達，發(fā)現(xiàn)EPDCs在96 hpci時的表達水平高于cECs(圖3G)否副。

先前的研究表明汉矿，在劃痕實驗中，用重組EMILIN2刺激HUVECs可增強其遷移备禀。我們還觀察到洲拇，在劃傷后6小時，當(dāng)細胞積極遷移時曲尸，EMILIN2顯著上調(diào)(圖S3G)赋续。此外，EMILIN2的缺失顯著減少了培養(yǎng)小鼠主動脈環(huán)的微血管發(fā)芽队腐，表明其具有血管生成作用。這些數(shù)據(jù)使我們假設(shè)Emilin2a調(diào)節(jié)斑馬魚心臟再生過程中血運重建的不同方面奏篙。為了驗證這一假設(shè)柴淘，我們使用CRISPR/Cas9技術(shù)生成了一個emilin2a突變等位基因。斑馬魚的基因組包含兩個emilin2基因秘通，emilin2a和emilin2b为严。由于在斑馬魚基因組中存在emilin2b，我們生成了一個完整的基因座缺失等位基因肺稀，以避免可能的轉(zhuǎn)錄適應(yīng)(圖S4A至S4E)第股。Emilin2a全位點缺失突變體缺乏Emilin2a表達(圖S4F)，幼魚期無明顯缺陷(圖S4G)话原。此外夕吻，emilin2a-/-心室的大體形態(tài)和冠狀動脈覆蓋范圍與未損傷時emilin2a+/+心室的大體形態(tài)和冠狀動脈覆蓋范圍相當(dāng)(圖S4H)。冷凍損傷后繁仁，emilin2a-/-腦室在96 hpci時cEC增殖明顯減少(圖3H和3I)涉馅，在7 dpci時冠狀動脈覆蓋受損(圖S5A和S5B)，同時缺乏淋巴管(圖S5C)黄虱。此外稚矿，emilin2a-/-心室在7 dpci時心肌細胞增殖明顯減少(圖3J和3K)，在30(圖S5D和S5E)和90(圖3L和3M) dpci時顯示更大的疤痕捻浦∥畲В總之，這些結(jié)果表明朱灿，emilin2a是斑馬魚心臟再生過程中cEC增殖和疤痕消退所必需的昧识。

先前發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，與斑馬魚不同盗扒，medaka (Oryzias latipes)是一種不能再生心臟且缺乏冠狀動脈網(wǎng)絡(luò)的硬骨魚滞诺，在低溫損傷后emilin2a沒有上調(diào)(圖S5F)形导。此外，我們的數(shù)據(jù)顯示emilin2a突變心室在90 dpci時保留了更大的纖維化疤痕习霹，以及之前提到的HUVEC數(shù)據(jù)46(圖S3G)朵耕，這使我們假設(shè)emilin2a可以增強心臟再生。為了驗證這一假設(shè)淋叶，我們在熱休克啟動子下產(chǎn)生了表達emilin2a的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系阎曹。我們在Tg(hsp701:emilin2a)中量化了96 hpci時cEC的增殖，Tg(- 0.8flt1:RFP)心室與對照組(即Tg(- 0.8flt1:RFP)進行相同處理的斑馬魚煞檩，圖4)处嫌。我們發(fā)現(xiàn)，盡管沒有心室淋巴管(圖S6C)斟湃，但過表達emilin2a顯著增加了96 hpci時cEC的增殖(圖4A和4B)熏迹，并在7 dpci時略微增加了冠狀血管覆蓋(圖S6A和S6B)。此外凝赛，與非轉(zhuǎn)基因的斑馬魚相比注暗，過表達emilin2a導(dǎo)致心肌細胞增殖在7 dpci時增加(圖4C和4D)，在30 dpci時疤痕面積減少(圖4E和4F)墓猎。

圖4 emilin2a過表達可增加斑馬魚心臟再生過程中冠狀動脈內(nèi)皮細胞(cEC)的增殖捆昏，并可挽救Vegfc信號阻滯。A毙沾，熱休克治療(箭頭)和心臟冷凍損傷示意圖骗卜。冷凍損傷后96小時斑馬魚(hpci) Tg(-0.8flt1:RFP) (Ctrl；A')和Tg(hsp701:emilin2a)左胞；Tg(-0.8flt1:RFP) (A'')心臟切片的免疫染色;RFP(冠狀動脈寇仓，洋紅色)、PCNA(增殖標(biāo)志物烤宙，綠色)和DNA (DAPI焚刺，藍色)染色切片。箭頭指向PCNA+ cECs门烂。B,96 hpci時Tg(- 0.8flt1RFP) (Ctrl乳愉；n=4)和Tg(hsp701:emilin2a)；Tg(- 0.8flt1:RFP)(n=4)心室邊界區(qū)PCNA+ cECs的百分比屯远。C蔓姚，熱休克治療示意圖(箭頭)和心臟冷凍損傷。非轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Ctrl,C')和Tg(hsp701:emilin2a) (C'')斑馬魚冷凍損傷后7天(dpci)心臟切片的免疫染色;MEF2(心肌細胞[CMs]慨丐，洋紅色)坡脐、PCNA(增殖標(biāo)志物，綠色)和DNA (DAPI房揭，藍色)染色切片备闲。箭頭指向PCNA+ CMs晌端。D，7 dpci時非轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Ctrl恬砂；n=6)和Tg(hsp701:emilin2a) (n=6)心室邊界區(qū)的PCNA+ CMs百分比咧纠。E，熱休克治療示意圖(箭頭)和心臟冷凍損傷泻骤。AFOG染色非轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Ctrl漆羔；E')和Tg(hsp701:emilin2a) (E'')心室在30 dpci時的切片。橙色狱掂、肌肉;紅演痒、纖維蛋白;藍色是膠原蛋白。F趋惨，30dpci時非轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Ctrl鸟顺；n=5)和Tg(hsp701:emilin2a) (n=6)心室疤痕面積相對于心室面積的百分比。G器虾，注射乙醇(EtOH)或4-羥基他莫昔芬(4-OHT)后進行心臟冷凍損傷和熱休克治療的示意圖(箭頭)讯嫂。用EtOH (G')或4-OHT (G'')在96 hpci注射Tg(hsp701:sflt4)；TgBAC(tcf21:CreERT2)曾撤；Tg(hsp701:LCL-emilin2a-p2A-mCherry)冷凍損傷的斑馬魚心臟切片的免疫染色;Fli1a(內(nèi)皮細胞端姚，洋紅色)晕粪、PCNA(增殖標(biāo)記物挤悉，綠色)和DNA (DAPI，藍色)切片染色巫湘。箭頭指向PCNA+ cECs装悲。H,96 hpci注射EtOH (n=6)或4-OHT (n=4)時Tg(hsp701:sflt4)；TgBAC(tcf21:CreERT2)尚氛；Tg(hsp701:LCL-emilin2a-mCherry)交界區(qū)PCNA+ cECs的百分率诀诊。I, EtOH或4-OHT注射后心臟冷凍損傷和熱休克治療示意圖(箭頭)。用EtOH (I')或4-OHT (I'')在30 dpci注射Tg(hsp701:sflt4)阅嘶；TgBAC(tcf21:CreERT2)属瓣；Tg(hsp701:LCL-emilin2a-p2A-mCherry)冷凍損傷的斑馬魚心臟切片進行AFOG染色。J讯柔，注射EtOH (n=4)或4- oht(n=4)抡蛙， 30dpci時Tg(hsp701:sflt4)；TgBAC(tcf21:CreERT2)魂迄；Tg(hsp701:LCL-emilin2a-mCherry)的疤痕面積相對于心室面積的百分比粗截。白色(A、C捣炬、G)和黑色(E熊昌、I)虛線表示損傷組織绽榛。統(tǒng)計檢驗:Student’s t檢驗(B、D婿屹、F灭美、H、J)选泻。比例尺:100μm (A冲粤、C、G)页眯， 200μm (E梯捕、I)。

鑒于這些結(jié)果窝撵，我們推斷Tg(hsp701:sflt4)斑馬魚心臟的冠狀動脈血運重建表型可能是通過過表達emilin2a來拯救的傀顾。我們使用HOT-CRE系統(tǒng)，生成了Tg(hsp701:LCL-emilin2a-p2A-mCherry)斑馬魚系碌奉，該系與TgBAC(tcf21:CreERT2)系結(jié)合短曾，可以在空間和時間上控制EPDCs中emilin2a的表達(圖S6D through S6G)。接下來赐劣，我們在EPDCs中過表達emilin2a嫉拐，同時阻斷Vegfc信號傳導(dǎo)，并觀察到與未誘導(dǎo)emilin2a表達的心臟相比魁兼，cEC增殖顯著增加(圖4G和4H)婉徘。值得注意的是，我們還觀察到心肌細胞增殖增加(圖S6H和S6I)咐汞， 30 dpci時疤痕面積顯著減少(圖4I和4J)盖呼。總之化撕，這些發(fā)現(xiàn)表明emilin2a在EPDCs和cECs中的表達被Vegfc信號所刺激几晤，它在心臟再生中是必需的，并且可以促進心臟再生植阴。

emilin2a誘導(dǎo)EPDCs中cxcl8a的表達

先前的研究表明蟹瘾，在HUVECs和人胃腫瘤中，EMILIN2通過CXCL8(趨化因子(C-X-C)基序配體8)發(fā)揮其血管生成作用掠手，CXCL8是一種趨化因子憾朴，通過G蛋白偶聯(lián)受體CXCR1(趨化因子(C-X-C)基序受體1)和CXCR2(趨化因子(C-X-C)基序受體2)發(fā)出信號，調(diào)節(jié)傷口愈合的各個方面惨撇。值得注意的是伊脓，其他研究強調(diào)了CXCL8在體外環(huán)境中作為促血管生成因子的能力。因此，Emilin2a可能在斑馬魚心臟再生過程中誘導(dǎo)cxcl8a的表達报腔。為了驗證這種可能性株搔，我們首先分析了96 hpci時emilin2a-/-心室中cxcl8a的表達水平，并觀察到與emilin2a+/+心室相比纯蛾，cxcl8a的表達水平顯著降低(圖5A)纤房。此外，與非轉(zhuǎn)基因的斑馬魚相比翻诉，我們觀察到96 hpci時Tg(hsp701:emilin2a)心室中的cxcl8a上調(diào)(圖S7A)炮姨。為了進一步驗證cxcl8a是否在Vegfc信號的下游，我們在阻斷Vegfc信號后分析了cxcl8a的表達碰煌，發(fā)現(xiàn)在96 hpci時Tg(hsp701:sflt4)心室中顯著下調(diào)(圖S7B)舒岸。相反，將vegfc mRNA注射到單細胞期斑馬魚胚胎中導(dǎo)致cxcl8a表達增加(圖S7C)芦圾。在再生心臟中蛾派，我們在覆蓋損傷組織的細胞中觀察到cxcl8a的表達(圖5B)。為了確定這種表達的來源个少，我們對分類EPDCs和分類cECs進行了RT-qPCR分析洪乍，發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)對照組相比，96 hpci時再生EPDCs中cxcl8a表達增加(圖5C)夜焦，但cECs中沒有(圖S7D和S7E)壳澳。總的來說茫经，這些發(fā)現(xiàn)表明Vegfc信號的下游巷波，ECM蛋白Emilin2a誘導(dǎo)cxcl8a表達，并且在斑馬魚心臟再生過程中科平，EPDCs是cxcl8a的來源褥紫。

圖5 Emilin2a誘導(dǎo)心外膜衍生細胞(EPDCs)表達cxcl8a姜性，促進斑馬魚心臟損傷后冠狀動脈內(nèi)皮細胞(cEC)增殖瞪慧。A，冷凍損傷后96小時部念，emilin2a-/-腦室中emilin2a和cxcl8a mRNA水平的RT-qPCR分析(hpci;n = 4-5)弃酌。B，原位雜交法檢測未損傷(B')和96 hpci(B'')心臟切片上cxcl8a的表達儡炼。箭頭指向cxcl8a表達式妓湘。C、RT-qPCR分析96 hpci和96 hps時乌询，分類tcf21:mCherry+ (EPDCs榜贴；n=5)中cxcl8a mRNA水平。D, 96 hpci時Tg(- 0.8flt1:RFP)妹田；cxcl8a+/+(D')和Tg(- 0.8flt1:RFP)唬党；cxcl8a-/-(D'')斑馬魚冷凍損傷心臟切片的免疫染色;RFP(冠狀動脈鹃共，洋紅色)、PCNA(增殖標(biāo)志物驶拱，綠色)和DNA (DAPI霜浴，藍色)染色切片。箭頭指向PCNA+ cECs蓝纲。E, 96 hpci時cxcl8a+/+(n=7)和cxcl8a-/-(n=6)心室邊界區(qū)PCNA+ cECs百分比阴孟。F,冷凍損傷后7天(dpci)Tg(flt1:Mmu.Fos-GFP)；cxcl8a+/+(F')和Tg(flt1:Mmu.Fos-GFP)税迷；cxcl8a-/-(F'')斑馬魚的心室整體圖像永丝。G,GFP熒光強度在7 dpci時Tg(flt1:Mmu.Fos-GFP)，cxcl8a+/+(n=5)和Tg(flt1:Mmu.Fos-GFP)箭养，cxcl8a-/-(n=6)心室損傷組織中的百分比类溢。H, 90 dpci時cxcl8a+/+ (H')和cxcl8a-/-(H'')心室切片的AFOG染色。橙色露懒、肌肉;紅闯冷、纖維蛋白;藍色是膠原蛋白。I, 90 dpci時cxcl8a+/+ (n=4)和cxcl8a-/-(n=4)心室疤痕面積相對于心室面積的百分比懈词。黑色(B和H)蛇耀、白色(D)和橙色(F)虛線描繪了受損組織。統(tǒng)計檢驗:非參數(shù)Mann-Whitney檢驗(A坎弯、C纺涤、G)， Student’s t檢驗(E抠忘、I)撩炊。比例尺:200μm (B、F崎脉、H)拧咳， 100μm (D)。RT-qPCR數(shù)據(jù)的Ct值列于表S3囚灼。

Cxcl8a-Cxcr1信號通路促進冠狀動脈血運重建

鑒于損傷誘導(dǎo)的cxcl8a表達上調(diào)骆膝，我們想測試cxcl8a是否在心臟再生過程中發(fā)揮重要作用，因此使用CRISPR/Cas9技術(shù)生成了cxcl8a突變體(圖S8A和S8B)灶体。計算機分析預(yù)測阅签，由突變體轉(zhuǎn)錄物編碼的蛋白質(zhì)缺乏C-末端31個氨基酸，這是Cxcl8a二聚化和受體結(jié)合所必需的蝎抽。我們分析了96 hpci時Tg(- 0.8flt1:RFP)政钟；cxcl8a+/+和Tg(- 0.8flt1:RFP)；cxcl8a-/-斑馬魚的cEC增殖，發(fā)現(xiàn)突變體顯著減少(圖5D和5E)养交。此外衷戈，在7 dpci時，cxcl8a-/-心室顯示冠狀動脈覆蓋范圍明顯減少(圖5F和5G)层坠，同時缺乏淋巴管(圖S8C)殖妇。此外，在dpci 30(圖S8D和S8E)和90(圖5H和5I)時破花，cxcl8a-/-心室顯示稍大的疤痕谦趣。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明座每，在斑馬魚心臟再生過程中前鹅，Cxcl8a在冠狀動脈血管重建中起著重要作用。

鑒于cxcl8a突變體cEC增殖表型降低峭梳，我們推斷其受體可能在心臟再生過程中在cECs中表達舰绘。事實上，我們通過原位雜交檢測了96 hpci時損傷組織周圍的cxcr1表達(圖6A)葱椭。我們還觀察到96 hpci時捂寿，cxcr1在分類cECs中的表達顯著上調(diào)，而未檢測到cxcr2的表達(圖6B)孵运。重要的是秦陋，Cxcr1的藥理學(xué)抑制(SB225002)降低了7 dpci時冠狀血管的覆蓋率(圖S8F和S8G)。此外治笨，為了研究cxcr1在心臟再生中的作用驳概，我們對cxcr1-/-心室進行了冷凍損傷，觀察到96 hpci時cEC增殖顯著減少(圖6C和6D)旷赖，以及7 dpci時冠狀動脈覆蓋缺陷(圖6E和6F)顺又。接下來，我們檢查cxcr1-/-心室是否能夠再生等孵。盡管它們在30 dpci時顯示出與cxcr1+/+對照組相似的疤痕大小(圖S8H和S8I)稚照，但cxcr1-/-心室在90 dpci時顯示出明顯更大的疤痕(圖6G和6H)。綜上所述流济，這些發(fā)現(xiàn)表明锐锣，Cxcl8a通過Cxcr1信號在斑馬魚再生的cECs中促進血管重建并支持心臟再生腌闯。

討論

心臟損傷后胰锌，斑馬魚的心臟會產(chǎn)生快速的血管生成反應(yīng)，這對再生過程至關(guān)重要藐窄。在這里资昧，我們發(fā)現(xiàn)再生的冠狀動脈內(nèi)皮上調(diào)了心臟損傷后冠狀動脈血運重建所需的vegfc，而與心室淋巴的存在與否無關(guān)荆忍。我們進一步表明格带，通過阻斷Vegfc信號傳導(dǎo)減少冠狀動脈血運重建會損害心臟再生的關(guān)鍵方面撤缴，包括心肌細胞去分化和增殖，以及疤痕消退叽唱。從機制上看屈呕，在斑馬魚的心臟再生過程中，血管內(nèi)皮生長因子(Vegfc)信號通路誘導(dǎo)emilin2a和cxcl8a的表達棺亭，主要在EPDCs中虎眨，從而促進冠狀動脈血運重建。

導(dǎo)致成年哺乳動物心臟不能再生的因素之一是心臟再血管重建能力差镶摘。相比之下专甩，具有心臟再生能力的模型，如斑馬魚钉稍，對心臟損傷表現(xiàn)出強大而快速的血管生成反應(yīng)涤躲，支持心臟再生。支持這一觀點的是贡未，在斑馬魚心臟再生過程中擾亂冠脈血運重建會損害心肌細胞增殖并阻止疤痕的消除种樱。且在成年小鼠心肌梗死后誘導(dǎo)側(cè)支動脈形成可顯著改善心功能。同樣俊卤，在心臟損傷后穩(wěn)定非再生medaka心臟的血管樣結(jié)構(gòu)可以減少疤痕嫩挤。因此，改善非再生心臟的血運重建應(yīng)刺激其再生反應(yīng)消恍，并且更好地了解再生斑馬魚心臟血運重建的機制可能有助于確定新的治療途徑岂昭。

我們的數(shù)據(jù)顯示，阻斷Vegfc信號導(dǎo)致冠狀動脈血運重建減少狠怨，心肌細胞增殖減少约啊，并保留更大的疤痕。在心臟再生和發(fā)育過程中佣赖，冠狀動脈為心肌細胞提供支架恰矩。因此，我們假設(shè)在阻斷Vegfc信號傳導(dǎo)時觀察到的心肌細胞去分化和增殖表型的減少是血運重建減少的結(jié)果憎蛤，然而外傅，需要組織特異性功能喪失和功能獲得的方法來驗證這一假設(shè)。我們的數(shù)據(jù)表明俩檬，Vegfc是cECs分泌的促進心臟再生的重要血管分泌因子萎胰。近年來的研究強調(diào)不同器官的內(nèi)皮細胞通過分泌血管分泌因子在調(diào)節(jié)組織穩(wěn)態(tài)和修復(fù)中發(fā)揮重要作用。例如棚辽，肝竇內(nèi)皮細胞分別通過CXCR7和CXCR4受體的優(yōu)先激活來調(diào)節(jié)肝臟再生和纖維化之間的平衡技竟。同樣，肺切除術(shù)后晚胡，肺毛細血管內(nèi)皮細胞分泌血管分泌因子灵奖，如MMP14(基質(zhì)金屬蛋白酶14)嚼沿，促進肺泡上皮再生估盘。重要的是瓷患，研究表明，EC衍生的VEGFC刺激神經(jīng)干細胞在發(fā)育和再生過程中的增殖遣妥。同樣擅编，我們的研究說明了Vegfc在斑馬魚心臟再生中的血管分泌作用，以促進cECs和隨后的心肌細胞的增殖箫踩。我們進一步通過刺激ECM基因emilin2a的表達來描述血管內(nèi)皮生長因子信號通路在心臟再生中所必需的機制爱态。在斑馬魚發(fā)育過程中，Vegfc通過自分泌和旁分泌兩種方式境钟，通過Vegfr3誘導(dǎo)細胞周期阻滯锦担，誘導(dǎo)靜脈和淋巴萌發(fā)。同樣慨削，我們的數(shù)據(jù)顯示洞渔，在心臟再生過程中，cECs和epdc表達emilin2a缚态，表明Vegfc以自分泌和旁分泌的方式促進emilin2a表達磁椒。重要的是，我們發(fā)現(xiàn)玫芦，整體過表達emilin2a刺激冠狀動脈血運重建并減少心臟損傷后的瘢痕浆熔。先前的研究表明，在非再生生物(如medaka15和成年小鼠)的心臟損傷后桥帆，emilin2a的表達不會被誘導(dǎo)医增。這些觀察結(jié)果，以及我們的數(shù)據(jù)強調(diào)了emilin2a在促進斑馬魚心臟再生中的重要性老虫，表明emilin2a增強了再生過程调窍。此外，我們發(fā)現(xiàn)Vegfc信號對emilin2a表達的調(diào)節(jié)也存在于人類內(nèi)皮細胞中张遭，這鼓勵了未來對Vegfc和EMILIN2在促進心肌梗死患者側(cè)支形成中的作用的研究邓萨。

我們的數(shù)據(jù)揭示了ECM分子Emilin2a的改變?nèi)绾斡绊懓唏R魚冠狀動脈血運重建和心臟再生。事實上菊卷，最近的研究強調(diào)了ECM在調(diào)節(jié)包括血管生成在內(nèi)的心臟再生所需的不同過程中的作用缔恳。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)幾個ECM基因在阻斷Vegfc信號傳導(dǎo)時下調(diào)(表S4)洁闰，包括纖維連接蛋白1b (fn1b)歉甚，該基因先前與血管生成和斑馬魚心臟再生有關(guān)。我們推測Vegfc信號改變了幾個ECM基因的表達扑眉，從而創(chuàng)造了一個促進心臟損傷后冠狀動脈血運重建的微環(huán)境纸泄。需要進一步的研究來探索各種ECM蛋白促進心臟再生的潛力赖钞。

為了更好地了解Emilin2a如何發(fā)揮其作為促再生因子的作用，我們確定了促炎趨化因子Cxcl8a作為潛在靶點聘裁。這些結(jié)果與EMILIN2誘導(dǎo)CXCL8表達促進HUVECs遷移的數(shù)據(jù)一致雪营。我們的數(shù)據(jù)顯示，cxcl8a在受損組織的EPDCs中表達衡便，而cxcr1在再生的cECs中表達献起，這表明這兩種細胞類型之間存在相互作用，以調(diào)節(jié)冠狀動脈血供重建镣陕。最近的研究表明谴餐，EPDCs是調(diào)節(jié)斑馬魚和小鼠冠狀動脈再生的重要信號來源。CXCL8已被證明在不同情況下通過激活G蛋白偶聯(lián)受體CXCR1/2作為促血管生成因子呆抑。我們的數(shù)據(jù)顯示cxcl8a和cxcr1突變體的cEC增殖減少岂嗓，這表明在心臟再生的背景下，cxcl8a通過激活cEC表達的cxcr1介導(dǎo)其血管生成作用鹊碍。因此厌殉，先前的報道暗示CXCR1通過不同的信號通路，包括Rho妹萨、Rac和MAPK激活年枕，促進了培養(yǎng)中的HUVECs和雞胚胎中的ECs的增殖。最近的研究表明乎完，EPDCs是調(diào)節(jié)斑馬魚和小鼠冠狀動脈再生的重要信號來源熏兄。

總之，我們的數(shù)據(jù)強調(diào)了Vegfc信號在促進斑馬魚心臟再生中的重要性树姨。我們認為Vegfc信號可以誘導(dǎo)ECM成分Emilin2a和趨化因子Cxcl8a以及其他因子的表達摩桶，從而提供促進心臟再生的環(huán)境。我們的研究結(jié)果帽揪，以及顯示VEGFC信號在促進哺乳動物冠狀動脈發(fā)育中的重要性的數(shù)據(jù)硝清，為研究VEGFC-emilin2-cxcl8信號軸在哺乳動物心肌梗死后促進側(cè)支形成，從而改善心功能的潛力奠定了堅實的基礎(chǔ)转晰。

原文：El-Sammak H, Yang B, Guenther S, Chen W, Marín-Juez R, Stainier DYR. A Vegfc-Emilin2a-Cxcl8a Signaling Axis Required for Zebrafish Cardiac Regeneration. Circ Res. 2022 Apr;130(7):1014-1029. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.121.319929. Epub 2022 Mar 10. PMID: 35264012; PMCID: PMC8976759.

原文地址：https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/CIRCRESAHA.121.319929

注：因文章篇幅有限芦拿，所有相關(guān)引用文獻，以及補充圖查邢、表可以點擊至原文查閱蔗崎。