雜志：Disease Models & Mechanisms

影響因子：5.1（近5年）

年份：2018

通訊作者：saulius.sumanas@cchmc.org

通訊作者單位：辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)中心發(fā)育生物學(xué)部，辛辛那提恬惯，45229向拆，美國。

摘要

背景：膠原XXII (COL22A1)是一種數(shù)量較少的膠原酪耳，屬于具有中斷三螺旋的原纖維相關(guān)膠原家族浓恳。對其生物學(xué)功能的了解甚少。

方法：在這里碗暗，我們使用基因組編輯方法在斑馬魚col22a1中產(chǎn)生了一個功能缺失的突變體颈将。純合子突變的成年斑馬魚顱內(nèi)出血的發(fā)生率增加，隨著年齡的增長和心血管壓力的增加言疗，顱內(nèi)出血的發(fā)生率會變得更加突出晴圾。純合子col22a1突變胚胎對心血管應(yīng)激表現(xiàn)出更高的敏感性，血管通透性增加噪奄，導(dǎo)致胚胎顱內(nèi)出血的比例更高死姚。突變胚胎還表現(xiàn)出顱內(nèi)血管擴張和不規(guī)則結(jié)構(gòu)人乓。為了測試COL22A1是否與人類血管疾病相關(guān)，我們分析了先前一項研究的數(shù)據(jù)都毒，該研究對來自7個顱內(nèi)動脈瘤家族的45名個體進(jìn)行了全外顯子組測序色罚。

結(jié)果：鑒定出rs142175725單核苷酸多態(tài)性，該多態(tài)性與表型分離在其中一個家族的所有4個受影響個體中温鸽，并影響CoL22A1蛋白中高度保守的E736殘基保屯，導(dǎo)致E736D替代。人類野生型COL22A1的過表達(dá)涤垫，而不是E736D的過表達(dá)姑尺，部分地挽救了斑馬魚胚胎中COL22A1功能缺失突變的表型。我們的數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明蝠猬，E736D突變干擾COL22A1蛋白分泌切蟋，可能導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

結(jié)論：總之榆芦，這些結(jié)果表明COL22A1是維持血管完整性所必需的柄粹。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，COL22A1突變可能是人類顱內(nèi)動脈瘤的危險因素之一匆绣。

關(guān)鍵詞：顱內(nèi)動脈瘤驻右；膠原蛋白；斑馬魚崎淳；血管完整性

前言

膠原蛋白包括一個大家族的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白堪夭，它在所有器官的組織完整性中起著關(guān)鍵作用。人類至少有28種不同的膠原蛋白類型拣凹。纖維狀膠原是纖維膠原是由三種多肽鏈組成的三聚體分子包含序列重復(fù)Gly-X-Y并形成三螺旋森爽。主要的纖維性膠原，如膠原I嚣镜，分布廣泛爬迟，存在于多種間充質(zhì)結(jié)締組織中，包括骨菊匿、軟骨付呕、肌腱等。原纖維相關(guān)的三螺旋中斷膠原(FACIT)家族膠原包括數(shù)量較少的膠原跌捆，它們通常與主要膠原共聚成上層結(jié)構(gòu)凡涩，并介導(dǎo)原纖維與其環(huán)境之間的配體相互作用。FACIT蛋白參與調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)及其纖維性膠原網(wǎng)絡(luò)的完整性和穩(wěn)定性疹蛉。膠原蛋白XXII (COL22AI)是最近發(fā)現(xiàn)的屬于FACIT家族的膠原蛋白之一。它包含一個n端假性血友病因子樣結(jié)構(gòu)域力麸，隨后是一個凝血蛋白n端結(jié)構(gòu)域和一個長膠原結(jié)構(gòu)域可款，其中有幾個Gly-X-Y重復(fù)序列的中斷育韩。已知COL22Al集中在肌肉、肌腱闺鲸、心臟筋讨、關(guān)節(jié)軟骨和皮膚的組織連接處。它沉積在肌腱連接處的基底膜上摸恍，并被證明與軟骨中的纖維外基質(zhì)有關(guān)悉罕。有報道稱，斑馬魚胚胎中col22al morpholino敲低會破壞肌腱連接處并誘發(fā)肌肉萎縮立镶。然而壁袄，morpholinos容易產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。迄今為止媚媒，還沒有在任何脊椎動物有機體中分析Col22al基因突變的報道嗜逻。因此，人們對該蛋白的生物學(xué)作用仍然知之甚少缭召。

除了在結(jié)締組織的結(jié)構(gòu)完整性中發(fā)揮主要作用外栈顷，膠原蛋白還是血管壁內(nèi)ECM的主要成分。血管壁包含內(nèi)皮下基底膜嵌巷、內(nèi)膜萄凤、中膜、外膜和間質(zhì)基質(zhì)層搪哪。這些層中的每一層都含有多種類型的膠原蛋白靡努，這些膠原蛋白對血管的穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)完整性至關(guān)重要。IV型膠原是基底膜的主要成分噩死，人類CoL4Al的突變與多種綜合征有關(guān)颤难，包括顱內(nèi)動脈瘤和腦出血。纖維性膠原I已维、III和V的突變與埃勒斯-當(dāng)洛斯綜合征有關(guān)行嗤，并可導(dǎo)致動脈破裂和動脈瘤。然而垛耳，F(xiàn)ACIT膠原在維持血管穩(wěn)定性方面的作用目前尚不清楚栅屏，Col22al此前也未被證實與血管完整性有關(guān)。

顱內(nèi)漿果動脈瘤;IAs是顱內(nèi)主要動脈壁上的小漿果狀或球囊狀缺陷堂鲜。蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)占腦卒中病例的7%栈雳，但死亡率很高。最重要的是缔莲，30%的SAH患者在一個月內(nèi)死亡哥纫。SAH是由內(nèi)腔破裂引起的，然后會損傷腦實質(zhì)痴奏。除了破裂的IAs外蛀骇，據(jù)估計厌秒，0.5-2.0%的普通人群中會發(fā)生未破裂的IAs，這會增加個體發(fā)生SAH的風(fēng)險擅憔。目前鸵闪，遺傳和環(huán)境因素都與卒中易感性有關(guān)。

先前的全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)鑒定了EDNRA暑诸、SOXI7蚌讼、CDKN2BAS/ANRIL、CNNM2个榕、KL/STARD13和RBBP8與IAs風(fēng)險增加相關(guān)篡石。為了確定導(dǎo)致IA易感性的其他風(fēng)險因素，對七個有多個IAs患者的家庭進(jìn)行了全外顯子組測序(WES) 笛洛。數(shù)據(jù)顯示了易感的候選基因座夏志，盡管CoL22A1在原始研究中沒有報道。

斑馬魚已成為研究血管發(fā)育和功能的有利模型系統(tǒng)苛让。透明胚胎經(jīng)歷外部發(fā)育沟蔑，易于進(jìn)行實驗觀察和操作。調(diào)控血管發(fā)育和穩(wěn)定性的分子機制在包括斑馬魚和人類在內(nèi)的多種脊椎動物之間高度保守狱杰。因此瘦材，斑馬魚被廣泛用于模擬和研究人類多種心血管疾病，包括出血性中風(fēng)仿畸。

本研究采用斑馬魚模型系統(tǒng)研究Col22al的功能作用食棕。通過利用col22al中的斑馬魚基因突變體。我們發(fā)現(xiàn)Col22al在促進(jìn)血管穩(wěn)定方面起著重要作用错沽。此外簿晓，我們重新分析了家族性IAs WES研究的原始數(shù)據(jù)，并在其中一個家族的所有受影響個體中發(fā)現(xiàn)了rs142175725 SNP千埃，預(yù)計該SNP會導(dǎo)致COL22A1蛋白序列中的E736D替換憔儿。我們證明，E736D在斑馬魚胚胎中過度表達(dá)時放可，會干擾COL22Al功能并導(dǎo)致出血谒臼。我們的研究結(jié)果確定了Col22al在維持血管穩(wěn)定性方面的新作用，并表明COL22Al的突變可能是顱內(nèi)動脈瘤的原因之一耀里。

材料和方法

實驗中使用的斑馬魚系如下:Tg(flila:EGFPP)蜈缤、Tg(kdrl:GFPys4s、Tg(acta2:EGFP冯挎、Tg(sox10(7.2):mRFP)底哥、TgBAC(pdgfrb:EGFP)和AB WT(斑馬魚國際資源中心)。胚胎按照文中所述在28.5°C或33.5°C下孵育，并使用先前描述的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期叠艳。超過24 hrt的胚胎用0.003%的1-苯基-2-硫脲(PTU)處理奶陈，以抑制色素的形成。成年斑馬魚被安置在一個循環(huán)系統(tǒng)(Pentair)中附较。這些魚是按照機構(gòu)動物護理和使用委員會批準(zhǔn)的方案飼養(yǎng)的。

構(gòu)建TALEN突變col22a1

我們使用TALENs產(chǎn)生col22a1ci16突變潦俺，該突變攜帶外顯子2的5個核苷酸缺失(ENSDARG00000078899,Zv9)拒课。使用Golden Gate TALEN試劑盒組裝TALEN構(gòu)建體，對應(yīng)于以下序列:TAL-L,NH NI NG HD NG NH NH NH NG NI NG NG HD NI NG NG NG NG NG NH;TAL-R,hd ni ni ni ng ng hd Ng hd hd Ng Ng nh hd hd這些二聚體識別間隔片段(大寫)內(nèi)的目標(biāo)col22a1序列(斜體)事示。TGATCTGGTATTCATTTTGgacacctcttcaagtgTGGGCAAGGAGAATTTTGA早像。利用PCR引物(補充信息)和EarI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行基因分型以區(qū)分突變型條帶和野生型條帶。

細(xì)胞系使用和轉(zhuǎn)染

人原代肺成纖維細(xì)胞CCD-19 Lu[美國型培養(yǎng)集合CCL-210;來自辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)療中心(CCHMC)肖爵，辛辛那提卢鹦，OH, usa的Timothy LeCras博士的禮物保存在37°C和5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中。細(xì)胞孵育過夜劝堪，直到它們達(dá)到80-90%的融合度冀自。然后用0.25%胰蛋白酶/EDTA處理細(xì)胞，用1%明膠將細(xì)胞接種于帶微卡的12孔板中秒啦。當(dāng)它們達(dá)到S0-70%的合流性時熬粗。根據(jù)描述的方案(Themo Fisher Scientific, 116688027)，用脂質(zhì)體進(jìn)行短暫變性余境。

WISH和HCR

從Open Biosystems (Thermo Fisher Scientific)獲得了pExpress-l中斑馬魚col22部分序列對應(yīng)的互補DNA (cDNA)克隆驻呐。使用SP6 RNA聚合酶(Promega, P407Al)從ecorv線性化的col22al- pexpress -1中生成地高辛標(biāo)記的col22al核糖核酸探針。pdgfrb探針的生成如前所述(該構(gòu)建物由Appel實驗室慷慨捐贈)芳来。如前所述(Jowett, 1999)含末，將胚胎用4%多聚甲醛(PFA: Electron Microscopy Sciences, 15714)洗滌，然后用PBS+0.1% Tween 20 (PBST)洗滌即舌。胚胎在RIMS清除試劑中孵育1小時(30 g Histodenz在40 ml 0.2 M磷酸鹽緩沖液中加入50 ul Tween 20和10 mg疊氮化鈉)佣盒，然后用PBsT廣泛洗滌。處理后的胚胎在100%甲醇中脫水侥涵，在-20°C下保存沼撕，以提高對比度，然后在1倍PBS中再水化芜飘，并在蓋蓋下裝在3%甲基纖維素中進(jìn)行成像务豺。使用蔡司M2BioV12立體顯微鏡拍攝圖像。

按照描述對col22al和colal共表達(dá)進(jìn)行HCR(版本3)嗦明。HCR探針是由加州理工學(xué)院貝克曼研究所的分子技術(shù)合成的笼沥。美國加州帕薩迪納市。為了進(jìn)行kdrl:GFP的共表達(dá)和col22分析，將GFP陽性胚胎固定在3 dpf處奔浅。隨后馆纳，使用col22 HCR探針對其進(jìn)行處理。HCR后仍可見GFP熒光汹桦。使用尼康A(chǔ)l共聚焦顯微鏡和CCHMC共聚焦成像芯對胚胎進(jìn)行成像鲁驶。

免疫化學(xué)

使用以下一抗:斑馬魚抗col22al (1:20 00;F. Ruggiero捐贈)，山羊抗人COL22A1(胚胎組織1:50舞骆，成纖維細(xì)胞N17 1:20 00;Santa Cruz Biotechnology, sc87647)钥弯，兔抗層粘連蛋白(1:100;Sigma-Aldrich, L9393)，小鼠抗—微管蛋白牛(1:400:Life Technologies, A11126)督禽，小鼠抗vimentin (1:50;Thermo Fisher Scientific, MA5-11883)脆霎，能夠識別RFP的兔子anti-DsRed (1:100;Takara, Living Colors, 632496)，Alexa Fluor 488 Phalloidin (Thermo Fisher Scientific, A12379)狈惫，小鼠抗krti8 (1:27;Abgent, AT2655a)睛蛛，家兔抗gfp (1:20 00;Life Technologies A21311)， Alexa Fluor抗兔594 (1:20 00;Life Technologies胧谈，R37117)忆肾， Alexa Fluor抗山羊488 (1:20 00;Life Technologies, Al1055)和Alexa Fluor抗小鼠488 (1:20 00;Life Technologies, A11001)，使用延長金剛石Antifade mount培養(yǎng)基分析Tubulin染色;采用VectaShield 4′第岖，6-diamidino-2phenvlindole (DAPI)掛載培養(yǎng)基分析層粘連蛋白染色难菌。使用斐濟 (ImageJ)軟件(美國國立衛(wèi)生研究院)對WT胚胎和Col22al突變體的Col22al免疫熒光染色圖像進(jìn)行量化。在肌隔區(qū)域隨機選擇的五個點的熒光強度的平均值用斐濟計算蔑滓，然后進(jìn)行背景減法郊酒。WT胚與col22突變體的相對熒光強度比為20.3:1。

切片的WISH/免疫熒光

將wish處理的胚胎固定在4% PFA中30分鐘键袱，并用PBST洗滌燎窘，然后按照前面描述的方法進(jìn)行包埋。使用Microm HM 550 crvostat冷凍胚胎蹄咖。將載玻片風(fēng)干2小時或過夜褐健。然后將載玻片在100%乙醇中脫水5分鐘，然后風(fēng)干5分鐘澜汤。切片用PBS再水化2次蚜迅，每次5分鐘。然后用PBST洗滌5分鐘俊抵，然后用阻斷液(1%牛血清白蛋白在PBST中)洗滌1小時谁不。載玻片在含一抗的阻斷液中在4°C下孵育過夜。然后將含二抗的阻斷溶液在室溫下作用于載玻片2小時徽诲。在CCHMC共聚焦成像核心設(shè)施使用尼康共聚焦AlRsi倒置顯微鏡(40倍物鏡)捕獲圖像刹帕。如前所述吵血，對NBT/ BCIP底物熒光進(jìn)行共聚焦成像。

TEM

為了進(jìn)行TEM分析偷溺，將斑馬魚幼魚在100 mM乙酸鹽緩沖液中固定在2.5%新鮮戊二醛中蹋辅，在4°C下過夜。然后將幼魚用代謝酸緩沖液洗滌挫掏，后用1%的單寧酸固定侦另。然后將它們轉(zhuǎn)移到1%的四氧化鋨中，然后在丙酮系列脫水后砍濒，用Embed-812樹脂(Electron Miernscony Sciences)包埋淋肾。超薄切片(100 nm)被切割，放置在單槽或200目銅網(wǎng)格上爸邢，并在JEOL JEM 1010上成像。

斑馬魚成年和胚胎的心血管壓力

斑馬魚成年和胚胎的心血管壓力對成年混合性WT和col22al TALEN純合突變體在51號游泳隧道中進(jìn)行過度強迫游泳運動前沒有任何外部出血進(jìn)行檢查(Loligo Systems, SW10050)拿愧。游泳速度手動調(diào)整為750 V, 5條魚每天運動2次杠河，每次60分鐘，每周5天浇辜，持續(xù)3周券敌。

ptu處理的胚胎保存在28.5°C。當(dāng)胚胎達(dá)到24hpf時柳洋，將其轉(zhuǎn)移到33.5℃培養(yǎng)箱中待诅，連續(xù)保存2天。在72 hpf時熊镣，按照前面的描述卑雁，使用o-Dianisidine對胚胎進(jìn)行血紅素染色處理。

組織學(xué)

石蠟塊在徠卡RM 2125切片機上切成10 um切片绪囱。切片然后在水浴中漂浮测蹲，然后放置在棚子上。帶切片的玻璃板在6℃下烘烤干燥鬼吵，然后將切片裝上Ventana Svmnhony自動染色機(Ventans Medical Systems, Tucson, AZ, USA)進(jìn)行蘇木精和伊紅染色(使用默認(rèn)設(shè)置的標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行H&E染色)扣甲。該系統(tǒng)結(jié)合了烘烤、脫蠟齿椅、染色和蓋滑動的過程琉挖，產(chǎn)生永久安裝和h&e染色的切片，用于組織學(xué)顯微鏡評估涣脚。

Microangiography

用10 kDa tritc -葡聚糖(分子探針示辈，Life Technologies, D1817)或熒光微球(熒光分子探針，Invitrogen)將72 hpf或96 hpf的熱應(yīng)激活胚胎注射到卵泡周圍空間涩澡。F8786)顽耳，并被嵌入在低熔點瓊脂糖和立即成像使用尼康A(chǔ)IR lunv倒置顯微鏡與20倍/0.75多浸泡物鏡在CCHMC Confoca坠敷。成像核心設(shè)備，使用斐濟軟件計算最大強度投影射富。在兩個獨立實驗中獲得的12個突變型和12個野生型胚胎中膝迎，使用Fiii軟件在每個代表性血管的三個選定點測量血管直徑。

人COL22A1 mRNA過表達(dá)

包含全長人類COL22AI序列的Gateway入口構(gòu)建物pENTR223.1從Open Biosystems (Thermo fish: Scientific)獲得胰耗。利用Gateway克隆方法(Thermo Fisher Scientific)將該構(gòu)建體亞克隆到pCS2 Dest載體中限次。使用位點定向突變試劑盒(Agilent Technologies)對pCS2-Dest載體中存在的人類COL22/I編碼序列中的E736D突變進(jìn)行G-to-T替換。COL22AI pCS2-Dest載體與Kpnl線性化柴灯，并使用SP6 mMessage mMachine試劑盒(Ambion, AM1340)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄卖漫。在單細(xì)胞期，將380 pg WT或突變體E736D mRNA注射到斑馬魚胚胎中赠群。胚胎在胚環(huán)上進(jìn)行記分羊始，在明場成像下進(jìn)行屏蔽期，或在4% PFA中固定過夜進(jìn)行免疫熒光查描。

誘導(dǎo)過表達(dá)人COL22A1 WT和E736D突變體構(gòu)建物的產(chǎn)生

為了制備tol2-hsp70:COL22A1-2A-mCherry, a-crystallin:DsRED-tol2突委，使用位點特異性Gateway重組技術(shù)進(jìn)行LR反應(yīng)，構(gòu)建如下結(jié)構(gòu):tol2-hsp70:CoL22Al-2A冬三。mCherry匀油，一個帶有hsp70啟動子(p5E-hsp70)的入口載體;pDONR223 (Invitrogen)中具有attLI和atti位點的全長人類COL22AI基因:帶有2A-mCherrypA的3'入口載體;目的載體:pDestTol2p2A, a-crystallin:DsRED。為了制備col22al-His-mye勾笆，使用人COL22Ai在pDONR223和pEZHis-mye中進(jìn)行LR反應(yīng)(由辛辛那提兒童醫(yī)院Aaron Zorn博士慷慨提供)敌蚜。突變體E736D COL22AI構(gòu)建體以tol2-hsp70:COL22A1-2A-mCherry和COL2241-His-mye構(gòu)建體為模板，通過Quick Change II XL位點定向突變技術(shù)生成窝爪。

COL22A1條件過表達(dá)式

WT  Tg（hsp70：COL22Al-mCherry8將25 pg tol2-hsp70:COL22A1-mCherry, a-crystallin:DsRED-tol2和25 pg tol2 mRNA注入單細(xì)胞期斑馬魚胚胎中弛车，獲得Tg(hsp70:E736D col22ai - mchery31)和Tg(hsp70:E736D col22ai - mchery31。通過熱休克誘導(dǎo)mCherry或crystin:DsRED表達(dá)鑒定轉(zhuǎn)基因胚胎酸舍，并將轉(zhuǎn)基因胎和對照胚胎組在28.5°C下培養(yǎng)帅韧，24 hpf和48 hpf在37°C下熱休克兩次1 h，然后返回28.5°C培養(yǎng)并分析是否有出血啃勉。篩選創(chuàng)始人是否成功傳播mCherry和DsRED忽舟。

化學(xué)處理MMP抑制劑

GM6001 (Millipore, CC1010)作為2.5 mM的二甲氧基亞砜(DMSO)庫存購買。如前所述淮阐，瞬時過表達(dá)Tg(hsp70:col22almCherry)和穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因胚胎在24 hpf的胚胎水中用25 μ m GM6001處理叮阅。胚胎保存在藥物溶液中，直到72 hpf泣特，并分析出血情況浩姥。

qPCR

cDNA制備和qPCR按照之前的描述進(jìn)行(Craig et al.， 2015)状您。簡單地說勒叠，將胚胎冷凍在干冰上兜挨，并通過22號針進(jìn)行勻漿。RNA提取使用RNA-水溶液4RT-PCR試劑盒(Life Technologies)眯分。cDNA通過上標(biāo)Vilo (Invitrogen, 11754-050)獲得拌汇。在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用Power up SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems)在StepOne PCR機(Thermo Fisher Scientific)上進(jìn)行qPCR。使用三個獨立的RNA樣本進(jìn)行實驗比較弊决，每個基因重復(fù)進(jìn)行qPCR噪舀。將bip、hsp5和mmp9的表達(dá)水平歸一化為efla飘诗。采用2-AscT Livak法和Student's -test對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析与倡。qPCR使用的引物如下:

FIA研究中的測序

WES在遺傳疾病研究中心(Johns Hopkins University, Baltimore, MD, USA)對參與FIA研究的7個多重IA家族的45名個體(35名受影響，10名未受影響)進(jìn)行昆稿。根據(jù)機構(gòu)審查委員會批準(zhǔn)的方案纺座，在知情同意的情況下收集了用于WEs和靶向測序的患者樣本。隨后在456個不相關(guān)的家族性FIA研究樣本中使用多重PCR對COL22A1基因座的外顯子特異引物進(jìn)行了COL22A1基因座的靶向測序溉潭。使用Agilent SureSelect XT Custom ELID試劑盒捕獲目標(biāo)區(qū)域比驻。采用與WES項目相同的方案進(jìn)行配對端測序。

圖像處理

在Adohe photoshoncss中組裝的圖像納米層使用I - level功能對許多納米層進(jìn)行非線性熱調(diào)整岛抄，以增加圖像的對比度和清晰度。在所有情況下狈茉，在對照和實驗(突變)胚胎之間進(jìn)行了類似的調(diào)整夫椭。

結(jié)果

此前已有報道稱，斑馬魚胚胎中骨骼肌肌隔和肌腱交界處有col22表達(dá)氯庆。然而蹭秋，其在軀干區(qū)域外的表達(dá)尚未被表征。為了確定顱組織中col22al的表達(dá)模式堤撵，我們在受精后29 h (hpf)仁讨、72 hpf和96 hpf對斑馬魚胚胎進(jìn)行了全載原位雜交(WISH)(圖1)。在29 hpf時实昨，col22al的表達(dá)在眼睛周圍很明顯洞豁，從48-96 hpf開始，col22al在大腦內(nèi)側(cè)區(qū)域和眼睛腹側(cè)之間的表達(dá)顯著增加荒给。這種表達(dá)也集中在咽弓和胸鰭中丈挟。此外，col22al在29 hpf的骨骼肌和48-96 hpf的肌腱交界處強烈表達(dá)志电，如先前報道曙咽。

圖1 WISH分析col22a1表達(dá)譜。(A- f) 在29 hpf時在腹側(cè)和外側(cè)觀察平裝胚胎中col22a1的表達(dá)(A挑辆。B)例朱， 48 hpf (C,D)和96 hpf (E,F)孝情。 在體突肌(箭頭，B)和肌腱交界處(箭頭洒嗤，D,F)檢測到表達(dá)箫荡，col22a1在眼睛周圍(星號)、耳朵烁竭、胸鰭(pf)和咽弓(箭頭)也檢測到表達(dá)菲茬。

為了更詳細(xì)地表征顱組織中col22al表達(dá)細(xì)胞的特征，我們使用雜交鏈反應(yīng)(HCR)方法對col22al和collal (als:稱為collala)進(jìn)行了雙色熒光原位雜交(FISH)派撕， col22al和collala在結(jié)締組織和成纖維細(xì)胞中表達(dá)婉弹。在共聚焦切片中，在受精后3天(dpf)的胚胎中终吼，在眼睛周圍的結(jié)締組織镀赌、顱面肌、副骨际跪、心臟商佛、角狀支氣管內(nèi)的軟骨細(xì)胞以及發(fā)育中的耳朵內(nèi)的角狀弓和結(jié)締組織中觀察到col22al的表達(dá)(圖2A-F)。顱面肌和心臟內(nèi)Col22al的表達(dá)與結(jié)締組織的表達(dá)不重疊姆打，角鰓弓內(nèi)Col22al陽性細(xì)胞被結(jié)締組織陽性細(xì)胞包圍良姆。然而，這兩種標(biāo)記物的表達(dá)在副蝶骨幔戏、耳部組織玛追、眼周結(jié)締組織以及胸舌肌和舌舌肌的肌腱/韌帶附著部位重疊。在軀干區(qū)域的肌腱連接處闲延，所有表達(dá)col22al的細(xì)胞也呈collal表達(dá)陽性(圖2G-I)痊剖。為了分析col22al相對于血管的表達(dá)，用HCR染色Tg(kdrl:GFP)胚胎，在72 hpf下進(jìn)行col22al的表達(dá)，并用共聚焦顯微鏡成像球及。col22al在多根顱血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)是明顯的(圖2J-L)。為了成像更深的顱骨組織叮贩，常規(guī)的WISH隨后進(jìn)行血管內(nèi)皮特異性flila的免疫熒光:GFP表達(dá)。頭部區(qū)域的縱向冷凍切片揭示了col22al在顱血管亞群附近結(jié)締組織的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)想暗，特別是在眼周區(qū)域(圖2M-O)妇汗。一些扁平的梭狀表達(dá)col22al的細(xì)胞被染色為Krt18陽性(也稱為Krt18a.1)，已知在4 dpf時在視神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞和Muller膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)(圖SIA-C)说莫，我們還檢測到col22al和Krt18陽性細(xì)胞的另一個亞群杨箭，其形狀呈立方體。此外储狭，許多col22al陽性細(xì)胞位于3 dpf處的中間絲蛋白Vimentin附近(圖SID-F)互婿。由于顱結(jié)締組織的很大一部分來自神經(jīng)嵴(Bronner和LeDouarin,d 2012)捣郊，我們測試了col22與sox10:RFP的共定位，已知sox10:RFP在神經(jīng)嵴來源的組織中表達(dá)(SimoesCosta和Bronner, 2015)慈参。事實上呛牲，col22的表達(dá)與sox10:RFP的表達(dá)在靠近眼睛的顱組織的一部分細(xì)胞中重疊(圖s1g-i)，在咽弓的大多數(shù)細(xì)胞中重疊(圖S1J-L)驮配，表明這些細(xì)胞來源于神經(jīng)嵴娘扩。綜上所述，在血管內(nèi)皮細(xì)胞壮锻、咽肌和血管周圍成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞亞群中觀察到col22al在3 dpf和4 dpf處的表達(dá)琐旁。

圖2 采用FISH和FISH/免疫熒光法分析頭干區(qū)col22a1的表達(dá)。(A-1) co/22af(紅色)和colfa1(綠色)在3 dpf的表達(dá)猜绣，通常標(biāo)記結(jié)締組織灰殴。HCR分析表達(dá)。在顱組織的橫向共聚焦切片(腹側(cè)視圖掰邢，A-F)中牺陶，col22a1在眼周組織(箭頭，C)辣之、顱面肌肉(包括舌骨骨突(sh)和舌骨舌突(hh)肌肉)掰伸、副骨(Ps)、心臟(h)怀估、角狀鰓裂(cb)和角狀弓(ch)內(nèi)推定的軟骨細(xì)胞以及發(fā)育中的耳內(nèi)結(jié)締組織(耳囊碱工，oc)中表達(dá)明顯。注意奏夫，這兩種標(biāo)記物的表達(dá)在副蝶骨、耳部組織历筝、眼周結(jié)締組織(箭頭酗昼，C)以及胸骨舌骨肌和舌骨舌肌的肌腱/韌帶附著部位(箭頭，C)重疊梳猪。在主干區(qū)域的肌腱連接處(G-l)麻削，所有表達(dá)col22a1的細(xì)胞也都是colfaf表達(dá)陽性。請注意春弥，colfaf也標(biāo)記表皮內(nèi)的角化細(xì)胞呛哟。HCR分析(J-L) col22af表達(dá)與血管內(nèi)皮細(xì)胞kdrl:GFP表達(dá)部分重疊。用共聚焦顯微鏡對3 dpf全胚的顱血管系統(tǒng)進(jìn)行背側(cè)成像匿沛。前指頂部扫责。所選切片的最大強度投影。(M-O) 72hpf下逃呼，用WISH/免疫熒光染色染色col22a1(紅色)和血管內(nèi)皮fi1:GFP(綠色)的胚胎縱向顱骨切片鳖孤。col22a1在血管周圍基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)明顯(箭頭者娱，K)。b苏揣，腦;e,眼睛;Ec黄鳍，內(nèi)皮細(xì)胞。注意平匈，與J-L中col22at的血管表達(dá)相比框沟，這些切片位于更腹側(cè)。

最近的幾項研究對小鼠腦和血管成體或胚胎組織進(jìn)行了單細(xì)胞分析增炭。我們分析了單細(xì)胞圖譜(R)獲得的數(shù)據(jù)集中Col22al的表達(dá)忍燥。Col22al在成年小鼠的血管周成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞中表達(dá)最高(圖S2A,B)，而血管內(nèi)皮細(xì)胞的Col22al表達(dá)低得多弟跑，但仍然顯著灾前。另一項研究在出生后日(P) 2和P11對出生后小鼠腦和脊髓進(jìn)行了scRNA-seq。在出生后的小鼠中孟辑，在合并的腦和脊髓簇中哎甲，Col22al的平均表達(dá)在一組“血管和軟腦膜細(xì)胞2”(圖S2C)中最高，這些細(xì)胞也呈Sle6a13和包括Collal和Colla2在內(nèi)的多種其他膠原同源物陽性饲嗽，提示這些細(xì)胞可能與Vanlandewijck等(2018)報道的血管周成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞相似炭玫。Col22al在室管膜和平滑肌細(xì)胞中也有顯著表達(dá)。我們還觀察到內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)較低貌虾，但仍顯著(圖S2C)吞加。這些結(jié)果表明，Col22al在斑馬魚和小鼠中均表達(dá)于血管周成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞尽狠。

Col22a1缺失導(dǎo)致出血

為了評估col22al在體內(nèi)的功能衔憨，我們設(shè)計了一對靶向斑馬魚col22al的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALEN)構(gòu)建體。我們產(chǎn)生了一個缺失5個堿基對的突變系袄膏，預(yù)計這將導(dǎo)致移碼践图，導(dǎo)致提前終止密碼子(圖3A.B)。Col22al蛋白的免疫染色顯示沉馆，在純合子突變胚胎中码党，肌間隔處的特異性免疫熒光完全喪失[圖3C,D:野生型(WT)和突變胚胎的定量熒光強度比為20.3:1]，提示該突變可能為無效斥黑。col22al純合或雜合突變的胚胎和幼魚均未見明顯表型揖盘，可存活至成魚。部分col22a純合突變成人發(fā)生眼周出血(圖3H)锌奴。隨著年齡的增長兽狭，純合子突變成人發(fā)生肉眼出血的百分比增加，而雜合子兄弟姐妹未表現(xiàn)出任何明顯的表型。我們觀察到椭符，25%的突變型成人在7月齡時出現(xiàn)出血荔燎，而60%的突變型成人在2歲時出現(xiàn)出血(圖1 3e)。這些數(shù)據(jù)表明销钝，衰老可能是促進(jìn)成年魚疾病進(jìn)展的一個潛在因素有咨。因此，我們假設(shè)蒸健，施加強迫的過度心臟超負(fù)荷應(yīng)激會導(dǎo)致突變體在較年輕時出現(xiàn)更頻繁的出血表型座享。我們完成了為期3周的強制快速間歇性游泳運動方案，并分析了眼部可見出血的頻率似忧，觀察到在之前無明顯表型的6月齡純合子突變體中渣叛，67%在運動后出現(xiàn)了眼部血池(圖3E-G)。在這些條件下盯捌，野生型魚沒有發(fā)生出血淳衙。

由于心臟應(yīng)激會導(dǎo)致成年魚出血，我們推測類似的環(huán)境應(yīng)激也會加劇胚胎的表型饺著。我們采用了之前描述的心血管應(yīng)激策略箫攀，從24 hpf開始，將純合子和雜合子col22al突變體和野生型胚胎在33.5℃的高溫下飼養(yǎng)連續(xù)兩天幼衰。純合突變胚胎對熱應(yīng)激的敏感性增加靴跛，顱內(nèi)出血的發(fā)生率是野生型和雜合型胚胎的2.5倍(圖4 a - c)。與雜合或WT胚胎相比渡嚣，有更多的熱應(yīng)激冷突變胚胎在頭部區(qū)域梢睛、眼睛和軀干表現(xiàn)出血液積累(圖4D-F;表S1)。有趣的是识椰，這些出血發(fā)生在col22al表達(dá)的位置或附近绝葡。

圖3 Col22af——突變的成魚表現(xiàn)出出血。(AB)使用TALEN生成col22af斑馬魚突變系腹鹉。純合子col22af突變體的Sanger測序數(shù)據(jù)顯示挤牛，有一個5 bp的缺失TCTTC(框;右圖箭頭)導(dǎo)致幀移位(a)和蛋白質(zhì)序列中的過早終止密碼子(B)。(C.D) col22a1和col22af胚胎中3dpf處對斑馬魚Col22at的免疫染色种蘸。與col22at -胚胎相比，col22af-突變體(箭頭)的肌隔沒有染色竞膳，這表明該突變可能為零航瞭。使用Axiovision軟件(蔡司)中的Extended Focus功能合并Z-stack中選定的切片。(E) col22at-f突變體出血的頻率隨著年齡的增長而增加坦辟，而運動導(dǎo)致col22af-突變體在更早的年齡表現(xiàn)出這種表型刊侯。(F.G) 6個月大的col22a-成人在3周的間歇性強迫運動后出現(xiàn)明顯的眼部積血(黑色箭頭，G)锉走，而WT成魚則沒有(F)滨彻。(H)沒有運動藕届，2歲的col22a1-成魚也表現(xiàn)出明顯的眼部積血(白色箭頭)。

圖4 在溫度升高的情況下亭饵，同質(zhì)雜交的col22at-胚胎顯示出出血百分比增加休偶。胚胎用3 dpf的o-Dianisidine染色。(A)異種雜交的col22a1-胚胎顯示頭部有小的分散的血細(xì)胞辜羊，而col22a1胚胎的大腦內(nèi)有明顯的大出血(箭頭踏兜，B)。(C)與WT和col22a1-胚胎相比八秃，col22at-突變胚胎在熱應(yīng)激后出現(xiàn)出血的比例明顯更高碱妆。“Pc0.005昔驱，由卡方檢驗確定疹尾。胚胎數(shù)由三個獨立實驗(兩個為col22at-胚胎)組合而成。每個實驗的評分?jǐn)?shù)見表S1骤肛。(D-F)熱應(yīng)激col22a1-'胚胎不同部位出血(箭頭)的例子纳本。

Col22a1缺失破壞血管完整性

為了確定col22a突變體的血管模式是否受到影響，將它們雜交到血管內(nèi)皮特異性Tg(kdrl: GFP)報告細(xì)胞系中萌衬。在3 dpf和4 dpf(圖5A-D)時饮醇，熱應(yīng)激冷突變胚胎的顱骨血管模式?jīng)]有明顯變化。在col22突變體和WT對照胚胎之間秕豫，包括中央動脈在內(nèi)的背側(cè)顱骨血管的直徑和大體外觀沒有顯示出任何顯著差異(圖5A-D朴艰，數(shù)據(jù)未顯示)。然而混移，幾個位于較深位置的血管的顯著差異是明顯的祠墅。在WT胚胎中，包括原始后腦通道(PHBC)歌径、初級頭竇毁嗦、原始中腦通道(PMBC)和腭腦靜脈(PLV)在內(nèi)的幾條血管在位于兩側(cè)分支點的周圍融合。這些分支點的脈管系統(tǒng)在col22突變體中嚴(yán)重擴張回铛，單個血管經(jīng)常出現(xiàn)合并狗准，無法分離(圖SE-H)。PLV將血液返回到位于雙側(cè)的PMBC和PHBC茵肃，具有高度不均勻和畸形的外觀腔长，具有多個擴張區(qū)域，通常表現(xiàn)出額外的分支或叢狀網(wǎng)絡(luò)(圖SE,FIJ)验残。col22突變體胚胎在該分支點和PLV內(nèi)的平均血管直徑顯著增加(圖50)捞附，此外，col22突變體的側(cè)背主動脈(LDA)直徑增加。

為了分析低溫突變體的血管通透性是否受到影響鸟召，從1 dpf開始對胚胎進(jìn)行熱應(yīng)激胆绊，并在3 dpf或4 dpf時向循環(huán)系統(tǒng)注射10 kDa的四甲基羅丹明異硫氰酸酯(TRITC)-葡聚糖。純合子col22al突變體顯示顱骨血管中微球和四乙基若丹明異硫氰酸鹽-葡聚糖滲漏增加(圖5K-P)欧募，表明染料外溢是由血管通透性增加引起的压状。

我們使用透射電子顯微鏡(TEM)分析了col22al突變體和野生型胚胎的血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)。根據(jù)透射電鏡分析槽片，血管內(nèi)皮細(xì)胞 col22a1突變的顱內(nèi)血管表現(xiàn)出高度不均勻和畸形外觀(圖5R,S)何缓。

我們通過共聚焦顯微鏡進(jìn)一步分析了進(jìn)入acta2:GFP轉(zhuǎn)基因系的col22突變體的壁細(xì)胞(平滑肌和周細(xì)胞)覆蓋率。在大多數(shù)col22al胚胎中还栓，壁細(xì)胞中acta2:GFP的表達(dá)沒有顯著變化(圖S3A,B)碌廓。此外，周細(xì)胞標(biāo)記物pdgfrb的表達(dá)在col22al突變胚中未受影響(圖S3C-H)剩盒。這些結(jié)果表明谷婆，出血和血管通透性缺陷不是由col22al突變體中壁細(xì)胞覆蓋不足引起的×闪模總的來說纪挎，我們的數(shù)據(jù)顯示Col22al在維持血管穩(wěn)定性方面起著關(guān)鍵作用。

圖5 純合子col22a1—突變胚胎顯示顱骨血管擴張和畸形跟匆，血管通透性增加异袄。(A-D) col22af突變體在3dpf和4dpf時血管模式不受影響÷瓯郏活體kdrl共聚焦最大強度投影:GFP胚胎烤蜕，背面視圖。前指頂部迹冤。(E-J) col22a1突變體血管擴張和畸形讽营，注意眼周區(qū)血管分支點的血管擴張和融合(箭頭)，以及擴張和畸形的腭腦靜脈(PLV泡徙，箭頭)橱鹏。高倍(40*)的PLV圖像如圖1和J所示。注意堪藐，PLV的一部分形成了一個神經(jīng)叢(箭頭莉兰，J)，這在WT胚胎中沒有觀察到礁竞√腔模活體kdrl:GFP胚胎切片共聚焦最大強度投影顯示，背面視圖苏章，前方為頂部。PLV、側(cè)背主動脈(LDA, E)和眼周分支點(星號枫绅，G)的橫截面在q中標(biāo)記了選擇測量直徑的血管泉孩。相同胚胎的不同z堆疊投影在E和G中，在F和H中顯示;I和J表示不同的胚胎并淋。(K-P)血管通透性微血管造影分析寓搬。將FluoSpheres聚苯乙烯微球(紅色，K,L)或低Mw (10 kDa) tritc -葡聚糖(紅色县耽，M-P)注射到kdrt: gfp陽性WT和col22a1-胚胎的循環(huán)系統(tǒng)中句喷。合并圖像的背側(cè)視圖(紅色，葡聚糖/微球;綠色兔毙，kdr:GFP)顯示在3 dpf和4 dpf時col22af-胚胎腦室和脈絡(luò)膜叢(虛線唾琼，N.P)和血管外微球積聚(虛線，K.L)澎剥。共聚焦z堆疊的最大強度投影圖锡溯。(Q)熱應(yīng)激col22af突變體和野生型(wt)胚胎在3dpf時的LDA血管直徑(E)、PLV和眼周分支點(星號哑姚，G)祭饭。在兩個獨立實驗中獲得的12個突變體和野生型胚胎的每個血管的三個隨機選擇的點進(jìn)行測量。在可能的情況下叙量，測量左右兩側(cè)的LDA和眼周血管倡蝙。LDA的總測點數(shù)n-57 (wt和突變體胚胎的sd分別為-1.9和2.5)。眼周血管的n= 54和57(變異胚的標(biāo)準(zhǔn)差分別為4.3和6.5)绞佩，PLV的n=36(變異胚的標(biāo)準(zhǔn)差分別為3.2和5.9)寺鸥。在所有胚胎的所有測點上，使用wt和col22a1胚胎之間的Student's t檢驗計算p值征炼。(R,S)顱內(nèi)血管內(nèi)皮的TEM分析析既。與WT胚胎(箭頭，R)的正常血管內(nèi)皮相比谆奥，col22af突變體的血管內(nèi)皮高度畸形(箭頭眼坏，S)。

家族性顱內(nèi)動脈瘤(FIA)研究中COL22A1突變體的鑒定

接下來酸些，我們想要研究人類個體中COL22Al的多態(tài)性是否與血管穩(wěn)定性缺陷有關(guān)宰译。在最近的FIA研究中，選擇了7個家庭和45個歐裔美國人進(jìn)行WES魄懂，以確定與IAs相關(guān)的變異沿侈。盡管該研究報告了68個通過多種選擇標(biāo)準(zhǔn)篩選和優(yōu)先排序后保留的變異，但在該研究中發(fā)現(xiàn)了多個其他被排除在最終列表之外的突變變異市栗。在這些變異中缀拭，在一個家族(家族D)的受影響成員的膠原XXII (COL22A1)蛋白編碼序列中發(fā)現(xiàn)了一個SNP rs142175725 G/T咳短，預(yù)計會導(dǎo)致E736D氨基酸替代(圖6A)。rs142175725在所有患病家庭成員中的分離度計算為1.11(等位基因頻率為0.0001264;次要等位基因頻率蛛淋，6.04×10-5)咙好。看到D家族所有成員攜帶SNP的隨機概率是5.17×10-8褐荷。雖然這個LOD評分還不夠高勾效，不足以明確地將SNP與IA表型聯(lián)系起來，但它仍然暗示了一種潛在的關(guān)聯(lián)叛甫。突變變體位于三螺旋結(jié)構(gòu)域层宫，該結(jié)構(gòu)域通常與單體膠原亞基的低聚化有關(guān)。谷氨酸E736在多個脊椎動物之間100%保守(圖6B;圖S4)其监，使用COL22A/位點內(nèi)外顯子特異性引物的多重PCR對460個不相關(guān)的家族性FIA樣本進(jìn)行靶向測序萌腿，鑒定出僅存在于受影響個體中但未發(fā)現(xiàn)的另外6個變體:在ExAC外顯子聚集聯(lián)盟(ExAC)非芬蘭歐洲人群中發(fā)現(xiàn)的頻率非常低(圖6B;表S2)。所有這些SNPs在多個哺乳動物生物之間都是100%保守的棠赛，其中3個在人類和斑馬魚之間是保守的(圖S4哮奇，數(shù)據(jù)未顯示)。此外睛约，根據(jù)polyphen2分析鼎俘，所有SNPs都被預(yù)測為“可能具有破壞性”，其中4個SNPs被SIFT預(yù)測為具有破壞性(表S2)辩涝。鑒定出的變體中有兩個在Gly-X-Y三螺旋重復(fù)序列中具有影響甘氨酸的突變(圖S4)贸伐。受影響的個體對所有這些變異都是雜合的，這表明這些SNPs可能具有顯性效應(yīng)怔揩。這些結(jié)果表明捉邢，COL22Al突變可能與IAs風(fēng)險增加有關(guān)。然后商膊，我們在斑馬魚模型中實驗測試了E736D突變變體是否影響COL22Al功能伏伐。

圖6 COL22A1 SNP變異的鑒定。(A) rs142175725 SNP預(yù)測會導(dǎo)致家族中受影響個體COL22A1分離中的E736D氨基酸替代晕拆。(B)預(yù)測CoL22A1的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和通過WES和靶向基因組測序鑒定的snp的特定氨基酸位置(紅色星號)藐翎。WWFA, von Willebrand因子;LamG，層粘連蛋白G实幕。

人E736D COL22A1變異體的可誘導(dǎo)過表達(dá)增加出血的發(fā)生率

全外顯子組測序結(jié)果顯示4例患者均為E736D雜合變異吝镣，符合顯性遺傳模式。因此昆庇，我們在斑馬魚胚胎中進(jìn)行了一項過表達(dá)實驗末贾，以檢驗E736D替換是否表現(xiàn)出顯性的有害影響。我們在熱休克誘導(dǎo)啟動子下將攜帶突變體或WT人COL22AI與自裂病毒肽2A和mCherry融合的構(gòu)建體注入單細(xì)胞期胚胎(圖S5A)整吆。在23 hpf下拱撵，對胚胎進(jìn)行熱休克辉川，然后在33.5°C下孵育，誘導(dǎo)熱應(yīng)激2天拴测。對注射的胚胎進(jìn)行熒光探針篩選员串，這是人類COL22A1過表達(dá)的指示性信號(圖S5B,C)，并通過o-二苯胺血紅素染色分析出血情況昼扛。在WT背景下，誘導(dǎo)過表達(dá)人類E736D COL22AI變體導(dǎo)致出血明顯更頻繁欲诺，類似于斑馬魚COL22AI突變胚胎(圖7A)抄谐。相比之下，與未注射的胚胎相比扰法，誘導(dǎo)人WT COL22AI表達(dá)并沒有引起胚胎出血百分比的顯著增加蛹含。

接下來，我們通過測試人類WT COL22Al和E736D突變體挽救熱應(yīng)激col22胚胎中出血表型的能力塞颁，評估了它們的功能活性浦箱。正如預(yù)期的那樣，WT人COL22A1的過表達(dá)部分挽救了突變胚胎的表型(圖7B)祠锣。相反酷窥，過度表達(dá)可誘導(dǎo)的人類E736D變體未能在注射的col22 -胚胎中挽救表型。這些實驗表明伴网，E736D變異導(dǎo)致無功能的COL22A1蛋白蓬推，并具有顯性效應(yīng)，干擾WT等位基因的功能澡腾。

E736D COL22A1變異通過上調(diào)mmp9的表達(dá)引起出血性事件

接下來沸伏，我們研究COL22A1缺乏如何介導(dǎo)出血性表型。先前的研究表明动分，金屬蛋白酶(MMPs)在IAs患者組織中的表達(dá)毅糟。我們采用實時熒光定量PCR (qPCR)檢測了熱休克人類E736D突變體和WT col22al過表達(dá)胚胎中mmp9和mmp13的表達(dá)變化。在3 dpf時澜公，當(dāng)出血通常很明顯時姆另，我們觀察到在短暫過表達(dá)的E736D COL22Al胚胎和具有穩(wěn)定hsp70:COL22A1整合的轉(zhuǎn)基因胚胎中mmp表達(dá)上調(diào)，而mmpl3表達(dá)保持不變(圖7C;圖S5D,E和未顯示的數(shù)據(jù))玛瘸，提示mmp9對斑馬魚IAs病理的潛在貢獻(xiàn)蜕青。為了檢驗抑制MMPs是否能緩解E736D col22al過表達(dá)胚胎的出血性表型，我們用化學(xué)MMP抑制劑GM6100處理注射的E736D胚胎糊渊。GM6100抑制MMP導(dǎo)致人類E736D col22a1過表達(dá)胚胎出血頻率顯著降低(圖7D)右核。總之渺绒，我們的研究結(jié)果提供了col22al依賴性出血表型可能通過上調(diào)mmp9表達(dá)介導(dǎo)的證據(jù)贺喝，并提示MMP抑制劑可能對COL22AI突變患者的臨床治療有效菱鸥。

圖7 E736D突變影響COL22A1功能，導(dǎo)致胚胎出血比例增加躏鱼。(A)在WT胚胎背景下氮采，人類COL22A1 E736D變異體的短暫過表達(dá)導(dǎo)致出血性表型。與未轉(zhuǎn)染的胚胎和WT hsp70:COL22A1質(zhì)粒dna注射的胚胎相比染苛，人E736D變異體hsp70:COL22A1 dna注射的胚胎在熱休克誘導(dǎo)COL22Af表達(dá)后出血比例更高鹊漠。(B)人類E736D CoL22A1構(gòu)建體未能挽救斑馬魚col22af突變表型。相反茶行，熱休克誘導(dǎo)的人WT coL22A1過表達(dá)部分地挽救了col22at突變體胚胎的出血性表型躯概。(C.D) MMP9介導(dǎo)E736D col22a1過表達(dá)胚胎的出血形成。(C) gPCR分析mmp9在未注射的對照胚胎畔师、注射了人WT和E736D hsp70:COL22A1構(gòu)建體的胚胎以及熱休克后穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因WT和E736D hsp70:COL22A1胚胎中的表達(dá)娶靡。過表達(dá)E736D col22af的轉(zhuǎn)基因胚胎中mmp9的表達(dá)增加。未轉(zhuǎn)染胚胎的表達(dá)水平歸一化為1看锉。(D) GM6001化學(xué)處理對MMPs的抑制可以挽救人E7360 hsp70: col22a1過表達(dá)胚胎的出血表型姿锭。與注射相同結(jié)構(gòu)的dmso處理胚胎相比，注射E736D hsp70:COL22A1 DNA結(jié)構(gòu)的gm6001處理胚胎中出血的胚胎百分比減少伯铣∩氪耍“Pc0.05;NS，不顯著;使用學(xué)生t檢驗確定腔寡。N趾诗，實驗中使用的胚胎數(shù)量。誤差條表示s.e蹬蚁。

E736D COL22A1變體刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激反應(yīng)

我們在細(xì)胞水平上探討了人類E736D變異是否對胚胎有害恃泪。我們將人WT或突變體COL22AI的mRNA注射到斑馬魚的單細(xì)胞階段中。注射突變體E736D mRNA會在胚胎原腸形成過程中引起嚴(yán)重缺陷犀斋，干擾49%的胚胎的表觀代謝運動贝乎。卵裂球中的細(xì)胞經(jīng)常與卵黃分離并裂解(圖8A,B)。這種表型僅在注射了E736D COL22A1 mRNA的胚胎中觀察到:在大多數(shù)胚胎中叽粹，過表達(dá)相同劑量的WT 人COL22A1 mRNA不會引起任何明顯的缺陷览效。為了確定這種表型的原因，我們通過對注射胚胎中的人COL22A1進(jìn)行免疫熒光染色來分析膠原分泌虫几。捕獲原腸胚期細(xì)胞的共聚焦圖像顯示锤灿，與分泌的WT形式相比，突變變體主要出現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)(圖8C-D)辆脸。這表明突變變體不能分泌到細(xì)胞外環(huán)境中但校。分泌失敗可能是由于蛋白質(zhì)錯誤折疊引起的，錯誤折疊蛋白質(zhì)的積累會導(dǎo)致ER應(yīng)激反應(yīng)啡氢。事實上状囱，qPCR顯示hsp5和bip標(biāo)記物的表達(dá)升高术裸，與ER應(yīng)激有關(guān)(圖8E)。我們進(jìn)一步分析了E736D突變體對體外ECM成分表達(dá)的影響亭枷，方法是將攜帶人類WT或帶有His/Mye標(biāo)記的E736D突變體COL22Al的DNA構(gòu)建物瞬時轉(zhuǎn)染人成纖維細(xì)胞袭艺。與瞬時轉(zhuǎn)染人WT COL22A1的細(xì)胞相比，E736D COL22A1突變構(gòu)建的細(xì)胞除了層粘合蛋白染色減少外叨粘，還顯示出更強烈的細(xì)胞內(nèi)COL22AI染色猾编，這表明有缺陷的COL22Al蛋白保留在細(xì)胞質(zhì)中(圖S6)。層粘連蛋白缺失可能是由于突變蛋白在細(xì)胞內(nèi)聚集升敲，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激袍镀，干擾其他ECM分子的合成和分泌。綜上所述冻晤，這些結(jié)果表明E736D COL22A1突變體可能會干擾蛋白質(zhì)折疊，從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞外基質(zhì)成分的錯誤表達(dá)绸吸，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡鼻弧。

圖8 人E736D COL22A1 mRNA的過表達(dá)導(dǎo)致原腸胚形成期間細(xì)胞脫離，而該蛋白保留在細(xì)胞質(zhì)中锦茁，導(dǎo)致ER應(yīng)激增加攘轩。(A.B)與人WT COL22A1 mrna注射的胚胎(A)相比，E736D COL22A1 mrna注射的胚胎(B)在原腸形成過程中細(xì)胞不能經(jīng)歷表皮代謝和脫離蛋黃码俩。(C-D”)人E736D COL22A1蛋白在原腸形成過程中保留在細(xì)胞質(zhì)中度帮，而WT COL22A1分泌到細(xì)胞外空間(箭頭)。共聚焦顯微鏡分析人COL22A1蛋白免疫熒光(綠色稿存，C,D)和phalloidin染色(紅色笨篷，C'，D)瓣履。藍(lán)色率翅，核DAPI染色。(E)細(xì)胞質(zhì)中人類突變體COL22A1的聚集誘導(dǎo)ER應(yīng)激袖迎。gPCR證實冕臭，人E736D COL 22A1 mrna注射的胚胎與人WT mrna注射的胚胎相比，ER應(yīng)激標(biāo)記hsp5和bip升高燕锥。未注射樣品中的表達(dá)歸一化為1辜贵。* P < 0.05。使用Student's I-test確定归形。誤差條表示s.d托慨。

討論

在這項研究中，我們已經(jīng)證明了Col22al ir在斑馬魚模型系統(tǒng)中維持血管穩(wěn)定性的功能作用暇榴。我們還發(fā)現(xiàn)了與受影響個體IAs相關(guān)的COL22A1突變變體榴芳。過表達(dá)分析表明嗡靡，E736D變體對Col22al功能有有害影響，并可能干擾蛋白質(zhì)折疊窟感√直耍總之，我們的研究結(jié)果表明柿祈，COL22A1突變可能是人類IAs的原因之一哈误。需要使用更大的患者樣本進(jìn)行進(jìn)一步的遺傳分析，以確認(rèn)COL22A/突變與顱內(nèi)動脈瘤的關(guān)聯(lián)躏嚎。

我們的研究結(jié)果表明蜜自，col22al在顱脈管系統(tǒng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞以及結(jié)締組織和顱面肌肉組織中表達(dá)。在斑馬魚和小鼠的血管周圍成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞中觀察到col22al的表達(dá)卢佣，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)水平較低重荠。基于單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析虚茶，在室管膜中也發(fā)現(xiàn)了小鼠胚胎中顯著的Col22al表達(dá)有趣的是戈鲁，斑馬魚Col22al表達(dá)與Krt18表達(dá)部分重疊，Krt18已知在大鼠室管膜細(xì)胞中表達(dá)嘹叫，這些數(shù)據(jù)表明斑馬魚和哺乳動物之間的許多Col22al表達(dá)域相似婆殿，Col22al功能很可能在進(jìn)化上也是保守的。

我們證明了col22純合子突變的成年人罩扇，而不是他們的雜合子兄弟姐妹婆芦，表現(xiàn)出出血的頻率增加。經(jīng)歷出血性表型的col22a1 -/-成年魚的百分比隨著年齡或心血管應(yīng)激而增加喂饥。此外消约，col22突變胚胎的出血比例增加，這可能是由于孵化溫度升高引起的心血管壓力所致员帮。雖然我們沒有在col22突變體中觀察到漿果樣動脈瘤荆陆，但它們表現(xiàn)出血管擴張，這在梭狀動脈瘤中很常見集侯。其中一些血管形狀不規(guī)則被啼。這些血管管腔增大，血管壁不規(guī)則且寬度可變棠枉。有趣的是浓体，TEM分析在col22突變胚胎中檢測到畸形的血管內(nèi)皮。雖然周細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞似乎沒有受到明顯影響辈讶，但col22al突變表型中的血管通透性缺陷可能是由ECM的結(jié)構(gòu)或組成改變引起的命浴。col22al突變表型的確切原因還需要進(jìn)一步研究。

先前的一項研究表明，斑馬魚胚胎中morpholino介導(dǎo)的col22功能基因敲低會導(dǎo)致肌腱連接缺陷生闲。在這里媳溺，我們沒有觀察到在遺傳col22al突變胚胎或成體中骨骼肌或肌腱連接有任何明顯缺陷。從免疫染色缺失可以明顯看出碍讯，col22al突變導(dǎo)致col22al蛋白完全或幾乎完全缺失悬蔽，這表明先前報道的表型可能是由morpholino脫靶效應(yīng)引起的。然而捉兴，最近有證據(jù)表明蝎困，遺傳補償發(fā)生在基因突變體中，而不是在變形體中倍啥。這也可以解釋col22al突變體中沒有缺陷肌肉的原因禾乘。相反，我們在純合子突變胚胎和成人中目睹了心血管應(yīng)激后腦血管完整性的喪失虽缕。

我們還證實了人類COL22A1家族E736D變體的表達(dá)干擾COL22A1功能并可導(dǎo)致細(xì)胞死亡始藕。此外，人類E736D COL22A1變異體的誘導(dǎo)過表達(dá)重現(xiàn)了COL22A1突變斑馬魚在3dpf時所見的出血表型氮趋。在早期發(fā)育和體外伍派，E736D COL22Al人變異體不能分泌，可能保留在細(xì)胞質(zhì)中凭峡。ER應(yīng)激標(biāo)記的表達(dá)增加表明E736D變異影響COL22Al蛋白折疊。錯誤折疊的蛋白質(zhì)可能在ER中積累决记，觸發(fā)錯誤折疊的蛋白質(zhì)反應(yīng)途徑摧冀，導(dǎo)致ER應(yīng)激升高。最終系宫，這可能導(dǎo)致其他ECM蛋白(如層粘連蛋白)的錯誤表達(dá)索昂，并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這解釋了早期E736D過表達(dá)是如何在原腸胚形成階段導(dǎo)致致死性表型的扩借。未來的研究將集中于確定CoL22Al如何介導(dǎo)動脈瘤的形成椒惨。

一些研究描述了MMP9在人類顱內(nèi)動脈瘤患者中的病理生理參與以及MMP9與膠原原纖維之間的關(guān)系。在斑馬魚胚胎中潮罪，我們證明了人類E736D COL22A1變異的過表達(dá)會導(dǎo)致mmp9上調(diào)康谆。這表明mmp9在COL22Al下游發(fā)揮作用，介導(dǎo)出血性表型嫉到。事實上沃暗，在抑制MMPs后，由人類CoL22Al突變體誘導(dǎo)過表達(dá)引起的出血性表型的頻率降低何恶。我們發(fā)現(xiàn)mmp9可以在col22al下游發(fā)揮作用孽锥，這與MMP9在小鼠顱內(nèi)動脈瘤形成中的作用一致。誘發(fā)高血壓的小鼠發(fā)生IA，血管壁或厚或薄惜辑，以及彈性層紊亂唬涧。目前，我們不知道在col22a1過表達(dá)的斑馬魚胚胎中是否存在高血壓盛撑，但記錄的表型類似于IA的典型特征碎节。后續(xù)的研究需要確定COL22A1和MMP9是否直接或間接相互作用影響疾病的病理。

結(jié)論

綜上所述撵彻，我們的研究結(jié)果認(rèn)為COL22AI具有維持血管穩(wěn)定性的功能钓株。他們進(jìn)一步提出，COL22A1的突變可能是人類顱內(nèi)動脈瘤的原因之一陌僵。有必要進(jìn)一步研究COL22Al變異在家族性和散發(fā)性IAs中的頻率轴合。未來的研究可以利用斑馬魚作為篩選化合物的模型系統(tǒng)，這些化合物可以減少出血頻率并促進(jìn)IAs新治療方法的開發(fā)碗短。

基金：資金這項工作得到了美國國立衛(wèi)生研究院的支持[R01HL134815 to S.S.;R15HDO84262 to P.J.L;F32HL124889至Q.V.T]和美國心臟協(xié)會[16GRNT27370004至S.S.]受葛。

文章原文：Disease Models & Mechanisms (2018) 11, dmm033654. doi:10.1242/dmm.033654

詳細(xì)網(wǎng)址：http://dmm.biologists.org/lookup/doi/10.1242/dmm.033654.

注：因文章篇幅有限，所有相關(guān)引用文獻(xiàn)偎谁，以及補充圖总滩、表可以點擊至原文查閱。