雜志：CARDIOVASCULAR RESEARCH

影響因子：10.8（2022）

年份：2023

通訊作者：Suphansa Sawamiphak

通訊作者單位：Max Delbrück Center (MDC), Robert-R?ssle-Str. 10, 13125 Berlin, Germany

DZHK (German Center for Cardiovascular Research), Partner Site Berlin,Gesch?ftsstellePotsdamer Str. 58, 10785 Berlin, Germany

摘要

目的：失調(diào)的免疫反應(yīng)導(dǎo)致控制高血壓和降低終末器官損傷風(fēng)險(xiǎn)的治療策略效率低下鲸沮。揭示從高血壓刺激開(kāi)始到多器官功能障礙表現(xiàn)的免疫途徑是免疫靶向治療急需的見(jiàn)解。

方法和結(jié)果：為了實(shí)現(xiàn)細(xì)胞事件協(xié)調(diào)多器官發(fā)病機(jī)制的可視化锅论，我們模擬了斑馬魚(yú)的心血管高血壓重構(gòu)讼溺。暴露于離子缺乏環(huán)境下的斑馬魚(yú)幼魚(yú)表現(xiàn)出血管緊張素原的快速上調(diào)，隨后出現(xiàn)動(dòng)脈高血壓和心臟重構(gòu)最易，這再現(xiàn)了射血分?jǐn)?shù)保持的早期心力衰竭的關(guān)鍵特征怒坯。在大腦中，延時(shí)成像顯示藻懒，在離子缺乏處理后敬肚，通過(guò)內(nèi)皮收縮和遷移發(fā)生腦血管衰退。這種現(xiàn)象與巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)內(nèi)皮接觸和內(nèi)皮連接收縮有關(guān)束析。細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)干擾素-γ和白細(xì)胞介素1β的系統(tǒng)上調(diào)艳馒，并揭示了巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄程序的改變，其特征是抑制先天免疫和血管/神經(jīng)保護(hù)基因的表達(dá)。壓力過(guò)負(fù)荷誘導(dǎo)的腦損傷的斑馬魚(yú)和小鼠模型都表明弄慰，腦病理和巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞表型的改變依賴(lài)于干擾素-γ信號(hào)傳導(dǎo)第美。在斑馬魚(yú)中，干擾素-γ受體1突變可阻止腦血管重構(gòu)和巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組譜的失調(diào)陆爽。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法中鑒定出骨形態(tài)發(fā)生蛋白5在離子缺乏處理時(shí)在巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞中的下調(diào)可以通過(guò)干擾素-γ阻斷挽救什往，減輕腦微血管丟失。在橫主動(dòng)脈收縮誘導(dǎo)的壓力過(guò)載的小鼠中慌闭，通常會(huì)發(fā)生腦血管損傷别威、神經(jīng)炎癥和認(rèn)知功能障礙，干擾素-γ中和保護(hù)它們免受血腦屏障破壞驴剔、腦血管稀疏和認(rèn)知功能下降省古。

關(guān)鍵詞：斑馬魚(yú)；高血壓布讹；舒張期功能障礙琳拭；血管衰退；炎癥描验；巨噬細(xì)胞白嘁；IFNγ；腦血管疾脖炝鳌絮缅；認(rèn)知損傷

引言

高血壓是最普遍的慢性疾病，也是一個(gè)主要的健康挑戰(zhàn)睡扬。雖然血壓升高是高血壓的主要診斷特征盟蚣，但其死亡率和殘疾是相關(guān)的心血管共病的結(jié)果，如心力衰竭卖怜、中風(fēng)屎开、慢性腎臟疾病和認(rèn)知功能障礙。目前的治療策略主要針對(duì)控制生理血壓的關(guān)鍵調(diào)控通路马靠、交感神經(jīng)系統(tǒng)和腎素（Ren）血管緊張素（Agt）系統(tǒng)奄抽。雖然這些藥物有助于原發(fā)性高血壓患者達(dá)到目標(biāo)血壓水平，但仍難以阻礙靶器官損傷的進(jìn)展甩鳄。對(duì)于腦血管的改變尤其如此逞度。同樣越來(lái)越清楚的是，即使在血壓水平可接受的受試者中妙啃，心血管事件的殘余風(fēng)險(xiǎn)升高也可能持續(xù)存在档泽，強(qiáng)調(diào)了其他疾病驅(qū)動(dòng)因素的存在俊戳。

系統(tǒng)性炎癥和免疫反應(yīng)性在高血壓和終末器官損傷的發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵貢獻(xiàn)是公認(rèn)的。不同類(lèi)型的先天和適應(yīng)性免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子馆匿，已被證明參與了高血壓的發(fā)病機(jī)制抑胎。然而，我們對(duì)這些免疫細(xì)胞的激活如何導(dǎo)致高血壓的發(fā)生和進(jìn)展的機(jī)制的理解仍然缺乏渐北。人們普遍認(rèn)為阿逃，先天免疫細(xì)胞作為高血壓刺激下炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)因子，在血管損傷中起著關(guān)鍵作用赃蛛。單核/巨噬細(xì)胞缺乏可減輕血管緊張素II（AngII）恃锉、醛固酮、和內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)阻力性動(dòng)脈和主動(dòng)脈血管功能障礙和氧化應(yīng)激的作用呕臂。同樣破托，在高血壓小鼠模型中，消融大腦血管周?chē)奘杉?xì)胞可以阻止大腦中動(dòng)脈和腦血管的結(jié)構(gòu)和功能重構(gòu)和腦血管氧化應(yīng)激诵闭。免疫細(xì)胞在高血壓中的有害作用并不僅僅依賴(lài)于促炎細(xì)胞因子或活性氧的產(chǎn)生炼团。研究表明澎嚣，醛固酮和鹽誘導(dǎo)高血壓后疏尿，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素（IL）10可促進(jìn)心臟纖維化和舒張功能障礙∫滋遥總的來(lái)說(shuō)，大量證據(jù)表明不同免疫細(xì)胞類(lèi)型與血管、心臟和大腦相互作用迎膜，這表明了一個(gè)總體假設(shè)袍辞，即失調(diào)的免疫細(xì)胞通過(guò)破壞這些器官的血壓調(diào)節(jié)功能來(lái)驅(qū)動(dòng)高血壓的發(fā)展。然而造寝，終末器官功能障礙可引起各種外周組織的炎癥磕洪，這表明復(fù)雜的免疫反應(yīng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)是高血壓的原因和后果。更好地了解不同免疫細(xì)胞亞群的位點(diǎn)特異性效應(yīng)诫龙，以及深入了解將高血壓信號(hào)傳遞給受影響器官的免疫通路的機(jī)制析显，是開(kāi)發(fā)免疫靶向策略來(lái)管理臨床高血壓的基礎(chǔ)。在這里签赃，我們解決了三個(gè)主要問(wèn)題：(i)免疫細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的血壓調(diào)節(jié)器官的不良重構(gòu)背后的細(xì)胞過(guò)程谷异；（ii）細(xì)胞事件的分子介質(zhì)；以及（iii）對(duì)已確定的免疫通路的操縱是否可以防止高血壓的發(fā)展和終末器官的病理重構(gòu)锦聊。通過(guò)引入離子差誘導(dǎo)的體液穩(wěn)態(tài)紊亂歹嘹，我們建立了斑馬魚(yú)作為一個(gè)新的模型，重現(xiàn)了人類(lèi)高血壓的多系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能重構(gòu)特征孔庭，比目前的嚙齒動(dòng)物模型需要更簡(jiǎn)單的操作和更短的治療時(shí)間尺上。重要的是，該模型不僅允許對(duì)高血壓的多系統(tǒng)表型進(jìn)行死后表征，而且還可以通過(guò)實(shí)時(shí)成像方法來(lái)追蹤致病進(jìn)展過(guò)程中的細(xì)胞行為怎抛。利用斑馬魚(yú)模型仰税，我們能夠發(fā)現(xiàn)細(xì)胞過(guò)程發(fā)生在從接觸離子不平衡刺激大腦病理的表現(xiàn)，即巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞接觸和內(nèi)皮連接中斷之前內(nèi)皮細(xì)胞遷移驅(qū)動(dòng)腦血管退化和增加大腦細(xì)胞死亡抽诉。在機(jī)制上陨簇，我們發(fā)現(xiàn)干擾素-γ（IFNγ）信號(hào)通路是系統(tǒng)性炎癥驅(qū)動(dòng)的動(dòng)脈功能障礙和離子失衡驅(qū)動(dòng)的大腦重構(gòu)的關(guān)鍵中介。在對(duì)離子缺乏暴露的反應(yīng)下迹淌，IFNγ信號(hào)下調(diào)巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞中的穩(wěn)態(tài)河绽、促血管生成和神經(jīng)保護(hù)因子。我們發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)因子唉窃，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）5耙饰，參與了IFNγ驅(qū)動(dòng)的致病途徑。最后纹份，在心臟壓力過(guò)載誘導(dǎo)的腦病理的小鼠模型中苟跪，我們提供了炎癥靶向治療的概念證明，該治療可以消除腦血管稀疏蔓涧、血腦屏障（BBB）和內(nèi)皮連接中斷和認(rèn)知功能障礙件已。

方法

動(dòng)物飼養(yǎng)和品系

本研究中使用的轉(zhuǎn)基因品系為T(mén)g（myl7：MKATE-CAAX）sd11,1、Tg（myl7：H2BGFP）zf521,2元暴、TgBAC（csf1ra：GAL4-VP16）i186,3篷扩、Tg（UAS-E1B：NTR-mCherry）c264,4、Tg（5xUAS：EGFP）zf82,5茉盏、Tg (kdrl：Hsa.HRAS-mCherry)s896,6, Tg (kdrl: EGFP)s843,7, ifngr1s986,8, Tg (ubb: NATC)bns98,8, Tg (fli1a:pecam1a-EGFP)ncv27,9, Tg (kdrl: HsHRASmCherry) s916,10, Tg (mpeg1:Gal4-VP16)gl24,11, Tg (UAS: Kaede)rk8,12.除非另有說(shuō)明鉴未，收集胚胎并在丹尼奧溶液（58 mM氯化鈉，0.7 mM氯化鉀鸠姨，0.4 mM硫酸鎂铜秆，0.6 mM Ca（NO3）2,5 mM HEPES在水中）中培養(yǎng)。在活體成像實(shí)驗(yàn)中讶迁，將苯硫脲（PTU）應(yīng)用于丹尼奧溶液中连茧，以阻斷皮膚色素沉著。

斑馬魚(yú)的飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行添瓷，符合機(jī)構(gòu)（馬克斯·德?tīng)柌剪斂朔肿俞t(yī)學(xué)中心）梅屉、國(guó)家（柏林實(shí)驗(yàn)室）和德國(guó)倫理和動(dòng)物福利指南，并得到柏林LAGeso公司的批準(zhǔn)鳞贷。所有實(shí)驗(yàn)均在受精后10天（dpf）的幼魚(yú)上進(jìn)行坯汤。用0.168 mg/ ml三卡因甲磺酸鹽（MS-222）麻醉對(duì)幼魚(yú)實(shí)施安樂(lè)死，然后浸泡在冰水中誘導(dǎo)低溫治療搀愧。

8周齡的C57Bl/6J小鼠從查爾斯里弗斯獲得惰聂，飼養(yǎng)在控制溫度和濕度（21±1°C疆偿，60±10%），12-12小時(shí)的光-暗循環(huán)搓幌。

離子缺乏處理

離子缺乏水是用去離子水將丹尼諾溶液稀釋750倍或1500倍杆故，制備出貧離子水。在Danieau溶液中培養(yǎng)至2 dpf的胚胎暴露于離子濃度逐漸降低溉愁，750倍稀釋2天处铛，然后稀釋1500倍，直到功能和表型評(píng)估拐揭。在對(duì)照組中撤蟆，魚(yú)被保存在丹尼奧的溶液中。

RAS的藥理抑制作用

本研究采用血管緊張素受體阻滯劑氯沙坦抑制RAS通路堂污。胚胎/幼魚(yú)分別用Danieau溶液作為對(duì)照或貧離子溶液處理家肯，直到7dpf。在早期藥物治療中盟猖，將2dpf魚(yú)用100μM氯沙坦和0.2% DMSO浸泡在貧離子溶液中讨衣，直到5 dpf。然后取出藥物式镐，將魚(yú)保存在含有0.2% DMSO的貧離子溶液中反镇，直到7 dpf。對(duì)于晚期藥物治療碟案，4 dpf魚(yú)在0.2% DMSO的離子差溶液中培養(yǎng)2天愿险，用100μM氯沙坦和0.2% DMSO在離子差溶液中浸泡至7 dpf颇蜡。對(duì)照組魚(yú)在含有0.2% DMSO的丹尼奧緩沖液中飼養(yǎng)价说。

心臟收縮力測(cè)量

5 dpf或7 dpf幼魚(yú)包埋在1%低熔點(diǎn)瓊脂糖中。用配有40X物鏡和高速攝像機(jī)（Ximea）的透射光學(xué)顯微鏡對(duì)心室和背主動(dòng)脈節(jié)段進(jìn)行成像风秤。6-10秒長(zhǎng)的電影以每秒300幀的速度獲得鳖目。舒張期速度和收縮期速度、縮短分?jǐn)?shù)（FS）缤弦、射血分?jǐn)?shù)（EF）和流速的計(jì)算方法如前所述8领迈。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在斐濟(jì)13測(cè)量了舒張和收縮期末期的心室面積碍沐，并以面積隨時(shí)間的變化計(jì)算為舒張或收縮期速度狸捅。使用斐濟(jì)軟件測(cè)量舒張末期（寬度和長(zhǎng)度VD）和收縮期（寬度和長(zhǎng)度VS）的心室寬度和長(zhǎng)度。然后累提，將舒張末期的心室容積（容積VD）和收縮期（容積VS）分別計(jì)算為[π x長(zhǎng)度VDx widthVD2）/6]和[π x長(zhǎng)度VSx widthVS2）/6]尘喝。EF的計(jì)算方法為[100x（volumeVD-volumeVS）/volumeVD]。FS的計(jì)算方法為[100x（寬度VD-寬度VS）/寬度VD]斋陪。為了計(jì)算血液速度朽褪，我們使用Fiji (http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Velocity_Measurement_Tool)的速度測(cè)量工具生成了背主動(dòng)脈內(nèi)血細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的波動(dòng)圖置吓。接下來(lái)，使用Matlab代碼從脈波圖中計(jì)算出最大和最小速度.

診斷

小鼠用氯胺酮/噻嗪混合物（90/10 mg/kg）麻醉缔赠。如前所述衍锚，在左頸動(dòng)脈和無(wú)名干之間進(jìn)行主動(dòng)脈收縮，以誘導(dǎo)慢性壓力過(guò)載嗤堰，如前所述戴质。假手術(shù)小鼠進(jìn)行了同樣的實(shí)驗(yàn)程序，但沒(méi)有進(jìn)行主動(dòng)脈結(jié)扎踢匣。

心臟回波描記術(shù)

采用配備40 MHz和15 MHz換能器的Vevo2100 (Visualsonics, Fujifilm)對(duì)小鼠進(jìn)行超聲分析置森。小鼠用異氟醚麻醉(3.5%誘導(dǎo)，0.5%-1%維持符糊，補(bǔ)充1 L/ min氧氣)凫海，固定在加熱墊上保持體溫恒定并監(jiān)測(cè)生理參數(shù)。胸部和頸部被刮平男娄，用40 MHz換能器從胸骨旁短軸投影進(jìn)行心臟成像行贪。m型圖像應(yīng)用Teicholz公式評(píng)估左心室心功能。心尖室圖像用于評(píng)估舒張功能模闲。主動(dòng)脈弓成像采用15mhz換能器建瘫，通過(guò)超聲多普勒評(píng)估主動(dòng)脈橫縮(TAC)結(jié)扎的跨狹窄梯度。

抗ifng抗體和rhBMP-5注射

對(duì)于斑馬魚(yú)處理尸折，將抗Ifng（Abcam啰脚，ab211784）和抗v5（ThermoFisher，R960-25）用去離子水稀釋至150μg/ml（ThermoFisher实夹，R0581）橄浓。重組人BMP-5(研發(fā)生物技術(shù)，Cat亮航。編號(hào)：615-BMC-020/CF)在去離子水中稀釋至200ng/μl荸实。用三卡因（0.168 mg/ml）麻醉3 dpf或5 dpf幼魚(yú)，將1-2 nl抗體溶液注射到心包囊或靜脈竇缴淋。注射等量的V5抗體或載體作為對(duì)照准给。注射后，用新鮮的丹尼奧溶液或離子差溶液改變魚(yú)的培養(yǎng)基重抖。

小鼠被隨機(jī)分配露氮，并接受抗Ifng（BioCell，BE0055）治療或非相關(guān)IgG（BioCell钟沛，BE0088）治療作為對(duì)照畔规。從TAC后1周開(kāi)始，每隔3天腹腔注射200μg抗IFNg或非相關(guān)IgG讹剔，體積為75μL的生理溶液.

免疫熒光和TUNEL染色

幼魚(yú)麻醉油讯，用4% PFA + 0.3% triton在4°C下固定過(guò)夜详民，然后如前所述處理17。一抗為雞抗GFP（A10262陌兑；1：500）沈跨，大鼠抗m櫻桃（11217,1：500），兔抗zap70（細(xì)胞信號(hào)兔综，99F2饿凛；1：100）。二抗為Alexa Fluor 488山羊抗雞（福爾软驰，A11039涧窒；1：300)，Alexa Fluor 555山羊抗大鼠（細(xì)胞信號(hào)锭亏，4417S纠吴；1：400)，Alexa Fluor 647驢抗兔（福爾慧瘤，A-31573戴已；1：400)。根據(jù)制造商的協(xié)議锅减，使用tdt介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞死亡糖儡，使用Click-iT TUNEL Alexa Fluor 647試劑盒（Invitrogen，C10247）怔匣。

小鼠用氯胺酮/噻嗪（混合物90/10mg/kg）麻醉握联，經(jīng)心臟灌注40 mL生理鹽水，然后用40 mL 4%多聚甲醛麻醉每瞒。大腦被移除金闽，在4°C下用4%福爾馬林固定4小時(shí)，然后在4°C的20%蔗糖溶液中冷凍保護(hù)過(guò)夜独泞，如前所述18,19呐矾。用低溫恒溫器（徠卡CM 1950，徠卡）切割30個(gè)μm的切片懦砂，并在防凍液中自由漂浮保存。切片用0.3- 0.5%的Triton X-100（Sigma）在PBS中滲透30 min组橄，然后在用10%的驢血清（載體實(shí)驗(yàn)室）和0.3- 0.5%的Triton X-100在PBS中制備的封閉溶液中孵育120 min荞膘。一抗CD31（BD制藥蛋白，550274玉工；1：50)抗PDGFRb（研發(fā)羽资，AF1042；1：50)遵班、抗VE鈣粘蛋白（BD藥物屠升，555289潮改；1：50）和抗克勞丁蛋白5（抗體35-2500；1：100）在4°C的阻斷溶液中孵育過(guò)夜腹暖。第二天汇在，切片在PBS中洗滌三次，然后與以下二抗孵育：AlexaFluor488（杰克遜免疫搜索脏答，712-545-153糕殉；1：200）和Cy3（杰克遜免疫搜索，705-165-147殖告；1：200）用含5%驢血清和0.3% Triton的PBS稀釋阿蝶。對(duì)于RAGE/CD31染色，切片用5%的驢血清（載體實(shí)驗(yàn)室）和0.3%的Triton X-100（Sigma）在PBS中阻斷120 min黄绩，然后用抗CD31（BD制藥羡洁，550274：1：50）一抗在4°C下孵育過(guò)夜，用于觀察微血管爽丹。第二天焚廊，切片用PBS洗滌3次，用PBS稀釋的二抗Cy3（Jackson免疫搜索习劫，712-165-153咆瘟；1：200）孵育。隨后诽里，使用M.O.M.基本免疫檢測(cè)試劑盒（載體實(shí)驗(yàn)室袒餐，BMK-2202）對(duì)晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）進(jìn)行染色（Santa Cruz，sc-74473谤狡；1：200）灸眼。使用鏈霉親和素Alexa Fluor488偶聯(lián)物（Invitrogen，S32354墓懂；1：200）作為二抗焰宣。最后，切片用DAPI溶液1 mg/mL（62248捕仔；1：2000）匕积，安裝DABCO（西格瑪）和可視化蔡司780共聚焦激光掃描顯微鏡20×/0.50米27或40×/1.30M27油浸目標(biāo)（卡爾蔡司微成像公司），使用405納米二極管激光激發(fā)DAPI榜跌，488納米氬激光激發(fā)AlexaFluor488,543納米HeNe激光激發(fā)Cy3闪唆。

毛細(xì)血管密度和直徑的分析通過(guò)血管分析插件在斐濟(jì)20。包含血管的圖像通道被轉(zhuǎn)換為灰度钓葫、二值化和骨架化悄蕾。毛細(xì)血管密度計(jì)算為每個(gè)視場(chǎng)CD31標(biāo)記陽(yáng)性像素的百分比，毛細(xì)血管直徑計(jì)算為來(lái)自整個(gè)視場(chǎng)的骨骼化圖像的平均直徑础浮。周細(xì)胞覆蓋率是指每個(gè)視野的周細(xì)胞體或過(guò)程覆蓋的毛細(xì)血管的百分比帆调。兩種分析均采用從以Bregma -1.46mm為中心的不同切片中捕獲的5個(gè)視野奠骄。

延時(shí)顯微鏡

4 dpf幼魚(yú)用三卡因（0.168 mg/ml）麻醉，包埋在1%低熔瓊脂糖中番刊。然后含鳞，盤(pán)子里裝滿(mǎn)了丹尼奧的緩沖液和三卡因（0.168 mg/ml）。使用20X水浸物鏡撵枢，每40 min 16小時(shí)獲得大腦共聚焦z堆民晒。為了評(píng)估巨噬細(xì)胞的覆蓋和連接覆蓋，斑馬魚(yú)幼魚(yú)的大腦使用蔡司LSM880 Airy掃描倒置共聚焦顯微鏡進(jìn)行實(shí)時(shí)成像锄禽，該顯微鏡配備了25倍油（NA = 0.8）物鏡潜必。每20-30 min獲得一幀。

圖像分析

使用Imaris軟件（牛津儀器公司）對(duì)心肌細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行定量沃但。使用ImageJ中的Volumest插件計(jì)算心室體積磁滚。使用ImageJ中的分割編輯器插件對(duì)心肌細(xì)胞體積進(jìn)行定量。為了分離單個(gè)心肌細(xì)胞宵晚，使用了膜和核制造器垂攘。

用ImageJ對(duì)腦血管面積進(jìn)行量化，然后歸一化為腦實(shí)質(zhì)總面積淤刃，計(jì)算血管密度晒他。使用Imaris表面繪制法測(cè)量軀干和腦血管體積。用ImageJ計(jì)算全身和腦實(shí)質(zhì)中死亡細(xì)胞逸贾、小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞的數(shù)量陨仅。

在4.5-5 dpf時(shí)，對(duì)中腦和后腦區(qū)域（中央動(dòng)脈）的微血管系統(tǒng)進(jìn)行巨噬細(xì)胞覆蓋和連接覆蓋的分析铝侵。共焦圖像使用斐濟(jì)/ImageJ軟件進(jìn)行分析灼伤。使用OMERO軟件（https://www.openmicroscopy.org/omero/）進(jìn)行數(shù)據(jù)存儲(chǔ)和數(shù)據(jù)可視化。對(duì)每個(gè)幼魚(yú)大腦的巨噬細(xì)胞覆蓋率進(jìn)行3次定量（3次技術(shù)重復(fù)次）咪鲜，并分析并繪制每種條件下的重復(fù)平均值狐赡。每個(gè)血管段的連接覆蓋被量化為某一血管段區(qū)域連接面積的一小部分。取每個(gè)幼魚(yú)所有血管段的定量平均值疟丙，并繪制每種條件下的定量圖颖侄。

通過(guò)計(jì)數(shù)ImageJ中的收縮血管，從4 dpf斑馬魚(yú)大腦16小時(shí)的延時(shí)圖像中量化有和不有巨噬細(xì)胞接觸的回歸事件隆敢。利用ImageJ21中的斑馬魚(yú)血管定量（ZVQ）工作流程发皿，根據(jù)直徑小于5μm、6-15μm到超過(guò)15μm之間進(jìn)行血管分類(lèi)拂蝎。該工作流程測(cè)量了整個(gè)血管床的直徑。然后對(duì)血管直徑進(jìn)行分類(lèi)惶室，并以所有測(cè)量值的百分比計(jì)算每類(lèi)血管的百分比温自。

小鼠灌注毛細(xì)血管的分析

將熒光素偶聯(lián)的巨型葡聚糖（200000萬(wàn)達(dá)a玄货，0.1毫升10 mg/ml）和四甲基羅丹明右旋糖酐（40000萬(wàn)達(dá)a，0.1毫升10 mg/ml）的混合物經(jīng)左股靜脈灌注20分鐘悼泌。小鼠立即被宰殺松捉，大腦在4°C下的4%福爾馬林中固定過(guò)夜，然后在20%的蔗糖中冷凍保護(hù)馆里，如前所述18,19隘世。使用低溫恒溫器（徠卡CM 1950，徠卡）收集了30微米的切片鸠踪，并保持自由漂浮丙者。使用DAPI（Invitrogen，62248营密；1：2000）觀察細(xì)胞核械媒，用蔡司780共聚焦激光掃描顯微鏡和蔡司EC平面新熒光20×/0.50M27成像，并對(duì)cd31染色的毛細(xì)血管進(jìn)行分析评汰。兩項(xiàng)分析均使用了從以Bregma -1.46mm為中心的不同切片中捕獲的5個(gè)視野纷捞。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）

大約50只幼魚(yú)被聚集在一起，在TRIzol（生命技術(shù)公司被去，15596026）中快速冷凍主儡，并在-80℃下保存直到使用。在離子差處理后1惨缆、2糜值、3d的3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，用TRIzol從整個(gè)幼魚(yú)中分離出總RNA踪央。使用上標(biāo)III第一鏈試劑盒（生命技術(shù)公司臀玄，18080051），使用3-4μg的RNA進(jìn)行cDNA合成畅蹂。qRT-PCR使用Luna通用qPCR主混合物（新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室健无，M3003）進(jìn)行，并在StepOnePlus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（應(yīng)用生物系統(tǒng)）上運(yùn)行液斜。樣品采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析累贤。用管家基因gapdh進(jìn)行歸一化處理。所使用的引物列表見(jiàn)表S1少漆。

熒光激活細(xì)胞分選（FACS）

來(lái)自csf1ra：GAL4臼膏；UAS：NTR-m幼魚(yú)的細(xì)胞在0.26單位/ml自由酶-TL（默克化學(xué)公司，5401020001）中分離示损，含有1倍F- 68多元醇（費(fèi)舍爾科學(xué)渗磅，11495005）。幼魚(yú)在37℃的溶液中保存20-30分鐘，并通過(guò)移液間歇混合始鱼。用1%的BSA在HBSS溶液中停止解離仔掸。然后，樣品用0.05% BSA在HBSS溶液中洗滌并重懸医清。樣品通過(guò)40μm的過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾起暮，然后用FACSAriaII機(jī)器（BD生物科學(xué)公司）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)。巨噬細(xì)胞和非巨噬細(xì)胞根據(jù)巨噬細(xì)胞特異性的mCherry信號(hào)來(lái)區(qū)分巨噬細(xì)胞会烙。收集的細(xì)胞旋轉(zhuǎn)下來(lái)负懦，在-80℃下保存在TRIzol（生命技術(shù)，15596026）中柏腻，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)纸厉。

RNA測(cè)序

使用TRIzol（Life技術(shù)公司，15596026）從facs分類(lèi)的巨噬細(xì)胞中提取總RNA葫盼，并進(jìn)行下一代測(cè)序（Genewitz）残腌。使用SMART-Seq HT試劑盒（TaKaRa，634455）制備了與illumina兼容的測(cè)序文庫(kù)贫导。在驗(yàn)證了足夠的濃度和適當(dāng)?shù)钠未笮『笈酌ǎ褂肐llumina HiSeq（2x150 bp）配置對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，每個(gè)通道的數(shù)據(jù)輸出約為350M的對(duì)端讀取孩灯。使用Trimmomatic v.0.36對(duì)序列讀取序列進(jìn)行裁剪闺金，以去除可能的適配器序列和質(zhì)量較差的核苷酸。使用卡利斯托（v0.46.1）對(duì)斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)錄組（GRCz11峰档，Ensembl）進(jìn)行偽定位和獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄本計(jì)數(shù)败匹。使用Tximport（v1.22.0）將轉(zhuǎn)錄本水平計(jì)數(shù)匯總為基因計(jì)數(shù)，并保持計(jì)數(shù)超過(guò)10個(gè)計(jì)數(shù)的基因讥巡。為了從批處理效應(yīng)和其他可能的來(lái)源中去除不必要的變化掀亩，我們使用ruv校正的計(jì)數(shù)（k=3）進(jìn)行進(jìn)一步分析（RUVseq v1.28.0）。采用DESeq2（v1.34.0）比較對(duì)照組和離子差處理組之間的差異基因表達(dá)欢顷。使用Wald檢驗(yàn)來(lái)生成p值和log2倍的變化槽棍。調(diào)整后p值<為0.05和絕對(duì)log2倍變化>1的基因被認(rèn)為是差異表達(dá)基因。

行為分析

Morris水迷宮測(cè)試是在一個(gè)專(zhuān)用的房間里進(jìn)行的抬驴，該房間配有一個(gè)直徑120厘米炼七、深度60厘米的樹(shù)脂圓形池，里面裝滿(mǎn)了以26±1°C加熱至40厘米高的水布持。在距離泳池邊緣30厘米的地方豌拙，放置一個(gè)直徑為8厘米的塑料透明平臺(tái)。整個(gè)過(guò)程包括5天：視覺(jué)試驗(yàn)（第1天）题暖、采集試驗(yàn)（第2-4天）按傅、探針試驗(yàn)（第5天）捉超。在測(cè)試的視覺(jué)階段（第1天），水保持透明逞敷，以使平臺(tái)可視化狂秦。然后灌侣，在采集（第2天至第4天）和探測(cè)（第5天）階段推捐，對(duì)水進(jìn)行混濁，以掩蓋平臺(tái)的位置侧啼。所有實(shí)驗(yàn)均在上午9點(diǎn)到下午3點(diǎn)之間進(jìn)行牛柒。每次試驗(yàn)將小鼠的釋放點(diǎn)隨機(jī)分配在4個(gè)對(duì)稱(chēng)位置。視覺(jué)試驗(yàn)允許驗(yàn)證每個(gè)動(dòng)物都能夠識(shí)別由視覺(jué)線(xiàn)索識(shí)別的平臺(tái)位置痊乾。采集階段包括連續(xù)三天皮壁，每天進(jìn)行4次試驗(yàn)，允許小鼠在游泳池中自由游泳哪审，直到找到平臺(tái)或最長(zhǎng)時(shí)間為一分鐘蛾魄。當(dāng)老鼠找不到平臺(tái)時(shí)，它們會(huì)被引導(dǎo)到平臺(tái)湿滓，并允許在平臺(tái)上休息10秒鐘滴须。探針試驗(yàn)包括移除平臺(tái)，允許老鼠在游泳池中自由游泳一分鐘叽奥，記錄在每個(gè)象限中花費(fèi)的時(shí)間扔水。游泳路徑由視頻跟蹤系統(tǒng)視覺(jué)視覺(jué)15（Noldus，荷蘭）記錄并自動(dòng)分析朝氓。

統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示魔市。采用qRT-PCR數(shù)據(jù)的單樣本學(xué)生t檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并使用本賈米尼-霍赫伯格程序?qū)Χ嘀乇容^進(jìn)行校正赵哲。有或不存在巨噬細(xì)胞接觸和血管類(lèi)別的回歸事件采用雙向方差分析待德，并采用Bonferroni方法進(jìn)行校正。采用Tukey校正的雙向方差分析方法分析Morris水迷宮的毛細(xì)血管密度枫夺、毛細(xì)血管直徑将宪、血管周細(xì)胞覆蓋率、目視和探針試驗(yàn)筷屡。采用重復(fù)測(cè)量的雙因素方差分析涧偷，并對(duì)多個(gè)比較進(jìn)行Tukey校正，以檢驗(yàn)組間在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的差異(Morris水迷宮獲取試驗(yàn)毙死，縱向超聲心動(dòng)圖分析)燎潮。所有其他數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)顯著性采用雙尾Student 's t檢驗(yàn)。如果進(jìn)行多重比較扼倘，則使用Holm-Bonferroni方法調(diào)整p值确封。p & lt;0.05為顯著性除呵。除另有說(shuō)明外，n為實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物數(shù)爪喘。

結(jié)果

為了便于檢查協(xié)調(diào)高血壓發(fā)病和相關(guān)心血管并發(fā)癥的細(xì)胞和分子機(jī)制颜曾，我們建立了一個(gè)斑馬魚(yú)模型，能夠以最小的操作捕獲高血壓和相關(guān)器官損傷的特征秉剑。與其他高血壓模型相比泛豪，我們的方法有三個(gè)主要優(yōu)勢(shì)。首先侦鹏，它依賴(lài)于對(duì)環(huán)境線(xiàn)索的系統(tǒng)適應(yīng)诡曙，而不像在人類(lèi)高血壓中發(fā)現(xiàn)的那樣，需要基因或手術(shù)操作略水。第二价卤，處理時(shí)間很短。第三渊涝，在幼魚(yú)階段使用斑馬魚(yú)允許使用實(shí)時(shí)成像方法來(lái)發(fā)現(xiàn)病理背后的細(xì)胞機(jī)制慎璧。從2 dpf開(kāi)始，胚胎在去離子水稀釋的丹尼奧緩沖液中飼養(yǎng)跨释，濃度稀釋至1：750胸私，直到4dpf（圖1A）。2天后煤傍，濃度降低到1：1500盖文，幼魚(yú)進(jìn)一步處理至7dpf（圖1A）。

為了檢測(cè)離子缺乏處理是否會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈壓升高蚯姆，我們測(cè)量了背大動(dòng)脈的血流速度五续。在患者研究中，不同動(dòng)脈血管床的流速降低與血壓升高密切相關(guān)龄恋。因此疙驾，我們觀察到背主動(dòng)脈舒張末期收縮期峰值速度（圖1B和C）顯著降低，以及在較小程度上的收縮期峰值速度（圖1B和D）郭毕，表明動(dòng)脈壓和/或阻力增加它碎。動(dòng)脈阻力指數(shù)是高血壓患者中與動(dòng)脈硬化相關(guān)的血管阻力和順應(yīng)性改變的指示參數(shù)，在離子缺乏治療的幼魚(yú)中也升高（圖1E）显押。

RAS失調(diào)介導(dǎo)離子失衡誘導(dǎo)的動(dòng)脈功能障礙

RAS是血壓調(diào)節(jié)和電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵控制系統(tǒng)扳肛，是高血壓發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)。因此乘碑，我們接下來(lái)通過(guò)描述明顯癥狀出現(xiàn)前Agt和Ren誘導(dǎo)的時(shí)間線(xiàn)和關(guān)系挖息，來(lái)研究RAS失調(diào)是否參與了離子缺乏誘導(dǎo)的血管反應(yīng)。為此兽肤，我們通過(guò)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）評(píng)估了在致病級(jí)聯(lián)（2-5dpf）啟動(dòng)期間暴露于離子缺乏處理的幼魚(yú)中這兩個(gè)基因的時(shí)間過(guò)程表達(dá)套腹。在離子缺乏處理2天后绪抛，agt信使RNA水平顯著升高，而ren的表達(dá)水平在此階段沒(méi)有變化（圖1F）电禀。處理3天agt表達(dá)進(jìn)一步升高幢码，ren也升高（圖1F）。此外尖飞，我們還研究了RAS拮抗作用對(duì)動(dòng)脈血流變化的影響症副。氯沙坦，一種競(jìng)爭(zhēng)的Ang II受體1型拮抗劑（圖1G）葫松，確實(shí)減弱了刺激對(duì)舒張期測(cè)量的動(dòng)脈血流速度降低和動(dòng)脈阻力指數(shù)升高的影響（圖1H-K）瓦糕。我們還研究了在離子缺乏暴露期間，在4-7dpf的晚期使用氯沙坦的影響（圖1G）腋么。有趣的是，這種晚期干預(yù)并不能減輕離子不良治療引起的動(dòng)脈壓/抵抗表型（圖1H-K）亥揖。

總之珊擂，這些數(shù)據(jù)突出了新的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮诓东@人類(lèi)高血壓的表型和分子特征方面的有用性。此外费变，這些發(fā)現(xiàn)表明摧扇，離子缺乏誘導(dǎo)的離子穩(wěn)態(tài)破壞最初通過(guò)RAS失調(diào)導(dǎo)致動(dòng)脈高血壓的表型表現(xiàn)。阻斷RAS激活可以阻止發(fā)病途徑的早期發(fā)展挚歧。然而扛稽，一個(gè)或多個(gè)額外的疾病驅(qū)動(dòng)因素可能隨后參與致病級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使RAS拮抗作用在后期無(wú)效滑负。

圖1 暴露于離子缺乏處理會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)幼魚(yú)動(dòng)脈高血壓的特征在张。A，對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的5天低滲處理范式的示意圖矮慕。B帮匾，線(xiàn)形圖描繪了一個(gè)有代表性的對(duì)照組和一個(gè)離子缺乏處理的幼魚(yú)隨時(shí)間變化的血液流動(dòng)速度。C-E痴鳄，柱狀圖顯示瘟斜，與對(duì)照組相比，離子處理不良的幼魚(yú)的舒張末期速度(C)收縮速度峰值(D)和較高的動(dòng)脈阻力指數(shù)痪寻。(E)或11只幼魚(yú)螺句。F，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)離子差處理第1橡类、2和3天的agt和ren mRNA水平蛇尚，結(jié)果顯示agt表達(dá)的進(jìn)行性誘導(dǎo)。在第3天也可檢測(cè)到ren的誘導(dǎo)猫态。G佣蓉，RAS拮抗劑氯沙坦的早期和晚期治療示意圖豁陆。H，線(xiàn)形圖顯示惨好，在具有代表性的對(duì)照埠巨、離子差處理、離子差處理虾标、早期氯沙坦處理和晚期氯沙坦處理的幼魚(yú)中寓盗，氯沙坦早期處理減輕了離子差誘導(dǎo)的血流速度降低。I-K璧函，柱狀圖顯示早期而非晚期氯沙坦治療對(duì)降低離子不良處理的幼魚(yú)舒張期末速度(J)和增加動(dòng)脈阻力指數(shù)(K)的有效性傀蚌。峰值收縮期速度似乎不受兩種治療時(shí)間的影響(I)。柱狀圖中的結(jié)果以mean±S.E.M.表示蘸吓。單個(gè)的數(shù)據(jù)點(diǎn)也顯示為點(diǎn)圖善炫。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, n.s.不具有顯著性，t檢驗(yàn)库继。對(duì)P值進(jìn)行了多重比較的調(diào)整箩艺。

接下來(lái)，我們研究了離子缺乏誘導(dǎo)的高動(dòng)脈壓是否足以驅(qū)動(dòng)最常與高血壓相關(guān)的心血管并發(fā)癥宪萄。事實(shí)上艺谆，在5天的離子缺乏處理后，幼魚(yú)表現(xiàn)出心室舒張能力的下降拜英，這可以通過(guò)舒張期心室壁的運(yùn)動(dòng)較慢得到證明（圖2A和B）静汤。相反，這些心臟的收縮期速度沒(méi)有改變(圖2C）居凶。未受損的射血分?jǐn)?shù)（圖2D)和縮短分?jǐn)?shù)（圖2E)也顯示了收縮功能的保留虫给。

心臟的功能損傷是心肌形態(tài)學(xué)重構(gòu)適應(yīng)不良的結(jié)果。為了研究離子缺乏誘導(dǎo)動(dòng)脈高血壓可能導(dǎo)致心肌細(xì)胞的細(xì)胞改變排监，我們將離子缺乏處理模式應(yīng)用于myl7：H2B-GFP狰右；myl7：mKATE-CAAX轉(zhuǎn)基因幼魚(yú)，心肌細(xì)胞核和質(zhì)膜分別用H2B-GFP和mKATE-CAAX熒光標(biāo)記舆床。對(duì)心肌細(xì)胞大小的分析顯示棋蚌，缺乏離子處理的心室細(xì)胞體積增加（圖2F和G），表明肥大生長(zhǎng)挨队。心肌細(xì)胞死亡常與心臟病有關(guān)谷暮，在一定程度上可發(fā)生在肥厚的心臟。因此盛垦，我們研究了心肌細(xì)胞數(shù)量的減少是否可能導(dǎo)致機(jī)械舒張的功能障礙湿弦。然而，缺乏離子處理的心室包含的心肌細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相似（圖2H和I）腾夯。心室體積也不受影響（圖2J和K）颊埃，提示同軸肥大的建立蔬充。與動(dòng)脈血流變化不同，在離子缺乏誘導(dǎo)的RAS激活的早期或晚期阻斷RAS（圖1G和F）并不能防止心肌舒張功能障礙（圖2L）班利。這些結(jié)果表明饥漫，獨(dú)立于RAS的離子不良治療導(dǎo)致心室舒張功能障礙，與心肌細(xì)胞的適應(yīng)性肥厚重構(gòu)相關(guān)罗标，而沒(méi)有心肌細(xì)胞死亡庸队，類(lèi)似于保留射血分?jǐn)?shù)（HFpEF）的早期心力衰竭的某些功能和形態(tài)學(xué)特征。

圖2 離子失衡斑馬魚(yú)模型中RAS非依賴(lài)性心室舒張功能失調(diào)重構(gòu)闯割。A彻消，折形圖，描述對(duì)照組和離子缺乏處理幼魚(yú)心室面積隨時(shí)間變化的曲線(xiàn)圖宙拉。B-E宾尚，柱狀圖顯示在斑馬魚(yú)幼魚(yú)中暴露于5天的離子缺乏處理舒張期心室壁速度降低（B，對(duì)照=9幼魚(yú)鼓黔，不良=9幼魚(yú)）央勒，但收縮功能不受影響。F澳化，在5天的離子缺乏處理后，心室壁致密層的心肌細(xì)胞增大稳吮，質(zhì)膜上用mKATE-CAAX標(biāo)記缎谷。星號(hào)表示單個(gè)心肌細(xì)胞。G灶似，柱狀圖顯示了對(duì)照組和離子缺乏處理組心肌細(xì)胞體積列林。H，Tg（myl7：H2B-GFP）幼魚(yú)心臟在對(duì)照組條件下和離子缺乏條件下飼養(yǎng)5天酪惭。心肌細(xì)胞可通過(guò)細(xì)胞核H2B-GFP的存在來(lái)檢測(cè)到希痴。I，柱狀圖顯示了對(duì)照組和離子缺乏處理組心室中心肌細(xì)胞的數(shù)量相當(dāng)春感。J砌创，Tg（myl：mKATE-CAAX）心室的3D投影在離子不良治療5天后顯示大小不變。K鲫懒，柱狀圖顯示對(duì)照組和離子缺乏處理組的心室體積嫩实。L，柱狀圖顯示窥岩，在離子缺乏治療的早期或晚期甲献，當(dāng)氯沙坦阻斷RAS活性時(shí)，舒張功能障礙的程度相似颂翼。柱狀圖中的結(jié)果以mean±S.E.M.表示晃洒。單個(gè)的數(shù)據(jù)點(diǎn)也顯示在柱狀圖的頂部慨灭。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, n.s.不具有顯著性，t檢驗(yàn)球及。對(duì)P值進(jìn)行了多重比較的調(diào)整氧骤。

腦血管衰退，血管相關(guān)巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞增加桶略，以及離子失衡導(dǎo)致腦細(xì)胞死亡

在驗(yàn)證了心血管表型的存在和高血壓關(guān)鍵分子標(biāo)志物的升高后语淘，我們接下來(lái)研究了斑馬魚(yú)模型中靶器官不良重構(gòu)和免疫細(xì)胞參與的細(xì)胞過(guò)程。血管損傷作為浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的主要接觸部位际歼，常被認(rèn)為是全身炎癥與高血壓的發(fā)展及其相關(guān)靶器官損傷之間的機(jī)制聯(lián)系惶翻。因此，我們繼續(xù)研究了內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)離子失衡的反應(yīng)以及與免疫細(xì)胞的相互作用鹅心，特別是在之前被證明在RAS誘導(dǎo)的血管損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用吕粗。我們首先評(píng)估了包括大動(dòng)脈和靜脈、背主動(dòng)脈和主脈組成的主干血管床旭愧，它們分支成喂養(yǎng)骨骼肌和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的小血管網(wǎng)絡(luò)颅筋。kdrl：HRAS-mCherry（內(nèi)皮細(xì)胞被膜定位的哈維大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物（HRAS）標(biāo)記的mCherry熒光標(biāo)記）轉(zhuǎn)基因幼魚(yú)的全貼成像顯示，在離子差處理3天后输枯，血管網(wǎng)絡(luò)沒(méi)有明顯的形態(tài)學(xué)改變议泵。血管密度，以總組織體積的百分比來(lái)測(cè)量桃熄，在離子缺乏者和對(duì)照組中也具有可比性先口。相比之下，離子缺乏組的血管密度在大腦中明顯降低（圖3A和B）瞳收。血管稀疏發(fā)生在整個(gè)大腦深度（圖3B）碉京，通過(guò)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶2’-脫氧尿苷，5’-三磷酸（dUTP）缺口末端標(biāo)記（TUNEL）檢測(cè)螟深，與實(shí)質(zhì)細(xì)胞死亡增加相關(guān)谐宙，（圖3A和C）。內(nèi)皮細(xì)胞的死亡沒(méi)有明顯增加（圖3D）界弧，提示細(xì)胞凋亡可能不是離子失衡驅(qū)動(dòng)的腦血管稀疏的主要機(jī)制凡蜻。隨后，在處理5天后夹纫，也可以檢測(cè)到腦容量的減少（圖3E）咽瓷。

在不同血管床的發(fā)育重構(gòu)過(guò)程中，觀察到涉及內(nèi)皮細(xì)胞遷移和重新融入縮回血管段的血管退化舰讹，而不依賴(lài)于內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡茅姜。以前尚不清楚這一細(xì)胞過(guò)程是否參與了高血壓對(duì)腦血管的重構(gòu)。kdrl：HRAS-mCherry；csf1ra：GAL4钻洒；UAS：EGFP轉(zhuǎn)基因幼魚(yú)的延時(shí)成像奋姿，其中內(nèi)皮細(xì)胞（kdrl+）和巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞（csf1ra+）分別用mCherry和EGFP熒光標(biāo)記，顯示在對(duì)照條件下飼養(yǎng)的斑馬魚(yú)幼魚(yú)主要穩(wěn)定的腦血管網(wǎng)絡(luò)（圖3F)素标。在4.5-5dpf時(shí)称诗，經(jīng)過(guò)2天后的離子差處理，我們捕獲了來(lái)自同一血管段的內(nèi)皮細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過(guò)程头遭，它們相互收縮和遷移寓免，導(dǎo)致血管段的退化（圖3F)。此外计维，在離子缺乏處理組中袜香，大量位于血管附近的csf1ra +細(xì)胞僅沿著血管碎片移動(dòng)（圖3G和H）。相比之下鲫惶，實(shí)質(zhì)csf1ra +細(xì)胞數(shù)量保持不變（圖3G和I）蜈首，表明巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞與血管之間的相互作用增強(qiáng)，但腦實(shí)質(zhì)中所有髓系細(xì)胞沒(méi)有擴(kuò)張欠母。

總之欢策，致病途徑由離子缺乏誘導(dǎo)RAS上調(diào)不僅觸發(fā)重構(gòu)心血管系統(tǒng)，而且大腦通過(guò)一系列免疫和非免疫細(xì)胞的細(xì)胞反應(yīng)赏淌，即增加巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞與腦血管踩寇，內(nèi)皮遷移介導(dǎo)的血管退化，和腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞死亡的聯(lián)系六水。有趣的是姑荷，離子缺乏誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞退化主要影響微血管（直徑≤為5μm），而不是較大的微血管(圖3J）缩擂。此外，延長(zhǎng)離子缺乏處理第8天顯示腦血管稀疏進(jìn)展添寺，血管密度進(jìn)一步降低胯盯，但沒(méi)有明顯的形態(tài)學(xué)異常，除了原始腎计露，前腎博脑。因此，由離子失衡引發(fā)的全系統(tǒng)反應(yīng)再現(xiàn)了血管票罐、心臟叉趣、大腦和腎臟的損傷，這些都是人類(lèi)高血壓的主要靶器官该押。

圖3 離子失衡驅(qū)動(dòng)的腦血管退化和腦細(xì)胞死亡與巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞接觸增加和內(nèi)皮間連接重構(gòu)相關(guān)疗杉。A，高血壓腦的結(jié)構(gòu)重構(gòu)蚕礼。對(duì)5 dpf Tg（kdrl：HRAS-mCherry）幼魚(yú)暴露于低離子處理3天后的腦血管形態(tài)和細(xì)胞死亡（TUNEL+）進(jìn)行了評(píng)估烟具。4’梢什，6-二氨基-2-苯林多爾(DAPI，藍(lán)色）標(biāo)記了組織中的所有細(xì)胞核朝聋。B嗡午，線(xiàn)形圖描繪了3天離子缺乏誘導(dǎo)的血管密度降低（以總組織面積的百分比表示）。C-E冀痕，柱狀圖顯示在離子缺乏處理3天時(shí)腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞死亡增加（C）但腦血管中沒(méi)有（D）荔睹，并隨后在處理第5天，和對(duì)照組相比言蛇，腦容量減少（E）僻他。F，kdrl：HRAS-mCherry猜极；csf1ra：GAL4中姜；UAS：EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)的延時(shí)成像，以追蹤缺乏離子的處理和對(duì)照組的內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞行為的動(dòng)態(tài)變化跟伏。圓圈標(biāo)記了在時(shí)間序列的過(guò)程中內(nèi)皮細(xì)胞收縮的位置丢胚。G，Csf1ra +巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞（csf1ra：GAL4受扳；UAS：NTR-mCherry）直接接觸和/或定位在靠近血管系統(tǒng)（kdrl：EGFP）携龟，或在2天的動(dòng)物中遠(yuǎn)離腦實(shí)質(zhì)的血管。H勘高，柱狀圖顯示高血壓反應(yīng)后與血管相關(guān)的Csf1ra +細(xì)胞數(shù)量更多峡蟋。I，柱狀圖顯示了離子缺乏處理和對(duì)照組的實(shí)質(zhì)Csf1ra +細(xì)胞數(shù)量华望。J-L蕊蝗，柱狀圖顯示微血管采樣頻率的降低(J)導(dǎo)致由內(nèi)皮細(xì)胞退化(K)增加和與離子不良治療后巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞接觸相關(guān)的衰退保護(hù)(L)的損失相關(guān)。M和N赖舟，離子缺乏處理后內(nèi)皮連接中斷蓬戚。通過(guò)血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子（PECAM）-EGFP的表達(dá)(M)可以觀察到，內(nèi)皮連接的完整性降低宾抓，表示為每個(gè)血管面積的連接覆蓋率的百分比(N)子漩。O，顯示了內(nèi)皮細(xì)胞和塌陷血管中的巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞之間的細(xì)胞相互作用石洗。轉(zhuǎn)基因株系mpeg：GAL4-VP16幢泼；UAS：Kaede；kdrl：HsHRAS-mcherry讲衫；fli1a：pecam1a-EGFP可以顯示巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞缕棵、內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮連接。P，柱狀圖顯示挥吵，與對(duì)照組相比重父，離子缺乏處理的幼魚(yú)中健康血管的巨噬細(xì)胞覆蓋率較低，而塌陷血管的覆蓋率較高忽匈。Q房午，圖像描繪了巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞在重排之前的接觸，通過(guò)PECAM-EGFP表達(dá)可視化丹允。數(shù)據(jù)顯示為mean±S.E.M.而單個(gè)的數(shù)據(jù)點(diǎn)被疊加到柱狀圖上郭厌。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, n.s.不顯著，t檢驗(yàn)或雙倍方差分析(B).對(duì)P值進(jìn)行了多重比較的調(diào)整雕蔽。

內(nèi)皮-巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞相互作用和離子失衡誘導(dǎo)的腦血管收縮中的內(nèi)皮連接中斷

接下來(lái)折柠，我們旨在進(jìn)一步了解在離子缺乏處理的動(dòng)物中觀察到的腦血管退化的細(xì)胞機(jī)制。令人驚訝的是批狐，雖然對(duì)巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞-內(nèi)皮相互作用與血管衰退之間的關(guān)系的分析顯示扇售，與對(duì)照組相比，離子缺乏處理細(xì)胞的衰退更頻繁（圖3K）嚣艇，在對(duì)照條件下承冰，與巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞的接觸與較少的衰退事件相關(guān)（圖3L），這暗示了先天免疫細(xì)胞的保護(hù)作用食零。據(jù)報(bào)道困乒，血管周?chē)木奘杉?xì)胞有助于增加血腦屏障的通透性，這與高血壓患者內(nèi)皮緊密連接復(fù)雜性的降低有關(guān)贰谣。為了評(píng)估低離子的處理是否會(huì)影響腦微血管中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)娜搂，我們測(cè)量了連接覆蓋范圍，作為處理過(guò)和未處理過(guò)的幼魚(yú)的細(xì)胞接觸面積的估計(jì)值吱抚。使用轉(zhuǎn)基因報(bào)告細(xì)胞系fli1a：pecam1a-EGFP定位血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1（Pecam1）百宇，觀察細(xì)胞間連接，顯示在離子缺乏處理后秘豹，沿腦血管網(wǎng)絡(luò)的連接覆蓋率減少（圖3M和N）恳谎。為了闡明巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)皮連接重塑和衰退中的作用，我們通過(guò)mpeg：GAL4-VP16憋肖；UAS：Kaede；kdr細(xì)胞/m EGFP轉(zhuǎn)基因系婚苹，通過(guò)Kae細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞和EGFP的表達(dá)分別觀察巨噬細(xì)胞岸更、內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮連接（圖3O）。除了捕獲收縮前的內(nèi)皮-巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用和血管節(jié)段的重建(圖3O）膊升，我們的分析顯示怎炊，離子缺乏處理改變了巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞沿血管網(wǎng)絡(luò)的分布。在對(duì)照條件下，大多數(shù)與血管相關(guān)的巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞與灌注/充氣的血管相接觸评肆。只有少數(shù)巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞與衰退事件相關(guān)债查，而衰退事件是血管床生理成熟的一部分（圖3P）。離子缺乏處理對(duì)灌注血管中巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞的覆蓋沒(méi)有重大影響瓜挽，但增強(qiáng)了它們與塌陷血管的相互作用（圖3P）盹廷。總的來(lái)說(shuō)久橙，通過(guò)對(duì)巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞行為的延時(shí)追蹤俄占，不僅揭示了離子失衡在這些細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)相互作用中的作用，而且還揭示了巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞血管保護(hù)功能的改變可能導(dǎo)致微血管收縮的細(xì)胞機(jī)制淆衷。此外缸榄，我們對(duì)連接動(dòng)力學(xué)的觀察表明，有一種細(xì)胞機(jī)制祝拯，這與之前關(guān)于血管修剪的體內(nèi)研究一致甚带。

離子失衡上調(diào)促炎細(xì)胞因子Ifnγ和IL1β，并通過(guò)Ifnγ信號(hào)通路扭曲巨噬細(xì)胞組織穩(wěn)態(tài)/神經(jīng)保護(hù)表型

為了解決炎癥作為隨后離子失衡信號(hào)驅(qū)動(dòng)導(dǎo)致RAS失調(diào)的作用佳头，并確定介導(dǎo)其對(duì)靶器官損傷作用的免疫途徑鹰贵，我們首先探討了心血管表型的發(fā)展與通常與高血壓和HFpEF相關(guān)的炎癥標(biāo)志物的表達(dá)水平之間的時(shí)間關(guān)系。在離子缺乏處理的第1天畜晰，qRT-PCR顯示砾莱，與對(duì)照組相比，候選細(xì)胞因子的表達(dá)沒(méi)有改變（圖4A）凄鼻。處理2天后腊瑟，兩種細(xì)胞因子ifng和il1b的表達(dá)水平有細(xì)微增加（約1.5倍），但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4B）块蚌。處理第3天的后續(xù)評(píng)估顯示闰非，ifng和il1b mRNA的上調(diào)分別超過(guò)2倍和8倍（圖4C）。這兩種促炎細(xì)胞因子的升高表明峭范，可能是由RAS失調(diào)引起的系統(tǒng)性炎癥财松，有助于離子缺乏誘導(dǎo)的致病途徑。

IFNγ是一個(gè)巨噬細(xì)胞亞群激活的基準(zhǔn)刺激纱控，在促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和殺微生物活性方面作用更強(qiáng)辆毡。IL1β是IFNγ引導(dǎo)巨噬細(xì)胞上調(diào)的關(guān)鍵細(xì)胞因子之一。我們假設(shè)甜害，由于Ifnγ升高導(dǎo)致的表型改變舶掖，從而導(dǎo)致巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞血管保護(hù)功能的紊亂，有助于腦血管退化和腦細(xì)胞死亡尔店。為了解決這一假設(shè)眨攘，并了解下游信號(hào)傳導(dǎo)主慰，我們把從對(duì)照和離子缺乏csf1ra：GAL4；UAS：NTR-mcherry幼魚(yú)通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選（FACS）分離的單核/巨噬細(xì)胞進(jìn)行RNA-Seq檢測(cè)鲫售，經(jīng)過(guò)3天離子缺乏暴露和心包內(nèi)注射對(duì)照V5或抗Ifnγ抗體以阻斷干擾素受體（Ifngr）1的激活（圖4D）共螺。比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示，不僅先天免疫功能的破壞情竹，而且在離子不平衡時(shí)維持的幾個(gè)關(guān)鍵介質(zhì)的表達(dá)減弱（圖4E和F）藐不。具體來(lái)說(shuō)，離子差處理的巨噬細(xì)胞下調(diào)了補(bǔ)體系統(tǒng)調(diào)節(jié)因子H相關(guān)5（cfhl5）和殺菌和先天免疫效應(yīng)肽自然殺傷（NK）-lysin (nkl3和nkl4)（圖4E和F）鲤妥。參與抗炎反應(yīng)和炎癥消退的不同酶的表達(dá)佳吞，如A分解素和金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域10b（adam10b）、組氨酸氨解酶（hal）和賴(lài)氨酸去甲基化酶5A（kdm5a）的表達(dá)也減少了（圖4E和F）棉安。有趣的是底扳，我們觀察到暴露于分泌因子和細(xì)胞表面受體的離子失衡轉(zhuǎn)錄抑制，包括bmp5贡耽、核結(jié)合素2a（nucb2a）和叢狀蛋白D1（plxnd1）（圖4E和F）衷模，據(jù)報(bào)道在不同的病理環(huán)境下在神經(jīng)元和血管穩(wěn)態(tài)和損傷預(yù)防中發(fā)揮重要作用。重要的是蒲赂，抗Ifnγ介導(dǎo)的內(nèi)在細(xì)胞因子信號(hào)的抑制抑制了離子缺乏驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄程序的激活（圖4E和G）阱冶，表明Ifnγ信號(hào)是離子失衡反應(yīng)中巨噬細(xì)胞表型改變的關(guān)鍵中介。從我們的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析中滥嘴，我們還注意到木蹬，與其同源受體ifngr1不同，ifnγ在巨噬細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)若皱。IFNγ是T細(xì)胞中與高血壓反應(yīng)相關(guān)的標(biāo)志性細(xì)胞因子镊叁。有趣的是，離子缺乏處理的魚(yú)走触，顯示在大腦附近有T細(xì)胞的積累晦譬，這在對(duì)照組動(dòng)物中很少觀察到，表明這些細(xì)胞參與了巨噬細(xì)胞的失調(diào)互广。

圖4 以高血壓刺激下巨噬細(xì)胞中ifng和il1b上調(diào)和Ifnγ信號(hào)依賴(lài)性的神經(jīng)保護(hù)和穩(wěn)態(tài)基因表達(dá)下調(diào)為特征的系統(tǒng)性炎癥敛腌。A，在離子缺乏治療的第1天惫皱，高血壓和HFpEF中細(xì)胞因子的表達(dá)未發(fā)生改變像樊。B和C，離子缺乏處理2天和3天后檢測(cè)到促炎/Th1細(xì)胞因子ifng和il1b mRNA水平的進(jìn)行性升高旅敷。D凶硅，從注射抗v5的對(duì)照組（對(duì)照），注射抗v5的離子缺乏處理3天幼魚(yú)扫皱，和注射抗Ifnγ（離子差+抗Ifnγ）離子缺乏處理3天幼魚(yú)中通過(guò)FACS分離巨噬細(xì)胞足绅，然后進(jìn)行RNA-Seq檢測(cè)。E韩脑，描述對(duì)照組氢妈、高血壓組和抗ifng處理的高血壓巨噬細(xì)胞中差異表達(dá)基因（調(diào)整后的P-value<0.05）的熱圖。F和G段多，火山圖顯示首量，與對(duì)照巨噬細(xì)胞(F)和離子缺乏處理的巨噬細(xì)胞相比，離子缺乏的+抗Ifnγ基因上調(diào)（正Log2倍變化）和下調(diào)（負(fù)Log2倍變化）进苍〖釉担灰點(diǎn)表示沒(méi)有差異表達(dá)的基因。（D-G）中的數(shù)據(jù)來(lái)自每組3個(gè)生物副本觉啊。

Ifnγ信號(hào)傳導(dǎo)是離子失衡驅(qū)動(dòng)的腦血管退化的基礎(chǔ)

接下來(lái)拣宏，我們利用遺傳功能缺失模型研究了Ifnγ信號(hào)在不平衡腦血管重構(gòu)中可能的因果作用：斑馬魚(yú)幼魚(yú)在編碼ifngr1的基因中存在無(wú)義突變。在沒(méi)有離子失衡刺激的情況下杠人，ifngr1^?/?幼魚(yú)表現(xiàn)出與對(duì)照組（ifngr1^+/+）相當(dāng)?shù)哪X血管形態(tài)和密度（圖5A和B）勋乾。相比之下，暴露于缺乏離子的介質(zhì)中會(huì)導(dǎo)致處理后3天大腦中測(cè)量的血管密度降低（圖5A和B）嗡善。Ifngr1缺失保護(hù)腦血管免受離子缺乏介導(dǎo)的退化（圖5A和B）辑莫，表明Ifnγ信號(hào)在腦血管系統(tǒng)對(duì)離子失衡的致病反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。因此罩引，我們繼續(xù)探討了該細(xì)胞因子是否可能代表了一種能夠預(yù)防和/或減輕表型表現(xiàn)進(jìn)展后的終末器官損傷的治療靶點(diǎn)各吨。

為此，我們?cè)趧?dòng)脈高血壓和腦血管稀疏化（治療3天）后連續(xù)5天的離子不良暴露期間袁铐，給予單劑量心包內(nèi)注射抗Ifnγ抗體揭蜒。抗Ifnγ處理模式能夠減輕腦血管的稀疏性（圖5C和D）昭躺。有趣的是忌锯，晚期抗Ifnγ抗體治療也減輕了離子不良誘導(dǎo)的收縮期和舒張期動(dòng)脈血流速度的降低（圖5E-G）。然而领炫，通過(guò)舒張期的心室壁速度測(cè)量偶垮，治療并沒(méi)有恢復(fù)舒張功能障礙（圖5H）。

綜上所述帝洪，這些發(fā)現(xiàn)揭示了炎癥驅(qū)動(dòng)的高血壓發(fā)病機(jī)制似舵，其中Ifnγ的異常產(chǎn)生驅(qū)動(dòng)腦重構(gòu)，以腦血管退化和腦細(xì)胞死亡增加為特征葱峡。干擾Ifnγ通路的激活可減輕血管損傷和動(dòng)脈高血壓砚哗，但不足以阻止心臟重構(gòu)的進(jìn)展。

補(bǔ)充BMP5可防止離子失衡驅(qū)動(dòng)的腦血管稀疏

巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組改變和功能失調(diào)砰奕，從離子失衡挑戰(zhàn)下的接觸相關(guān)內(nèi)皮退化可以證明蛛芥，表明Ifnγ介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞旁分泌信號(hào)通路的損傷可能是介導(dǎo)腦血管重構(gòu)的潛在機(jī)制提鸟。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞中Ifnγ介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄下調(diào)的下游靶點(diǎn)仅淑，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析確定称勋，BMP5，是離子失衡驅(qū)動(dòng)的腦血管稀疏的重要調(diào)節(jié)因子涯竟。為期兩天的治療斑馬魚(yú)幼魚(yú)重組人BMP5開(kāi)始離子暴露的第二天防止腦血管稀疏赡鲜，如圖所示的保護(hù)整體血管覆蓋腦實(shí)質(zhì)（圖5J）和微血管的血管網(wǎng)絡(luò)（圖5K）。因此庐船，我們的發(fā)現(xiàn)提供了進(jìn)一步的機(jī)制银酬，離子失衡引發(fā)的炎癥途徑驅(qū)動(dòng)腦損傷，其中巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞中bmp5信號(hào)下調(diào)筐钟，導(dǎo)致這些細(xì)胞血管穩(wěn)態(tài)功能的損害揩瞪，從而破壞內(nèi)皮細(xì)胞間連接和收縮。

圖5 Ifnγ及其下游信號(hào)靶點(diǎn)Bmp5調(diào)節(jié)血管對(duì)離子失衡的高血壓刺激的反應(yīng)盗棵。A壮韭，5dpf ifngr1-/-和對(duì)照野生型Tg（kdrl：HRAS-mCherry）幼魚(yú)暴露于或不接受離子缺乏處理3天的腦血管系統(tǒng)的代表性圖像。B纹因，柱狀圖顯示野生型對(duì)照喷屋、ifngr1-/-、離子處理野生型和離子處理ifngr1-/-魚(yú)的血管體積（占總組織體積的百分比）瞭恰。C屯曹，Tg（kdrl：HRAS-mCherry）幼魚(yú)暴露于或不受到低離子處理5天的腦血管系統(tǒng)。在離子缺乏治療的第3天出現(xiàn)腦血管稀疏后惊畏，單次劑量的anti-Ifnγ部分恢復(fù)了表型恶耽，在治療的第5天測(cè)量了表型。D颜启，柱狀圖顯示對(duì)照抗體（抗v5）注射（對(duì)照）偷俭、注射抗Ifnγ、離子缺乏處理注射抗v5（離子缺乏處理）和離子缺乏處理的抗Ifnγ注射樣品的血管體積（以總組織體積的百分比表示）缰盏。E涌萤，具有代表性的抗v5注射（對(duì)照）、抗Ifnγ注射口猜、抗v5注射離子（離子差）處理和抗Ifnγ注射離子差處理的幼魚(yú)的血流速度線(xiàn)形圖负溪。F，顯示舒張末期速度改善的柱狀圖济炎。G川抡，抗Ifnγ給藥后的收縮期峰值速度。H须尚，抗Ifnγ治療沒(méi)有改變心室舒張功能障礙崖堤。I-K侍咱，人重組BMP5治療可防止離子不良誘導(dǎo)高血壓的腦血管消退。Tg（kdrl：HRAS-mCherry）幼魚(yú)在第二天開(kāi)始用BMP5處理2天(I)密幔，與用載體處理的貧離子暴露同胞相比放坏，表現(xiàn)出密度(J)和微血管采樣頻率(K)的增加。圖表示mean±S.E.M.個(gè)別的數(shù)據(jù)點(diǎn)也被顯示出來(lái)老玛，并疊加在柱狀圖上。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, n.s.不顯著性钧敞，t檢驗(yàn)蜡豹，或雙向方差分析(J)。對(duì)P值進(jìn)行了多重比較的調(diào)整溉苛。

抗ifn - γ治療可阻止壓力過(guò)載小鼠的皮質(zhì)毛細(xì)血管稀疏和血腦屏障破壞

接下來(lái)镜廉，我們進(jìn)一步研究了斑馬魚(yú)中發(fā)現(xiàn)的IFNγ信號(hào)在哺乳動(dòng)物大腦高血壓損傷中的作用，并在哺乳動(dòng)物模型中評(píng)估了抗IFNγ治療在緩解人類(lèi)高血壓相關(guān)的不良腦血管重構(gòu)和認(rèn)知障礙方面的功效愚战。為此娇唯，我們使用了橫主動(dòng)脈收縮（TAC）模型，其中局部收縮期高血壓導(dǎo)致腦實(shí)質(zhì)微血管損傷寂玲，學(xué)習(xí)和空間記憶減少塔插。我們對(duì)C57Bl/6J小鼠進(jìn)行TAC治療4周，并通過(guò)超聲心動(dòng)圖監(jiān)測(cè)高血壓心臟重構(gòu)的進(jìn)展拓哟。TAC誘導(dǎo)了進(jìn)行性心臟重構(gòu)想许，其特征是向心性肥大和舒張功能障礙，但沒(méi)有收縮功能的喪失断序，在離子缺乏處理的斑馬魚(yú)中觀察到的鏡像表型流纹，類(lèi)似于HFpEF的典型條件。在TAC小鼠和對(duì)照組小鼠中均未觀察到抗IFNγ治療的影響违诗。

對(duì)大腦皮層切片進(jìn)行的體外免疫組化（圖6A）顯示了神經(jīng)血管單位的明顯損傷模式漱凝。腦毛細(xì)血管的結(jié)構(gòu)分析顯示，與相對(duì)假血壓正常的對(duì)照組相比诸迟，TAC-IgG高血壓小鼠明顯毛細(xì)血管稀少茸炒，分化簇31（CD31）標(biāo)記的血管密度降低（圖6B和C），同時(shí)保持正常直徑（圖6D）亮蒋。此外扣典，TAC-IgG小鼠顯示周細(xì)胞的毛細(xì)血管覆蓋顯著減少（圖6E和F），這是神經(jīng)血管單位完整性的典型標(biāo)志慎玖。有趣的是贮尖，抗IFNγ治療挽救了在TAC小鼠中觀察到的腦血管缺陷，顯示出正常的毛細(xì)血管密度（圖6B和C）和周細(xì)胞覆蓋（圖6E和F）趁怔。

為了研究高血壓對(duì)大腦微循環(huán)功能特性的影響湿硝，我們給TAC高血壓小鼠和正常血壓對(duì)照組注入不同分子量的右旋糖酐薪前，然后剔除小鼠進(jìn)行腦組織學(xué)分析。通過(guò)使用高分子量右旋糖酐（2 000 000 Da）（圖6G）关斜，我們分析了灌注毛細(xì)血管的密度示括，進(jìn)一步證實(shí)了與假對(duì)照組相比，TAC誘導(dǎo)了顯著的降低（圖6H）痢畜。用抗IFNγ抗體處理的TAC小鼠沒(méi)有出現(xiàn)毛細(xì)血管稀疏化（圖6H）垛膝。此外，聯(lián)合使用低分子量右旋糖酐（40 000 Da）（圖6G）丁稀，使我們能夠評(píng)估通過(guò)血腦屏障的外滲吼拥。通常，40 kDa的右旋糖酐被完整的血腦屏障保留线衫，但它能滲透受損和滲漏的血腦屏障凿可。如圖6G-I所示，TAC-IgG小鼠的毛細(xì)血管很少授账，說(shuō)明它們不能保留低分子量葡聚糖枯跑，說(shuō)明血腦屏障完整性降低。重要的是白热，用中和性抗IFNγ抗體處理的TAC小鼠顯示出完整的血腦屏障敛助，與假血壓正常的小鼠相當(dāng)。高血壓患者的血腦屏障功能障礙被歸因于Ang II誘導(dǎo)的緊密連接重構(gòu)和胞吞作用的增加棘捣。事實(shí)上辜腺，內(nèi)皮連接復(fù)合體的關(guān)鍵成分空洞內(nèi)皮（VE）鈣粘蛋白和Claudin5在TAC小鼠的大腦皮層中均下調(diào)（圖7A-C），表明血管連接重構(gòu)乍恐。IFNγ中和有效地挽救了這些蛋白的表達(dá)（圖7A-C）评疗。此外，anti-IFNγ治療減少了上調(diào)的受體晚期糖基化最終產(chǎn)物（憤怒）茵烈，主要外排轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)節(jié)胞吞循環(huán)淀粉樣蛋白-β（Aβ）在BBB52（圖7d和E）百匆，暗示其潛在，除了連接穩(wěn)定呜投，抑制經(jīng)血管運(yùn)輸?shù)碾倪M(jìn)入大腦加匈，高血壓認(rèn)知障礙和癡呆的主要原因。

綜上所述仑荐，這些數(shù)據(jù)表明雕拼，IFNγ信號(hào)通路介導(dǎo)了壓力過(guò)載誘導(dǎo)的血腦屏障破壞、毛細(xì)血管稀疏和周細(xì)胞覆蓋范圍的喪失粘招。中和過(guò)度的IFNγ激活可以減輕這些表型啥寇，保護(hù)小鼠免受腦血管損傷。

圖 6 IFNγ抑制減輕壓力過(guò)載腦損傷小鼠模型中腦血管系統(tǒng)的不良重塑。A辑甜，顯示小鼠大腦冠狀面的蘇木精和伊紅染色的圖像衰絮。虛線(xiàn)矩形表示用于組織學(xué)分析的皮質(zhì)區(qū)域。B磷醋，CD31染色的毛細(xì)血管的代表性圖像猫牡，用于進(jìn)行毛細(xì)血管的形態(tài)學(xué)和密度分析。C邓线，毛細(xì)血管密度淌友，以每個(gè)視場(chǎng)內(nèi)染色血管的百分比表示，與Sham對(duì)照組相比骇陈，TAC和非相關(guān)IgG處理的小鼠的毛細(xì)血管密度顯著降低亩进。抗ifn γ抗體對(duì)TAC小鼠腦毛細(xì)血管稀薄有保護(hù)作用缩歪。D，TAC誘導(dǎo)的慢性高血壓對(duì)毛細(xì)血管直徑無(wú)影響谍憔。E匪蝙，CD31/血小板源性生長(zhǎng)因子受體（PDGFR）β染色的毛細(xì)血管的代表性圖像，用于分析周細(xì)胞-毛細(xì)血管的覆蓋范圍习贫。F逛球，與Sham對(duì)照組相比，用非相關(guān)IgG治療的TAC高血壓小鼠的腦毛細(xì)血管周細(xì)胞覆蓋率顯著降低苫昌〔疲抗IFNγ治療保護(hù)小鼠免受壓力過(guò)載誘導(dǎo)的腦毛細(xì)血管周細(xì)胞損失。G祟身，用高（2000000道爾頓（Da））和低（40000Da）分子量右旋糖酐混合物灌注小鼠大腦毛細(xì)血管的代表性圖像奥务，用于分析灌注功能毛細(xì)血管的密度。H袜硫，與Sham對(duì)照組相比氯葬，TAC和非相關(guān)IgG處理小鼠灌注血管面積百分比的灌注毛細(xì)血管密度顯著降低⊥裣荩抗IFNγ治療保護(hù)TAC小鼠免受腦血管稀疏帚称。I，用低分子量右旋糖酐標(biāo)記的毛細(xì)血管密度秽澳，表示每個(gè)視場(chǎng)中滲漏血管的百分比闯睹。與假正常血壓對(duì)照組和用抗IFNγ抗體治療的TAC小鼠相比，用非相關(guān)IgG治療的TAC高血壓小鼠的右旋糖酐保留能力明顯受損担神。數(shù)據(jù)顯示為mean±S.E.M.單個(gè)的數(shù)據(jù)點(diǎn)也顯示為點(diǎn)圖楼吃。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001表示組間比較所刀。雙向方差分析衙荐。對(duì)P值進(jìn)行了多重比較的調(diào)整。

抗IFNγ治療可預(yù)防壓力超負(fù)荷小鼠的認(rèn)知功能障礙

TAC 4周后浮创，采用Morris水迷宮試驗(yàn)檢測(cè)小鼠的認(rèn)知功能忧吟。正如預(yù)期的那樣，所有實(shí)驗(yàn)組都可以在視覺(jué)提示的指示下找到并到達(dá)平臺(tái)(圖7F)斩披，這表明所有小鼠都具有相當(dāng)?shù)囊曈X(jué)和運(yùn)動(dòng)能力溜族。有趣的是，在測(cè)試的獲取階段垦沉，雖然使用非相關(guān)IgG治療的TAC小鼠表現(xiàn)出高時(shí)間延遲到達(dá)平臺(tái)煌抒，但從第一天到第三天的表現(xiàn)沒(méi)有任何改善(圖7G)，抗ifn γ治療顯著改善了TAC小鼠的表現(xiàn)厕倍，其表現(xiàn)出與Sham小鼠相當(dāng)?shù)膶W(xué)習(xí)曲線(xiàn)(圖7G)寡壮。在探針試驗(yàn)中，TAC-anti-IFNγ高血壓小鼠表現(xiàn)出保留的記憶讹弯，具有回憶平臺(tái)位置的能力况既。在TAC-IgG小鼠中，同樣的認(rèn)知功能明顯受損组民，它們隨機(jī)游過(guò)這些象限儀（圖7H和I）棒仍。因此，除了腦血管保護(hù)外臭胜，IFNγ信號(hào)通路的阻斷還能夠防止壓力過(guò)載引發(fā)的認(rèn)知功能下降莫其。

圖 7 通過(guò)抗IFNγ治療預(yù)防壓力過(guò)載引發(fā)的內(nèi)皮連接完整性的破壞和認(rèn)知功能下降。A-C耸三，TAC小鼠顯示出粘附蛋白和緊密連接蛋白血管內(nèi)皮細(xì)胞（VE）-鈣粘蛋白和Claudin5的減少乱陡，這種作用被抗IFNγ中和所阻止。A仪壮，腦毛細(xì)血管ve-鈣粘蛋白和Claudin5染色的代表性圖像蛋褥，CD31顯示。ve-鈣粘蛋白(B)和Claudin5 (C)的表達(dá)水平以染色面積的百分比表示睛驳。D-E烙心，抗IFNγ治療減輕了TAC毛細(xì)血管中RAGEs受體表達(dá)的升高。D乏沸，CD31+腦毛細(xì)血管RAGE染色的代表性圖像淫茵。E，RAGE表達(dá)水平以染色區(qū)域的百分比表示蹬跃。F, Morris水迷宮視覺(jué)試驗(yàn)中到達(dá)平臺(tái)的平均時(shí)間匙瘪。所有的老鼠都表現(xiàn)出相似的視覺(jué)敏銳度和識(shí)別平臺(tái)的能力铆铆。G、在獲取試驗(yàn)中丹喻，與Sham小鼠相比薄货，經(jīng)非相關(guān)抗體處理的TAC小鼠表現(xiàn)出尋找平臺(tái)的延遲，表明學(xué)習(xí)曲線(xiàn)明顯受損碍论×禄抗ifn γ抗體對(duì)TAC高血壓小鼠的學(xué)習(xí)缺陷有保護(hù)作用。H鳍悠，探針試驗(yàn)的熱圖税娜，顯示了每組小鼠的首選游泳位置。通過(guò)對(duì)同一實(shí)驗(yàn)組小鼠在各點(diǎn)游泳時(shí)間的平均得到熱圖藏研。紅色是老鼠花更多時(shí)間游泳的區(qū)域敬矩，藍(lán)色是老鼠花更少時(shí)間游泳的區(qū)域〈赖玻刻度條表示在視場(chǎng)的每個(gè)點(diǎn)上花費(fèi)的累計(jì)時(shí)間的量化弧岳，范圍從未訪問(wèn)點(diǎn)(低分)到首選點(diǎn)(高分)。I业踏，在探針試驗(yàn)中缩筛，用非相關(guān)IgG處理的TAC小鼠無(wú)法回憶平臺(tái)的空間位置，在所有象限中隨機(jī)花費(fèi)時(shí)間堡称。anti-ifNγ治療保護(hù)了TAC小鼠免于記憶缺陷，在平臺(tái)之前的象限的時(shí)間明顯更長(zhǎng)艺演。結(jié)果以mean±S.E.M.表示却紧。單個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)也顯示為柱狀圖頂部的點(diǎn)圖。*P<0.05胎撤，**P<0.01晓殊，***P<0.001表示組間比較，（G)中##P<0.001表示同一組不同時(shí)間點(diǎn)間比較伤提。雙向方差分析巫俺。對(duì)P值進(jìn)行了多重比較的調(diào)整。N表示被分析的動(dòng)物的數(shù)量肿男。

討論

本研究揭示了炎癥信號(hào)導(dǎo)致高血壓腦損傷發(fā)展的機(jī)制介汹。利用一種新的斑馬魚(yú)離子失衡驅(qū)動(dòng)的RAS失調(diào)模型，我們進(jìn)行了一系列的基因表達(dá)分析和實(shí)時(shí)成像舶沛，以了解炎癥性疾病進(jìn)展的時(shí)間進(jìn)程嘹承，并識(shí)別參與先天免疫細(xì)胞激活的細(xì)胞事件。我們發(fā)現(xiàn)如庭，離子失衡引發(fā)RAS升高和全身炎癥叹卷，以Ifnγ和Il1β上調(diào)為標(biāo)志，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的行為和功能顯著改變。我們觀察到巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞-內(nèi)皮接觸相關(guān)的內(nèi)皮連接重塑和收縮骤竹，以及細(xì)胞向血管節(jié)段的相反兩側(cè)的橫向遷移帝牡，導(dǎo)致血管網(wǎng)絡(luò)的退化，而對(duì)血管細(xì)胞的死亡沒(méi)有影響蒙揣。對(duì)TAC壓力負(fù)荷小鼠模型腦血管系統(tǒng)的評(píng)估進(jìn)一步支持血腦屏障功能障礙和內(nèi)皮退化發(fā)生微血管重構(gòu)靶溜，證據(jù)是連接復(fù)合蛋白表達(dá)減少，毛細(xì)血管密度降低鸣奔，直徑?jīng)]有變化墨技。獨(dú)立于細(xì)胞凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞退化被認(rèn)為只在血管網(wǎng)絡(luò)發(fā)育的生理修剪中起作用。它與高血壓之間的關(guān)系有些出乎意料挎狸。高血壓患者血管重構(gòu)的機(jī)制目前尚不清楚扣汪。大多數(shù)研究集中在闡明動(dòng)脈壁的主要變化，即大動(dòng)脈管腔大小和剛度增加锨匆，中膜厚度增加崭别，小動(dòng)脈管腔直徑是否減少。高血壓患者血管壁對(duì)機(jī)械擾動(dòng)的適應(yīng)和不適應(yīng)主要與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞激活和炎癥驅(qū)動(dòng)的間質(zhì)纖維化有關(guān)恐锣。這些早期報(bào)道的機(jī)制不太可能參與我們所觀察到的腦血管退化茅主。我們的發(fā)現(xiàn)有助于更好地理解在離子失衡和壓力過(guò)載誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中血管退化的細(xì)胞和分子途徑，這是抵消隨后發(fā)生的大腦功能缺陷的基礎(chǔ)土榴。

腦小血管疾簿饕Α（CSVDs）是一種與中風(fēng)，認(rèn)知功能惡化和癡呆密切相關(guān)的亞臨床病理學(xué)玷禽。高血壓是CSVD的一個(gè)可改變的危險(xiǎn)因素赫段。高血壓驅(qū)動(dòng)的CSVD和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能下降的機(jī)制尚未完全闡明。我們從斑馬魚(yú)和小鼠模型中獲得的研究結(jié)果不僅證明了炎癥介質(zhì)的誘發(fā)作用矢赁，與高血壓反應(yīng)的初始觸發(fā)聯(lián)系起來(lái)糯笙，而且揭示了潛在的信號(hào)機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)撩银，在RAS誘導(dǎo)后给涕，IFNγ表達(dá)的升高會(huì)引發(fā)一系列致病事件，包括巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞中血管/神經(jīng)保護(hù)轉(zhuǎn)錄程序的抑制额获、內(nèi)皮間連接的中斷以及收縮/遷移介導(dǎo)的腦血管消退够庙。最終，神經(jīng)元細(xì)胞死亡的增加和伴隨而來(lái)的微血管密度的降低可能導(dǎo)致了IFNγ驅(qū)動(dòng)的認(rèn)知缺陷抄邀。因此首启，抗IFNγ治療可預(yù)防高血壓刺激下腦血管稀疏和認(rèn)知能力下降的進(jìn)展，這為開(kāi)發(fā)新的高血壓CSVD的預(yù)防和治療策略提供了機(jī)會(huì)撤摸∫闾遥抗IFNγ治療高血壓相關(guān)器官損傷的療效早前已有報(bào)道褒纲。在子宮灌注壓降低的大鼠模型中，給予抗IFNγ已被證明可以降低胎盤(pán)氧化應(yīng)激和子宮動(dòng)脈阻力指數(shù)钥飞。然而莺掠，在離子失衡和壓力過(guò)載模型中，IFNγ信號(hào)的阻斷并不足以恢復(fù)舒張功能障礙读宙，這表明從這些高血壓刺激到心臟重構(gòu)的進(jìn)展可能涉及一個(gè)IFNγ獨(dú)立的途徑彻秆。此前有報(bào)道稱(chēng)，慢性醛固酮輸注聯(lián)合非腎切除術(shù)和鹽喂養(yǎng)的IFNγ缺陷小鼠表現(xiàn)出高血壓減弱结闸，但舒張功能障礙和左心室肥厚加重唇兑。另一方面，IFNGR缺乏減少了心臟細(xì)胞外基質(zhì)沉積和誘導(dǎo)性心律失宠氤基質(zhì)扎附，但沒(méi)有改變Angii灌注小鼠的血壓。目前的研究结耀，連同這些早期的報(bào)告留夜，暗示了不同的刺激參與了心臟的不同反應(yīng)。

除了IFNγ图甜，我們的工作確定了其他潛在的免疫調(diào)節(jié)候選碍粥，特別是巨噬細(xì)胞靶向治療策略。生長(zhǎng)因子BMPs家族在神經(jīng)發(fā)生黑毅、神經(jīng)可塑性和損傷反應(yīng)中具有重要的功能嚼摩。例如，BMP5/7的神經(jīng)保護(hù)作用已在一個(gè)基于α-突觸核素的帕金森病小鼠模型中被報(bào)道矿瘦。在血管系統(tǒng)中枕面，BMPs維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)，并參與氧化應(yīng)激觸發(fā)的新血管生成和結(jié)構(gòu)重構(gòu)匪凡。Ifnγ介導(dǎo)巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞中bmp5下調(diào)離子失衡，通過(guò)補(bǔ)充bmp5預(yù)防腦血管稀疏掘猿，這突出了bmp5作為IFNγ驅(qū)動(dòng)的先天免疫紊亂和腦病理的關(guān)鍵下游靶點(diǎn)的作用病游。IFNγ誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞表型改變導(dǎo)致BMP5表達(dá)減少，這可能是我們?cè)谶@里觀察到的內(nèi)皮細(xì)胞連接完整性被破壞和內(nèi)皮細(xì)胞收縮的基礎(chǔ)稠通。根據(jù)我們的觀察衬衬，之前曾報(bào)道過(guò)血管周?chē)奘杉?xì)胞抗炎群對(duì)內(nèi)皮屏障功能的調(diào)節(jié)的報(bào)道。此外改橘，BMP與yes相關(guān)蛋白1及其副轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子突觸后密度蛋白（PDZ）結(jié)合基序（TAZ）合作滋尉，通過(guò)控制VE-鈣粘蛋白轉(zhuǎn)換來(lái)調(diào)節(jié)內(nèi)皮連接完整性。除了BMP飞主，NUCB2及其切割產(chǎn)物nesfastin-1也可以通過(guò)其抗炎和抗凋亡特性發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能狮惜，這在帕金森病和蛛網(wǎng)膜下腔出血小鼠模型中得到了證實(shí)高诺。因此，一項(xiàng)臨床研究報(bào)道了帕金森病患者血清中nesfastin-1水平較低碾篡。也有人認(rèn)為nesfastin-1參與了認(rèn)知功能虱而。從我們的轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn)的另一個(gè)分子是PlxnD1。雖然它在內(nèi)皮細(xì)胞中的激活可以發(fā)出抗血管生成作用的信號(hào)开泽，巨噬細(xì)胞中的PlxnD1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2介導(dǎo)的促血管生成反應(yīng)牡拇，暗示其在巨噬細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞的串?dāng)_中的作用。與這些神經(jīng)/血管保護(hù)因子相反穆律，在離子缺乏處理的巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種分泌酶惠呼，肌肽二肽酶1（cndp1）與神經(jīng)退行性變直接相關(guān)。我們的數(shù)據(jù)揭示了這些關(guān)鍵的穩(wěn)態(tài)和神經(jīng)/血管保護(hù)因子的差異表達(dá)峦耘，以及巨噬細(xì)胞中的神經(jīng)退行性生物標(biāo)志物剔蹋，這為這些分子與先天免疫細(xì)胞功能和高血壓腦重構(gòu)的發(fā)病機(jī)制之間的聯(lián)系提供了第一個(gè)證據(jù)。此外贡歧，這些因子以及補(bǔ)體系統(tǒng)的組成部分和抗菌防御機(jī)制的改變表明滩租，巨噬細(xì)胞對(duì)離子失衡的反應(yīng)并不是急性炎癥中常見(jiàn)的典型促炎激活。在免疫靶向治療的發(fā)展中利朵，應(yīng)考慮巨噬細(xì)胞穩(wěn)態(tài)功能的紊亂律想。為此，這里建立的動(dòng)脈高血壓和心臟舒張功能障礙的斑馬魚(yú)模型也為大規(guī)模篩選其他候選治療方法提供了新的機(jī)會(huì)绍弟。

基金：這項(xiàng)工作得到了Helmholtz-Gemeinschaft(項(xiàng)目編號(hào)VH-NG-1247)技即， Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG，德國(guó)研究基金會(huì))- SFB-1470 - A06的資助樟遣。在歐洲研究區(qū)域網(wǎng)絡(luò)-心血管疾病(ra - cvd) -腸-腦-免疫- hhd項(xiàng)目框架內(nèi)而叼，以及在dc . h . g.b.和M.P.K.的" ricerca corrente "項(xiàng)目框架內(nèi)，由瑞士國(guó)家科學(xué)基金會(huì)(310030_200701和310030B_ 176400)資助Markus Affolter(巴塞爾生物中心)豹悬。

原文網(wǎng)址：https://academic.oup.com/cardiovascres/article/119/5/1234/6941103

注：因文章篇幅有限葵陵，所有相關(guān)引用文獻(xiàn)，以及補(bǔ)充圖瞻佛、表可以點(diǎn)擊至原文查閱脱篙。