雜志：AMERICAN JOURNAL OF HUMAN GENETICS

影響因子：9.8（2023）

年份：2022

通訊作者：1螺垢、蘇珊喧务；2赖歌、魯辛

通訊作者單位：

1枉圃、內(nèi)梅亨大學(xué)醫(yī)學(xué)中心人類遺傳學(xué)系，郵編9101,6500 HB奈梅亨庐冯，荷蘭孽亲；

2、內(nèi)梅亨大學(xué)奈梅亨分子生命科學(xué)研究所展父，郵編9101,6500 HB奈梅亨返劲，荷蘭。

摘要

背景：外顯子組測(cè)序顯示栖茉，在常染色體隱性錐體營(yíng)養(yǎng)不良或錐體棒狀營(yíng)養(yǎng)不良和復(fù)合雜合PoCiB突變的三個(gè)兄弟姐妹中篮绿，POCIB編碼POC1中心粒蛋白B的純合錯(cuò)義突變(c.317C>G [p.Arg106Pro])、(c.199 201del [p.]Gin67dell和c.810+1G>T)在無(wú)親緣關(guān)系的錐桿營(yíng)養(yǎng)不良患者中吕漂。當(dāng)POC1B在人tert永生型視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞1中過(guò)表達(dá)時(shí)亲配，編碼的野生型蛋白定位于初級(jí)纖毛的基底，而p.a g106pro和p.Gin67del變體形式的POCiB則失去了這種定位惶凝。

方法：在斑馬魚中吼虎，嗎啉寡核苷酸誘導(dǎo)的pocib翻譯的敲低導(dǎo)致了劑量依賴性的小眼表型、光動(dòng)力學(xué)反應(yīng)受損以及光感受器外節(jié)段長(zhǎng)度的減少苍鲜。野生型人POCiBl mRNA可以部分挽救這些眼部表型思灰，而c.199_201del和c.317C>G突變型人POC1B mRNA則不能。酵母雙雜交篩選人類視網(wǎng)膜cDNA文庫(kù)混滔，發(fā)現(xiàn)FAM161A是PoCiB的二元相互作用伙伴洒疚。這在共免疫沉淀和共定位實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)歹颓，兩者都顯示FAM161A與POCiB的p.a g106pro和p.g n67del變體形式的相互作用喪失。

結(jié)果：FAM161A先前與常染色體隱性視網(wǎng)膜色素變性有關(guān)拳亿，并被證明位于連接纖毛的光感受器的底部晴股，在那里它與其他幾種纖毛病相關(guān)蛋白相互作用。

結(jié)論：總之肺魁，本研究表明电湘，POC1B突變導(dǎo)致光感受器感覺纖毛的缺陷，從而影響錐狀和桿狀光感受鹅经。

關(guān)鍵詞：錐狀寂呛；光感受器；斑馬魚

前言

遺傳性錐體疾病是一組異質(zhì)性疾病瘾晃，主要影響錐體光感受器贷痪，估計(jì)全球患病率為1:30 000 -1:40,000。它們可分為進(jìn)行性錐體營(yíng)養(yǎng)不良(COD)和更穩(wěn)定的疾病蹦误，也稱為錐體功能障礙綜合征劫拢。靜止亞型，如色盲(ACHM)强胰，是先天性的舱沧，ACHM患兒表現(xiàn)為先天性眼球震顫，視力明顯下降偶洋，嚴(yán)重的畏光熟吏，色覺差或缺失，眼底正常玄窝。視網(wǎng)膜電圖(ERG)顯示錐體反應(yīng)無(wú)或殘留牵寺，桿狀反應(yīng)正常。另一方面，COD開始于童年或成年早期，并導(dǎo)致視覺敏銳度和色覺的進(jìn)行性惡化担巩，表現(xiàn)為ERG的錐體反應(yīng)減弱。眼底檢查的COD從正常到黃斑病變或黃斑區(qū)完全萎縮不等黎休。相當(dāng)數(shù)量的COD患者也會(huì)出現(xiàn)視桿功能障礙，導(dǎo)致錐桿營(yíng)養(yǎng)不良(CRD)伴全視網(wǎng)膜變性典阵。在CRD中奋渔，視桿功能的喪失也可能伴隨視錐功能的喪失。因此壮啊，除了中心視力喪失嫉鲸，患有CRD的人還會(huì)經(jīng)歷夜盲癥和周邊視力喪失，導(dǎo)致更早的年齡失明歹啼。

分子遺傳學(xué)研究已經(jīng)在ACHM患者中發(fā)現(xiàn)了5個(gè)突變基因玄渗，8個(gè)與COD相關(guān)的基因座菠，以及17個(gè)與CRD相關(guān)的基因(RetNet，參見Web Resources)藤树。錐體疾病可以遵循孟德爾遺傳的所有模式浴滴，并表現(xiàn)為非綜合征和綜合征形式錐體疾病相關(guān)基因編碼的蛋白質(zhì)在錐體光傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)、向連接纖毛或通過(guò)纖毛的的運(yùn)輸過(guò)程岁钓、細(xì)胞膜形態(tài)發(fā)生和維持升略、突觸轉(zhuǎn)導(dǎo)和類視黃醛循環(huán)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

全外顯子組測(cè)序(WES)已被證明在發(fā)現(xiàn)遺傳性視網(wǎng)膜疾病的遺傳缺陷方面非常有效屡限。在這里品嚣，我們報(bào)告了通過(guò)WES鑒定POCIB突變(MIM 614784)，編碼一個(gè)先前與基礎(chǔ)體穩(wěn)定性相關(guān)的蛋白質(zhì)钧大，潛在的常染色體隱性COD或CRD翰撑。此外，我們還提供了一種綜合功能方法來(lái)證實(shí)所鑒定突變的因果關(guān)系啊央。

研究對(duì)象和臨床評(píng)價(jià)

本研究包括一個(gè)非近親土耳其家庭(家庭A)眶诈，其三個(gè)兄弟姐妹患有COD和CRD，以及一個(gè)孤立的荷蘭個(gè)體(家庭B)瓜饥，其ACHM演變?yōu)檫M(jìn)行性視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良(圖1A)逝撬。這些家庭屬于受ACHM (n?21)，COD (n?110)或CRD (n?112)影響的個(gè)體的大隊(duì)列压固。大多數(shù)先證者是其家族中唯一的受累者球拦，他們?cè)诤商m靠闭、比利時(shí)帐我、英國(guó)和加拿大的多個(gè)眼科中心進(jìn)行了確認(rèn)。被診斷為ACHM的個(gè)體有先天性下垂性眼球震顫愧膀、視力下降拦键、畏光、嬰幼兒早期色覺差或缺失的病史檩淋，ERG上錐體功能缺失(但桿狀反應(yīng)正常)芬为。在我們的隊(duì)列中，當(dāng)個(gè)體表現(xiàn)為兒童期或成年早期開始的視力和色覺進(jìn)行性惡化蟀悦，ERG的錐體反應(yīng)減少媚朦，桿狀反應(yīng)正常時(shí)，他們被歸類為COD日戈。6CRD的納入標(biāo)準(zhǔn)是中心視力進(jìn)行性喪失询张，色視障礙，ERG的錐體反應(yīng)(同樣或更嚴(yán)重地減少)和桿狀反應(yīng)的減少浙炼。

在明確基因缺陷后份氧，對(duì)家系A(chǔ)和B患者的病歷資料進(jìn)行評(píng)估唯袄。眼科檢查包括最佳矯正視力(Snellen視力表)、裂隙燈顯微鏡檢查蜗帜、檢眼鏡檢查恋拷、色覺檢查(Hardy-Rand-Rittler色覺測(cè)試和Lanthony面板d- 15測(cè)試)和視野檢查(目標(biāo)V-4e和I-4e ~ I-1e)。2例患者均獲得了黃斑區(qū)和周邊4個(gè)象限的眼底照片厅缺。按照國(guó)際臨床視覺電生理 學(xué) 會(huì) (International Society for Clinical Electrophysiology ofVision, ivim)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行ERG檢查蔬顾。時(shí)域光學(xué)相干斷層掃描(OCT);在一個(gè)受影響的個(gè)體(A-II:4)中獲得Stra-tus OCT 3000，卡爾蔡司Meditec)湘捎，以及光譜域OCT (SD-OCT;HeidelbergSpectralis HRAtOCT阎抒，海德堡工程;B-II先證者獲得30張單行掃描，每行10幀);由于眼球震顫消痛，SD-OCT的獲取受到限制且叁。本研究獲得了各參與中心的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)的批準(zhǔn)，并遵循《赫爾辛基宣言》的原則秩伞。所有受試者在參與本研究前均提供了書面知情同意逞带。

外顯子組測(cè)序和變異鑒定

利用SOLiD4測(cè)序平臺(tái)(生命技術(shù))對(duì)疑似常染色體隱性遺傳家庭的12例CRD或cod影響先證進(jìn)行WES測(cè)序，并根據(jù)制造商的方案使用SureSelect Human All Exon v.2對(duì)外顯子組進(jìn)行富集試劑盒(50 Mb)纱新，包含約21,000個(gè)基因的外顯子序列(Agilent技術(shù))展氓。使用LifeScope軟件v.2.1(生命技術(shù))繪制hg19參考基因組組裝的顏色空間reads (UCSC genome Browser)。通過(guò)DiBayes算法的高嚴(yán)格調(diào)用調(diào)用單核苷酸變異體脸爱。用SOLiD Small Indel Tool(生命技術(shù))檢測(cè)微小的插入和缺失遇汞。對(duì)于個(gè)體A-II:1，69,686,646個(gè)讀長(zhǎng)被唯一映射到基因編碼區(qū);中位覆蓋率為58.23簿废，有44,784個(gè)序列變異空入。先證物B-II: 175,493,298個(gè)reads被唯一地映射到基因編碼區(qū);中位覆蓋率為66.73，有47,304個(gè)序列變異族檬。為了驗(yàn)證WES序列變異并排除其他POC1B突變的存在歪赢，使用Primer 3軟件設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增POC1B的所有編碼外顯子和外顯子-內(nèi)含子邊界(表S1，可在線獲取)单料。

RT-PCR分析mRNA

為了評(píng)估c.810 ~ 1g >T對(duì)POC1B轉(zhuǎn)錄本的影響埋凯，根據(jù)制造商(QIAGEN)的方案，從患者B-II:1和三個(gè)對(duì)照個(gè)體的外周血細(xì)胞中分離總RNA扫尖。B-II 1和對(duì)照按標(biāo)準(zhǔn)程序用植物血凝素培養(yǎng)外周血細(xì)胞白对。在有或沒有放線菌酮的情況下，將受累個(gè)體的白細(xì)胞培養(yǎng)4 ~ 6小時(shí)换怖，以便觀察突變的影響甩恼，以及含無(wú)義mrna可能通過(guò)無(wú)義介導(dǎo)的衰變發(fā)生降解。利用低張力滲透性休克和離心法將白細(xì)胞與紅細(xì)胞分離。用iScript (Biorad)對(duì)1 mg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄媳拴。用2.5 ml cDNA進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)黄橘，引物位于外顯子5和9(表S2)(35個(gè)循環(huán))，然后使用3100或3730 DNA分析儀(AppliedBiosystems)進(jìn)行Sanger測(cè)序屈溉。

斑馬魚嗎啉諾敲低

Tupfel長(zhǎng)鰭斑馬魚在標(biāo)準(zhǔn)條件下繁殖和飼養(yǎng)塞关。18所有實(shí)驗(yàn)均按照歐洲動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指南(2010/63/EU)實(shí)施。斑馬魚卵是從自然產(chǎn)卵中獲得的子巾。從GeneTools獲得阻斷poc1b15翻譯(50-GATCCTCCATTACAGACGCCATGAT-30) 或 外 顯 子 2 5-0 剪 接 位 點(diǎn) (50-AAGTTCTCTGTCTTATTCAGGAGGA-30)的反義morpholino寡核 苷 酸 (MOs)帆赢。采 用 針 對(duì) 人 b- 珠 蛋 白 內(nèi) 含 子 突 變 (50-CCTCTTACCTCAGTTACAATT TATA-30)的MO作為標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照。對(duì)于MO敲除线梗，使用氣動(dòng)PicoPump pv280 (World PrecisionInstruments)將1 nl稀釋的MO(范圍從2到10 ng)注射到1到2細(xì)胞期胚胎的蛋黃中椰于。每次注射實(shí)驗(yàn)的最小樣本量為80條幼魚。注射后仪搔，在28.5C的E3胚培養(yǎng)基(5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mMccl2和0.33 mMMgSO4)中添加0.1% (w/v)亞甲基藍(lán))中培養(yǎng)胚胎瘾婿。在受精后4天(dpf)，根據(jù)Pearson等人描述的眼部表型的存在將胚胎分為兩組(在立體顯微鏡的眼部標(biāo)尺上<15任意單位;蔡司)烤咧。對(duì)兩組胚胎以及注射和未注射的對(duì)照組進(jìn)行視動(dòng)反應(yīng)(okr)測(cè)量和視網(wǎng)膜的組織學(xué)分析偏陪。

使用Gateway Technology(生命技術(shù))在pCS2t/DEST中克隆編碼人類中心粒1B (POC1B，先前為Pix1)的野生型和變體(p.Gln67del和p.Arg106Pro)蛋白質(zhì)組的cdna煮嫌，進(jìn)行線性化笛谦，并用作體外轉(zhuǎn)錄的模板。根據(jù)制造商的說(shuō)明昌阿，用mMESSAGEmMACHINE試劑盒(生命技術(shù)公司)制備mrna饥脑。如上所述，用MOs注射100 pg mRNA懦冰。

斑馬魚OKR測(cè)定

OKR用前面描述的方法測(cè)量灶轰。斑馬魚幼蟲在一個(gè)小的皮氏培養(yǎng)皿中垂直放置在3%甲基纖維素中。培養(yǎng)皿放置在平臺(tái)上儿奶，周圍是直徑8厘米的旋轉(zhuǎn)鼓框往。在鼓的內(nèi)部顯示了黑白相間的垂直條紋的圖案(每個(gè)條紋都有一個(gè)36的角度)鳄抒。幼蟲(4 dpf)通過(guò)放置在鼓上方的立體顯微鏡觀察闯捎，并用光纖燈照明。當(dāng)幼蟲受到旋轉(zhuǎn)條紋的光刺激時(shí)许溅，記錄它們的眼球運(yùn)動(dòng)瓤鼻。實(shí)驗(yàn)分為3組:逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)30 s、靜止10 s贤重、順時(shí)針旋轉(zhuǎn)30 s茬祷。然后，將幼蟲從甲基纖維素中洗出并蝗，固定后進(jìn)行組織學(xué)分析祭犯。

斑馬魚胚胎感光器外段的染色

檢測(cè)OKR的幼蟲(4 dpf)在4%甲醛的PBS中固定24小時(shí)秸妥，通過(guò)從70%到100%的分級(jí)乙醇步驟脫水，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方案包埋在甲基丙烯酸乙二醇酯中沃粗。眼睛切片(2mm)粥惧，膜用硼-二吡啶(1:10 000PBS)染色，細(xì)胞核用DAPI(1:8 000)染色最盅，蔡司Axio Imager Z1熒光顯微鏡成像突雪。

I免疫染色和顯微鏡檢查

用于免疫組織化學(xué)的斑馬魚和大鼠樣品(未固定和固定在4%多聚甲醛中)在PBS中30%蔗糖中沖洗，在熔化的異戊烷中直接冷凍在Tissue Tek中涡贱。未固定的成年斑馬魚和大鼠眼睛(7 mm)的冷凍切片用抗hspoc1b (1:50;由Chad Pearson和Mary Pinter咏删，科羅拉多大學(xué)慷慨提供)，如Pearson等人所描述的培養(yǎng)細(xì)胞15切片用GT335反染色(1:100;小鼠抗多谷氨跷蚀剩基微管蛋白單克隆抗體督函，由Carsten Janke，國(guó)家中心科學(xué)中心生物化學(xué)大分子研究中心提供)激挪。用小鼠單克隆抗體(zpr-1侨核，針對(duì)Arr3a，1:50 0;ZIRC)和含有抗視紫紅質(zhì)的視桿細(xì)胞(1:500;羅福斯生物制劑)灌灾。切片用PBS洗滌搓译，在0.01% (v/v) Tween-20 PBS中滲透20分鐘，然后再次洗滌锋喜。接下來(lái)些己，用10%的正常山羊血清和2% BSA在PBS中，一抗在4℃阻斷緩沖液中孵育過(guò)夜嘿般。PBS洗滌后段标，二抗在阻斷緩沖液中室溫孵育45分鐘。樣品用DAPI反染炉奴，用生命技術(shù)公司(extension Gold)貼裝逼庞。對(duì)于所有切片，山羊抗小鼠或山羊抗兔(Alexa 488或568瞻赶，分別為1:500;采用生命技術(shù)公司的二抗赛糟。

互補(bǔ)脫氧核糖核酸的結(jié)構(gòu)

根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用Gateway Technology(生命技術(shù))創(chuàng)建所有表達(dá)結(jié)構(gòu)砸逊。這些構(gòu)建體編碼33HA-POC1B野生型和變體(p.garg106pro和p.g gln67del)和33FLAG-FAM161A用于共定位研究璧南，編碼單體紅色熒光蛋白(mRFP)-POC1B野生型和變體和PalmMyr-CFP-FAM161A用于共定位研究。編碼478個(gè)氨基酸的POC1B全長(zhǎng)的cDNA構(gòu)建(POC1B;RefSeq登錄號(hào)NM_172240.2 [gene]和NP_758440.1[蛋白])或其不同片段通過(guò)gateway - adaptive PCR產(chǎn)生并隨后克隆师逸。第一個(gè)片段(POC1B-WD40)橫跨氨基酸1-297司倚，包含WD40結(jié)構(gòu)域。第二個(gè)片段(POC1B-SR)橫跨298-426個(gè)氨基酸，沒有任何已知的結(jié)構(gòu)域动知。第三個(gè)片段(POC1B-CC)跨越427-478個(gè)氨基酸皿伺，包含一個(gè)單一的線圈結(jié)構(gòu)域(圖S1)。編碼POC1B變異體p.g gln67del和p.g arg106pro的構(gòu)建體通過(guò)定點(diǎn)誘變PCR生成盒粮。從全長(zhǎng)FAM161A克隆中生成編碼全長(zhǎng)FAM161A的構(gòu)建體心傀。所有進(jìn)入克隆序列經(jīng)桑格測(cè)序驗(yàn)證。

酵母雙雜交試驗(yàn)

利用基于gal4的酵母雙雜交系統(tǒng)(HybriZAP, Stratagene)鑒定POC1B的二元蛋白-蛋白相互作用部分拆讯。將編碼全長(zhǎng)POC1B的構(gòu)建體和編碼POC1B片段的三個(gè)構(gòu)建體融合到DNA結(jié)合域(GAL4-BD)上脂男，作為誘餌篩選人寡聚dt引物視網(wǎng)膜cDNA文庫(kù)。酵母菌株P(guān)J69-4A攜帶HIS3(組氨酸)种呐、ADE2(腺嘌呤)和LacZ (b-半乳糖苷酶)報(bào)告基因宰翅，作為寄主。通過(guò)在選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)評(píng)估報(bào)告基因(HIS3和ADE2)的激活和b-半乳糖苷酶比色過(guò)濾提升試驗(yàn)(LacZ報(bào)告基因)來(lái)分析相互作用爽室。桑格測(cè)序證實(shí)了含有推測(cè)相互作用部分的克隆的cDNA插入汁讼。

在hTERT-RPE1細(xì)胞中的定位

人tert永生化視網(wǎng)膜色素上皮1 (hTERT-RPE1)細(xì)胞按先前描述培養(yǎng)。細(xì)胞播種在蓋片上阔墩，培養(yǎng)到80%的融合度嘿架，隨后在僅含0.2%胎牛血清的培養(yǎng)基中血清饑餓24小時(shí)，以誘導(dǎo)纖毛生長(zhǎng)啸箫。然后根據(jù)制造商的說(shuō)明耸彪，使用Lipofectamine 2000 (生命技術(shù))，用編碼mRFP-POC1B(野生型或變體)和PalmMyr-CFP-FAM161A(野生型)的構(gòu)建物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染忘苛。細(xì)胞用4%多聚醛固定20分鐘蝉娜，用1% Triton X-100 PBS處理5分鐘，用2% BSA PBS封閉20分鐘扎唾。細(xì)胞用一抗GT335(纖毛和基底體標(biāo)記物召川，1:500)和a-RPGRIP1L(SNC039 ~ snc040，23過(guò)渡區(qū)標(biāo)記物胸遇，1:500)孵育1小時(shí)荧呐，用2%BSA PBS稀釋。PBS洗滌后纸镊，細(xì)胞與二抗孵育45 min倍阐。二抗體山羊抗小鼠、山羊抗豚鼠薄腻、山羊抗兔(alex488收捣、568、647庵楷，比例分別為1:500;生命技術(shù)公司)用2%BSA PBS稀釋。細(xì)胞用PBS和milliQ短暫洗滌，然后裝在含有DAPI (Vector Laboratories)的Vectashield中尽纽。采用蔡司Axio Imager Z1型633物鏡熒光顯微鏡分析野生型和變異型POC1B蛋白的細(xì)胞定位咐蚯。在光照路徑中插入apoome滑塊，通過(guò)結(jié)構(gòu)化照明生成光學(xué)切片弄贿，隨后使用AxioVision(蔡司)和Photoshop CS4 (Adobe Systems)軟件進(jìn)行處理春锋。

免疫共沉淀

33HA-POC1B(野生型和變體)和33FLAG-FAM161A在人胚胎腎293T (HEK293T)細(xì)胞中共合成。作為陰性對(duì)照差凹，功能不相關(guān)的p63與POC1B和FAM161A共同合成期奔。作為陽(yáng)性對(duì)照，我們使用了先前描述的腎囊素-4(由NPHP4 [MIM 607215]編碼)與RPGRIP124以及l(fā)ebercilin(由LCA5 [MIM 611408]編碼)與FAM161A之間的相互作用危尿。這些基因表達(dá)48小時(shí)后呐萌，細(xì)胞在冰上裂解緩沖液(50 mMTris-HCL [pH 7.5]， 150 mM NaCl和0.5% Triton X-100)中裂解谊娇，并補(bǔ)充完整的蛋白酶抑制劑雞尾酒(羅氏)肺孤。裂解液與抗ha親和基質(zhì)(羅氏)或小鼠抗flag瓊脂糖(Sigma-Aldrich)在4℃下孵育5小時(shí)。孵育后济欢，結(jié)合蛋白復(fù)合物的微球在裂解緩沖液中洗滌赠堵，隨后在43 NuPAGE樣品緩沖液中吸收，并在70℃下加熱10分鐘法褥。離心沉 淀 珠 粒 茫叭， 上 清 液 在 NuPAGE Novex 4%-12% Bis-Tris SDS-PAGE凝膠上運(yùn)行。33HA-POC1B與33FLAG-FAM161A的相互作用通過(guò)免疫印跡法進(jìn)行評(píng)估半等，然后用單克隆小鼠抗ha或單克隆小鼠 抗 flag 染 色 (1:10 00;Sigma-Aldrich 為 一 抗 杂靶， 山 羊 抗 小 鼠IRDye800 (1:20 000;Li-Cor)作為二抗。在Li-Cor Odyssey 2.1紅外掃描儀上分析熒光酱鸭。

結(jié)果

IPOC1B突變鑒定

POCIB突變的鑒定在一個(gè)有三個(gè)兄弟姐妹受COD或CRD影響的土耳其家庭中定位遺傳缺陷(家族a;圖1A)吗垮，我們?cè)贏-II:1中進(jìn)行了外顯子組測(cè)序。當(dāng)在dbSNP和我們的內(nèi)部對(duì)照(n = 2,604個(gè)等位基因)中出現(xiàn)頻率< 0.5%凹髓，并且當(dāng)它們代表無(wú)義烁登、移碼、規(guī)范剪接位點(diǎn)或錯(cuò)義突變且PhyloP評(píng)分> 2.7(范圍-14.1-6.4)時(shí)蔚舀，選擇推定的因果突變?cè)诔Ｈ旧w隱性遺傳的假設(shè)下饵沧，我們?cè)贏STE1、CNTN3 (MIM 601325)和TUBGCP2中發(fā)現(xiàn)了潛在的復(fù)合雜合突變(存在于>20%的序列變異reads中);對(duì)這些突變的Sanger測(cè)序顯示赌躺，它們不與疾病分離狼牺。我們確定了一個(gè)潛在的純合突變(存在于>80%的序列變異reads中;表S3)， c.317C>G（p.Arg106Pro）在POCIB（MIM 614784）和桑格序列分析發(fā)現(xiàn)礼患，它在三個(gè)受影響的兄弟姐妹中以純合狀態(tài)存在是钥，在父母和未受影響的兄弟姐妹中以雜合狀態(tài)存在(圖1A)掠归。106位的精氨酸高度保守，直至衣藻(圖1C)悄泥。c.317位點(diǎn)的PhyloP評(píng)分高達(dá)6.1虏冻，在189個(gè)種族匹配的對(duì)照和NHLBI外顯子組測(cè)序項(xiàng)目外顯子組變異服務(wù)器(EVS，發(fā)布ESP6500)中未發(fā)現(xiàn)c.317C>G突變弹囚。

采用與A家族相同嚴(yán)格的序列變異篩選厨相，荷蘭B家族外顯子組測(cè)序(先證B- ii:1，診斷為非典型ACHM;圖1A)鑒定出三個(gè)具有潛在化合物雜合突變的基因(表S4)鸥鹉。序列NUDT14 （MIM 609219） 和 PIKFYVE （MIM609414)未與疾病分離蛮穿。在POCIB中，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)3 nt缺失毁渗，c.199_201del (p.Gln67del)和一個(gè)影響典型剪接位點(diǎn)核苷酸的突變践磅，c.810 + 1 g > T。通過(guò)對(duì)該個(gè)體的淋巴母細(xì)胞mRNA進(jìn)行RT-PCR祝蝠，發(fā)現(xiàn)后一種突變可誘導(dǎo)外顯子6和7的跳變(c.561_810del;次要突變產(chǎn)物)或外顯子7 (c.677_810del;主要突變產(chǎn)物)(圖1B)音诈，從而分別得到預(yù)測(cè)的截?cái)嗟鞍譸.p phe188aspfs *73和p.p al226glyfs *30。分離分析證實(shí)父母雙方都攜帶這些POC1B突變之一(圖1A)绎狭。在149個(gè)種族匹配的對(duì)照組或NHLBI EVS中均未發(fā)現(xiàn)這兩種突變细溅。第67位的谷氨酰胺在非洲爪蟾中是中等保守的(圖1C)。

通過(guò)歐洲視網(wǎng)膜疾病聯(lián)盟(European Retinal Disease Consortium) 評(píng)估了400多名不相關(guān)常染色體隱性CRD儡嘶、Leber先天性黑內(nèi)障和視網(wǎng)膜色素變性(RP [MIM 268000])患者的全基因組SNP純合子定位數(shù)據(jù)喇聊，并鑒定出8個(gè)具有跨越POC1B的大純合子區(qū)域的先證。蹦狂。然而誓篱，這些先證中POCIB的桑格測(cè)序未發(fā)現(xiàn)額外的致病突變。隨后的POCIB桑格序列分析在更特定的隊(duì)列中凯楔，即在診斷為ACHM (n= 21)窜骄， COD (n= 110)或CRD (n=112)的個(gè)體中，也沒有發(fā)現(xiàn)其他具有POCIB突變的個(gè)體摆屯。

圖1 受COD或CRD影響的家庭中的POCIB突變邻遏。(A) Sanger測(cè)序顯示在A和1家族中分離出純合錯(cuò)義突變M1 (C . 317g >C [p.Arg106Pro))突變M2 (c.199 201del [p.Gln67del)和M3 (c.810+1G>T)在B家族中分離。(B) mRNA RT-PCR研究顯示正常的421 bp產(chǎn)物和異常的387和271 bp產(chǎn)物缺乏外顯子7和外顯子6和7虐骑。分別准验。387 bp和271 bp的cDNA缺失分別導(dǎo)致預(yù)測(cè)截?cái)嗟腜OC1B產(chǎn)物p.Val226Glyfs*30 (c.677_810del)和p.Phel88Aspfs*73 (c.561_810del)。(C) PoCiB氨基酸殘基Gin67和Arg106的進(jìn)化保守性廷没。在所列物種中糊饱，位于67位的谷氨酸是中等保守的，而位于106位的精氨酸是完全保守的颠黎。所示為相同的氨基酸黑色方框表示另锋，灰色方框表示保守殘基滞项。

A、B家族患者的臨床特征

表1總結(jié)了4例POCIB突變個(gè)體的臨床特征砰蠢。眼底和OCT圖像如圖2所示蓖扑。A家族先證者(A- ii:1)在嬰兒期早期表現(xiàn)為視力下降和輕度眼球震顫唉铜。不完全性ACHM的診斷考慮基于9歲時(shí)ERG顯示錐體功能缺失但桿狀反應(yīng)正常台舱。在接下來(lái)的幾年里，視力似乎惡化了潭流，幾年后竞惋，她的兩個(gè)年幼的兄弟姐妹經(jīng)歷了中心視力的快速喪失，提示兩個(gè)兄弟姐妹患有COD(圖2A和2B)灰嫉，一個(gè)兄弟姐妹患有CRD拆宛。沒有關(guān)于這三個(gè)人的長(zhǎng)期數(shù)據(jù)。相比之下讼撒，B-II:1被跟蹤了40多年浑厚。他在童年時(shí)期也被診斷為ACHM，基于典型的視力下降根盒、畏光钳幅、眼球震顫、色覺非常差和匹配的ERG反應(yīng)炎滞。在他的第五個(gè)十年中敢艰，視力開始緩慢下降，在他的第六個(gè)十年中册赛，在他的下象限外圍發(fā)現(xiàn)了包括RPE萎縮和骨針狀色素沉著在內(nèi)的退行性改變(圖2C和2D)钠导。在OCT上，觀察到內(nèi)節(jié)橢球區(qū)發(fā)生變化森瘪，表明內(nèi)外節(jié)之間的連接喪失(圖2E)牡属。55歲時(shí)的ERG顯示錐體缺失和桿體反應(yīng)顯著降低《蟛牵總之逮栅，診斷從孤立的錐體功能障礙轉(zhuǎn)變?yōu)檫M(jìn)行性錐體-桿狀體疾病。系統(tǒng)地治療高血壓痰驱，腎功能正常证芭。

表1 4例POC1B突變個(gè)體臨床資料匯總。視力以Snellen小數(shù)表示担映，縮寫如下:CF废士，數(shù)數(shù)指:COD，錐體營(yíng)養(yǎng)不良:CRD蝇完，錐體桿營(yíng)養(yǎng)不良:D官硝，屈光度:ERG矗蕊，視網(wǎng)膜電圖;LE，左眼;NP氢架，未執(zhí)行;OCT傻咖，光學(xué)相干斷層掃描;RE，右眼;RPE岖研，視網(wǎng)膜色素上皮;和SE卿操，球形當(dāng)量“59歲白內(nèi)障摘除前的屈光不正。

圖2 POC1B突變受試者的臨床表現(xiàn)孙援。(A和B) A家庭12歲時(shí)個(gè)體A- 1和3的右眼眼底攝影害淤。(A)黃斑區(qū)正常的后極。(B)外周野相對(duì)色素沉著()拓售，但未見病理性RPE改變窥摄。(C、D) B-II個(gè)體右眼眼底攝影:B家族60歲1例础淤。(C)后極視神經(jīng)蒼白(*)崭放，血管減弱(箭頭)，黃斑無(wú)RPE紊亂鸽凶。(D)外周下野伴輕度RPE萎縮和骨刺色素沉著(箭頭)币砂。(E)個(gè)體B-II左眼OCT:1未見中央凹發(fā)育不全，但可見內(nèi)節(jié)段橢球帶(箭頭)及附著的后透明體膜(*)改變吱瘩。

POC1B在人hTERT-RPE1細(xì)胞中的定位

為了研究POCIB突變對(duì)編碼蛋白亞細(xì)胞定位的影響道伟，我們?cè)诶w毛hTERT-RPE1細(xì)胞中合成了與mRFP融合的野生型和變異型重組POC1B蛋白。通過(guò)抗多谷氨跏鼓耄化微管蛋白抗體GT335染色可以看出蜜徽，野生型POCIB定位主要集中在纖毛基底體，但也觀察到一些彌漫性細(xì)胞質(zhì)定位(圖3A;圖S2A)票摇。這證實(shí)了Venoux等人之前的結(jié)果拘鞋。相反，攜帶p.g n67del的變異POCIB蛋白(圖3B;圖S2B)或p.Arg106Pro(圖3C;圖S2C)氨基酸改變矢门，完全失去了它們的纖毛定位盆色。

圖3 野生型和變體POC1B在hTERT-RPE1細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。(A)Gin67del (R).和mREP-POC1B-n.;arg106pro (C)(均為紅色)祟剔。其他圖片如圖S2所示隔躲，纖毛用毛脂和纖毛標(biāo)記物GT335(綠色)和過(guò)渡區(qū)標(biāo)記物RPGRIPIL(青色)反染。野生型mRFP-POCIB顯示細(xì)胞質(zhì)定位物延，在基底區(qū)富集宣旱，如圖所示。兩種變體均顯示相似的細(xì)胞質(zhì)定位叛薯，但在纖毛部位缺乏富集浑吟。在所有圖片中笙纤，細(xì)胞核都用DAPI染色(藍(lán)色)。比例尺表示10 μ m组力。

Poc1b在感光細(xì)胞中的定位

對(duì)斑馬魚的Poclb視網(wǎng)膜功能進(jìn)行了評(píng)價(jià)省容。用抗人POCIB染色顯示，該蛋白位于成年斑馬魚視網(wǎng)膜內(nèi)層和外層光感受器層的基底(圖4A)燎字。在與基底體不同的焦平面上腥椒，在外核層的外邊界也觀察到一些染色(數(shù)據(jù)未顯示)。在大鼠光感受器細(xì)胞基底體也檢測(cè)到Poclb免疫染色(圖S3)轩触。

圖4 MO敲除斑馬魚幼蟲poc1b的形態(tài)學(xué)和功能影響寞酿。(A)成年斑馬魚視網(wǎng)膜中Poclb(綠色)的定位家夺。成年斑馬魚的視網(wǎng)膜通常包含兩個(gè)光感受器外段和相關(guān)基底(OS lavers 1和2)脱柱。這兩個(gè)lavers都顯示出Poclb免疫反應(yīng)性，與GT335染色重疊并鄰近(紅色)拉馋，GT335是連接纖毛的標(biāo)記物榨为。縮寫如下:OS煌茴，外層段;CC随闺，連接纖毛;BB，基體;IS蔓腐，內(nèi)節(jié);ONL矩乐，外核層。比例尺表示15um回论。(B)變形眼表型分析散罕。注射6 ng翻譯阻斷MO后，小眼數(shù)量明顯高于注射MO對(duì)照的幼蟲傀蓉。共注射野生型POCIB mRNA可部分恢復(fù)表型欧漱，但不能完全恢復(fù)c.199 201del (p.Gln67del)或c.317C>G (p.Arg106Pro)突變POC1B mRNA。(C) OKR分析(影像S1和S2)葬燎。在注射2ng的幼蟲池中误甚，已經(jīng)觀察到幼蟲反應(yīng)下降Mo(用榮譽(yù)標(biāo)記)。在這個(gè)劑量下谱净，也有變形蟲對(duì)視覺刺激有反應(yīng)窑邦。(D)用對(duì)照或poclb MOs注射的眼睛的切片被染色為外段(紅色)和細(xì)胞核(藍(lán)色)。對(duì)視覺刺激沒有反應(yīng)的變形體的眼睛更小壕探「郧眨刻度條表示S0 um.l(E)無(wú)應(yīng)答的異型體(OKR-)外節(jié)長(zhǎng)度減少或缺失，而應(yīng)答的異型體(OKR')外節(jié)長(zhǎng)度正常浩蓉，刻度條代表10 um派继。

Poc1b基因敲低導(dǎo)致斑馬魚的視覺損傷

Poclb突變體表現(xiàn)出Pearson等人先前描述的典型纖毛病表型宾袜，包括心包水腫、小眼睛驾窟、色素定位錯(cuò)誤以及體軸縮短和彎曲(圖S4A)庆猫。在2 ng MO處理的幼蟲中已經(jīng)觀察到小眼睛，并且隨著劑量的增加而變得更加頻繁(圖4B;圖S4B)绅络。在6 ng MO劑量下月培，39.8%的變異體出現(xiàn)了較小的眼睛，并且平均明顯小于野生型眼睛(圖4B;圖S4B)恩急， 92.5%的突變體表現(xiàn)出上述一種或多種表型杉畜，但死亡率高于對(duì)照組。先前用第二個(gè)MO靶向poclb外顯子2的5'剪接位點(diǎn)驗(yàn)證了MO敲除的特異性衷恭，從而導(dǎo)致59.1%的變形體具有小眼睛(圖S4B)此叠。

以對(duì)照和poclb MOs為對(duì)照，測(cè)定其OKR随珠。與野生型或?qū)φ兆⑸溷f酸鹽的幼蟲相比灭袁，小眼突變體的OKR缺失或較低(圖4C;影片S1和S2)。接受相同劑量MO但眼睛大小正常的變形體對(duì)OKR刺激的反應(yīng)正常窗看。這種表型在用剪接位點(diǎn)阻斷MO處理的幼蟲中得到證實(shí)(數(shù)據(jù)未顯示)茸歧。在對(duì)照注射mo的幼蟲和表現(xiàn)出OKR的變形體中，外節(jié)長(zhǎng)度不受影響显沈。OKR測(cè)量的視網(wǎng)膜組織學(xué)分析顯示软瞎，光感受器外段縮短或缺失，而層壓顯示正常(圖4D和4E)拉讯。我們觀察到小眼表型與OKR減少或缺失之間存在完美的相關(guān)性涤浇。眼睛的大小似乎與外節(jié)長(zhǎng)度相關(guān)以及對(duì)視覺刺激的反應(yīng)性相關(guān)。因此遂唧，我們可以量化眼睛的大小來(lái)衡量Poclb功能喪失的影響芙代。事實(shí)上，共注射100 pg人類野生型POCIB mRNA盖彭，而不注射c.199_201del (p.Gln67del)或c.317C>G (p.Arg106Pro)突變型POCIB mRNA纹烹，顯著地挽救了poclb敲除(圖4B;圖S4B)。

具有較小眼睛的變形體的一部分細(xì)胞中沒有典型桿狀(視紫紅質(zhì))和錐狀(zpr-1)標(biāo)記物的免疫組織化學(xué)染色(圖S4C)召边。高倍圖像顯示铺呵，雖然在變形視網(wǎng)膜的某些區(qū)域沒有免疫染色，但光感受器細(xì)胞的細(xì)胞核仍然存在隧熙。

與POCIB相互作用的視網(wǎng)膜蛋白的鑒定

為了確定視網(wǎng)膜中POCIB的相互作用伙伴片挂，我們?cè)诮湍?酵母雙雜交系統(tǒng))中采用了基于gal4的相互作用陷阱篩選。我們篩選了一個(gè)表達(dá)人視網(wǎng)膜cdna的文庫(kù)，尋找潛在的POCIB相互作用物音念。兩者都是表達(dá)全長(zhǎng)POCIB的結(jié)構(gòu)表達(dá)不同POCIB片段的構(gòu)建體作為誘餌(圖S1)沪饺。含有POCIB羧基末端卷曲結(jié)構(gòu)域的片段被發(fā)現(xiàn)可能與五種不同的蛋白質(zhì)相互作用，包括FAM161A(圖S5A)闷愤。與這種已知的視網(wǎng)膜疾病相關(guān)蛋白的相互作用引起了我們的注意整葡，并通過(guò)使用兩種全長(zhǎng)蛋白的共免疫沉淀試驗(yàn)得到了證實(shí)(圖5A)。在相同的實(shí)驗(yàn)中讥脐，我們研究了POCIB中鑒定的錯(cuò)義和單氨基酸缺失變異對(duì)相互作用的影響遭居。事實(shí)上，與野生型相比旬渠，POCIB的改變量明顯更低蛋白質(zhì)與FAM161A共沉淀俱萍，表明物理相互作用被破壞。不相關(guān)的p63不與POCIB或FAM161A共沉淀告丢，這在共免疫沉淀試驗(yàn)中證實(shí)了POC1B和FAM161A相互作用的特異性枪蘑。通過(guò)互反共免疫沉淀證實(shí)了野生型POCIB與FAM161A之間的相互作用，以及變異POCIB蛋白與FAM161A之間的相互作用減弱(圖S5B)芋齿。未裁剪的免疫印跡圖像如圖S6所示腥寇。

為了驗(yàn)證在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中FAM161A和變異體POCIB之間失去相互作用，我們共轉(zhuǎn)染hTERT-RPE1細(xì)胞與PalmMyr-CFPFAM161A一起編碼野生型和變異mRFP-POCIB(圖SB-SD;圖S7A-S7C)觅捆。PalmMyr，兩者都能誘導(dǎo)感興趣蛋白的膜結(jié)合這隨后可以通過(guò)熒光顯微鏡觀察熒光CFP標(biāo)簽的表達(dá)麻敌。FAM161A和POCIB的共表達(dá)表明編碼蛋白在質(zhì)膜栅炒、基底體完全共定位，并與微管網(wǎng)絡(luò)相關(guān)术羔。當(dāng)POCIB結(jié)構(gòu)中存在任何一種突變時(shí)赢赊，與FAM161A的共定位完全丟失。PalmMyrCFP-FAM161A隨后維持了其膜级历、基體和微管的結(jié)合释移，但變異型POCIB的定位是胞質(zhì)性的，不富集于特異亞細(xì)胞位點(diǎn)(圖5C和SD;圖S7B和S7C)寥殖。

圖5 共免疫沉淀及hTERT-RPE1定位研究POC1B和FAM161A玩讳。(A) HEK293T細(xì)胞的共免疫沉淀試驗(yàn)。野生型3xHA-POCIB與3xFLAGFAM161A (lane 1)有效共沉淀嚼贡，但變異3×HA-POCIBp的共沉淀減少熏纯。Gln67del和3xHA-POCIB-p。Arg106Pro(面板4)通過(guò)納入不相關(guān)的p63來(lái)證實(shí)特異性粤策，p63不能與野生型和變型POCIB共免疫沉淀樟澜。作為陽(yáng)性對(duì)照，采用FAM161A共免疫沉淀lebercilin (LCA5編碼)和腎囊素-4 (NPHP4編碼)共免疫沉淀RPGRIP1。圖1和圖2顯示了輸入的免疫印跡秩贰，圖3和圖4顯示了FLAG免疫沉淀的免疫印跡霹俺。大小標(biāo)記物用kDa表示。(B) hTERT-RPE1細(xì)胞中的共定位PalmMyr-CFP-FAM161A(綠色)靶向細(xì)胞膜和微管毒费，將野生型mRFP POCIB(紅色)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜和微管吭服。(C和D) mRFP-POCIB-p未觀察到PalmMyr CFP-FAM161A(綠色)的這種易位。Gin67del (C蝗罗，紅色)或mRFP-POCIB-p艇棕。Arg106Pro (D，紅色)串塑，兩者都保持了它們的細(xì)胞質(zhì)定位沼琉。RPGRIPIL(洋紅色)被用作纖毛的過(guò)渡區(qū)標(biāo)記。細(xì)胞核用DAPI染色(藍(lán)色)桩匪。比例尺表示10 μm打瘪。附加圖像如圖S7所示。

我們進(jìn)一步分析了在四個(gè)簇中表達(dá)的頂級(jí)標(biāo)記基因傻昙，發(fā)現(xiàn)一些基因主要特異性地表達(dá)在其中一個(gè)簇中闺骚，例如，tectb在簇5,zpld1a在簇12,cal1b在簇0和簇7(圖3B, S3)妆档。功能富集分析顯示僻爽，上述4個(gè)細(xì)胞簇中表達(dá)的很多基因具有毛細(xì)胞相關(guān)的生物學(xué)功能(圖3C-F)，這表明這些細(xì)胞是毛細(xì)胞贾惦。為了進(jìn)一步確認(rèn)毛細(xì)胞的聚類和注釋胸梆，我們進(jìn)行了全載原位雜交(WISH)。zpld1a基因主要在嵴毛細(xì)胞中表達(dá)须板，根據(jù)我們的分析碰镜，嵴毛細(xì)胞被認(rèn)為位于簇12(圖3H)，這與之前的研究一致习瑰。至于簇0和7的細(xì)胞绪颖，雖然都是神經(jīng)肥大毛細(xì)胞，但它們之間存在差異甜奄。根據(jù)成熟和年輕毛細(xì)胞標(biāo)志物s100s和prox1a在兩個(gè)簇中的表達(dá)情況柠横，簇0的細(xì)胞被歸類為成熟神經(jīng)肥大毛細(xì)胞，簇7被歸類為年輕神經(jīng)肥大毛細(xì)胞(圖S4)贺嫂。

另一方面滓鸠，我們分析了支持細(xì)胞的標(biāo)記基因klf17，發(fā)現(xiàn)它主要表達(dá)在簇1的細(xì)胞中(圖S5)第喳，這表明這一簇細(xì)胞是支持細(xì)胞糜俗。同樣，我們還分析了據(jù)報(bào)道在套細(xì)胞中表達(dá)的基因，如tnfsf10悠抹、ponzr6珠月、pkhd1l1、fat1b楔敌、crb3b啤挎、cts12、ovgp1和cldne卵凑，發(fā)現(xiàn)高水平表達(dá)這些基因的細(xì)胞聚集在簇9中(圖S6)庆聘。然而，它們表達(dá)了一些已被證明在毛細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因勺卢，如myo6b伙判、myo7aa(圖S7)，這提出了它們是可以分化為毛細(xì)胞的支持細(xì)胞的可能性黑忱。因此宴抚，我們得出結(jié)論，來(lái)自簇1和9的細(xì)胞分別是支持細(xì)胞和套細(xì)胞甫煞，來(lái)自簇14的細(xì)胞可能是毛細(xì)胞祖細(xì)胞菇曲。

討論

在這項(xiàng)研究中，我們確定了三種導(dǎo)致常染色體隱性COD或CRD的POCIB突變抚吠。在一個(gè)家庭的兩個(gè)兄弟姐妹中常潮，兒童時(shí)期觀察到中心視力喪失，與進(jìn)行性錐體疾病一致;然而埃跷，在另一個(gè)兄弟姐妹和一個(gè)孤立的個(gè)體中蕊玷，從嬰兒早期就存在視力差和眼球震顫，提示一種形式的ACHM弥雹。后兩個(gè)人的視力也隨著時(shí)間的推移而惡化，其中一人在60歲時(shí)觀察到周圍視網(wǎng)膜變性延届。盡管由于CNGA3 (MIM) 600053)和CNGB3 (MIM 605080)突變剪勿，與ACHM或COD相關(guān)的基因存在重疊，但據(jù)我們所知方庭，沒有關(guān)于ACHM的自然史與外周變性有關(guān)的報(bào)道厕吉。POCIB是兩個(gè)POCI同源物之一，在脊椎動(dòng)物中作為高度保守的核心中心粒和基礎(chǔ)體成分械念，無(wú)脊椎動(dòng)物头朱，甚至還有萊茵衣單胞菌和嗜熱四膜蟲另一個(gè)由POCIA編碼的POC1同源物(先前的Pix2 [MIM 614783])顯示出與pocib相似的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)定位。對(duì)嗜熱四膜蟲的研究表明龄减，POCI蛋白對(duì)基底體的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性都是必不可少的项钮。耗盡研究表明，與POCIA不同，POCIB是纖毛發(fā)生所必需的烁巫，并且在poclb變形斑馬魚中描述了典型的纖毛病相關(guān)發(fā)育缺陷(如體軸彎曲署隘、腎囊腫和側(cè)邊缺陷)。有趣的是亚隙，也有報(bào)道稱它們的眼睛更小磁餐，但沒有進(jìn)行更詳細(xì)的眼科分析。

鑒于我們?cè)赑OCIB突變的受影響個(gè)體中觀察到的視網(wǎng)膜表型和poclb變形斑馬魚中報(bào)道的較小的眼睛阿弃，我們使用與Pearson等人使用的相同的翻譯阻斷MO來(lái)破壞poclb的表達(dá)诊霹。對(duì)眼睛中Poclb功能的準(zhǔn)確評(píng)估確實(shí)證實(shí)了該蛋白是正常視力所必需的，因?yàn)閜oclb缺失的斑馬魚與較小的眼睛一起顯示出嚴(yán)重降低的OKR(圖4C)渣淳。對(duì)變形眼的分析顯示脾还，錐體占主導(dǎo)地位的幼蟲視網(wǎng)膜中的光感受器外段長(zhǎng)度減少(圖4D和4E)。Poclb似乎存在于脊椎動(dòng)物光感受器的所有基體中水由，表明功能喪失同時(shí)影響桿細(xì)胞和錐細(xì)胞(圖4A;圖S3)荠呐。事實(shí)上，poclb的敲低降低了桿狀細(xì)胞和光轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)中重要蛋白的免疫反應(yīng)性(圖S4C)砂客。這與OKR試驗(yàn)中測(cè)量的poc1b變異體的視覺反應(yīng)降低相對(duì)應(yīng)泥张。用野生型人類POCIB mRNA實(shí)現(xiàn)了與這種表型相關(guān)的小眼睛的拯救。

本研究中發(fā)現(xiàn)的受影響的氨基酸在進(jìn)化中是中度或高度保守的(圖1C)鞠值，兩者都影響n端WD40結(jié)構(gòu)域(圖S1)媚创。第三個(gè)突變改變了外顯子7的剪接位點(diǎn)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)在最后一個(gè)WD40重復(fù)序列中被截?cái)嗤瘛＿@個(gè)WD40結(jié)構(gòu)域钞钙，而不是POCI的c端區(qū)域，已經(jīng)被證明足以靶向POC1定位到中心粒事實(shí)上声离，正如之前報(bào)道的那樣芒炼，野生型POCIB定位于基底體，而p.n gln67del和p.a g106pro變體POCIB顯示與纖毛基底體的關(guān)聯(lián)缺失(圖3)术徊。斑馬魚中變異對(duì)Poc1b的影響是通過(guò)同時(shí)注射攜帶任何一個(gè)突變的Poc1b MO和人的Poc1b mRNA來(lái)解決的本刽。與共注射野生型mRNA相比，共注射突變mRNA不能誘導(dǎo)(部分)恢復(fù)眼部表型赠涮，證實(shí)了變異氨基酸殘基對(duì)視網(wǎng)膜的干擾作用(圖4B)子寓。

為了進(jìn)一步了解POCIB的視網(wǎng)膜功能，我們旨在通過(guò)在視網(wǎng)膜cDNA文庫(kù)的酵母中使用基于gal4的相互作用陷阱篩選來(lái)鑒定與POCIB相互作用的視網(wǎng)膜蛋白笋除。在采用的四個(gè)不同的POC1B誘餌片段中斜友，僅發(fā)現(xiàn)線圈-線圈區(qū)域產(chǎn)生一個(gè)重要的相互作用:FAM161A。有趣的是垃它，F(xiàn)AM161A的突變導(dǎo)致另一種視網(wǎng)膜纖毛病鲜屏，常染色體隱性RP (RP28)烹看。通過(guò)共免疫沉淀和共定位研究證實(shí)了FAM161A的結(jié)合(圖5)。盡管最初是用含有POCIB卷曲區(qū)域的片段檢測(cè)到這種相互作用墙歪，但在全長(zhǎng)蛋白的WD40結(jié)構(gòu)域引入兩個(gè)POCIB變體听系，強(qiáng)烈降低了它與FAM161A的相互作用。重申了該結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上的重要性虹菲。由于FAM161A被發(fā)現(xiàn)是一種視網(wǎng)膜-纖毛病相關(guān)蛋白靠胜，我們觀察到與這種視網(wǎng)膜特異性蛋白相互作用的減少可能會(huì)導(dǎo)致CRD患者POCIB突變導(dǎo)致桿狀光感受器變性。

Pearson等人的研究表明毕源，在缺乏Pocib的情況下浪漠，斑馬魚呈現(xiàn)出各種表型，這些表型指向綜合征性纖毛病相比之下霎褐，本研究中發(fā)現(xiàn)的POC1B突變與兩個(gè)家族中更溫和的非綜合征性錐體病表型相關(guān)址愿。盡管物種特異性差異可能導(dǎo)致了觀察到的表型異質(zhì)性，但基于所發(fā)現(xiàn)的突變類型和組合冻璃，以及改變的POCIB與視網(wǎng)膜特異性FAM161A之間減少(但并非沒有)的相互作用响谓，我們有理由得出結(jié)論，COD個(gè)體具有殘留的POCIB活性省艳。因此娘纷，更嚴(yán)重和/或功能喪失的POCIB突變組合可能與視網(wǎng)膜纖毛病的綜合征形式有關(guān)，這與先前在另一種纖毛病相關(guān)基因CEP290 (MIM)中觀察到的廣泛疾病譜系一致跋炕。

結(jié)論

總之赖晶，WES在兩個(gè)不相關(guān)的常染色體隱性非綜合征性COD或CRD家族中發(fā)現(xiàn)了POCIB突變。這些變異被發(fā)現(xiàn)破壞睫狀基底體蛋白POCIB及其與視網(wǎng)膜特異性rp相關(guān)蛋白FAM161A的相互作用辐烂。鑒于斑馬魚POCIB缺失進(jìn)一步導(dǎo)致早發(fā)性視網(wǎng)膜功能障礙遏插，本研究強(qiáng)調(diào)了一種包含POCIB和FAM161A的基礎(chǔ)體蛋白光感受器模塊，這是光感受器穩(wěn)態(tài)所必需的纠修。

基金：本研究由抗盲基金會(huì)資助(授予BR-GE-0510-04890RAD給A.l.d.H, c.c mm -0811-0547- rad03給H.K.和E.v.W, C-CMM-0811-0546RADO2給r.r.,C-GE-0811-0545-RADO1給EP.M.C), A.I.d.H和R . WJ.Collin);荷蘭預(yù)防失明協(xié)會(huì);蓋爾德蘭盲人基金會(huì):國(guó)家盲人和視障人士基金會(huì);盲人獎(jiǎng)?wù)禄饡?huì);黃斑變性基金會(huì);鹿特丹斯布林貝朗根(EP.M.C)和C.C.W.K.);荷蘭衛(wèi)生研究與發(fā)展組織(授予Vici016.130.664給r.r.,Veni-91613008給H.H.A, Veni016.136.091給E.v.W);荷蘭衛(wèi)生研究與發(fā)展組織(ZonMW E-rare贈(zèng)款40-4290)-981006 (E.v.W);歐洲共同體第七框架方案FP7/2009(贈(zèng)款協(xié)議241955 SYSCILIA給香港和r.r.r.);以及Radboudumc的機(jī)構(gòu)博士資助H.H.A.

本文章原文：The American Journal of Human Genetics 95, 131–142, August 7, 2014

詳細(xì)網(wǎng)址：http://dx.doi.org/10.1016/j.ajhg.2014.06.012

注：因文章篇幅有限胳嘲，所有相關(guān)引用文獻(xiàn)，以及補(bǔ)充圖扣草、表可以點(diǎn)擊至原文查閱胎围。