雜志：ENVIRONMENTAL SCIENCE & TECHNOLOGY

影響因子：11.4（2022）

年份：2022

通訊作者： Ting Xu

通訊作者單位：Key Laboratory of Yangtze River Water Environment, Ministry of Education, College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China.

Shanghai Institute of Pollution Control and Ecological Security, Shanghai 200092, China.

摘要

適當(dāng)?shù)囊曈X功能對(duì)于收集環(huán)境信息和支持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的決策至關(guān)重要，因此與野生動(dòng)物的生存和人類健康密切相關(guān)派敷。據(jù)報(bào)道，多溴二苯醚（PBDEs）會(huì)損害斑馬魚的視力發(fā)育撰洗，而甲狀腺激素（TH）信號(hào)通路被懷疑是主要的貢獻(xiàn)者篮愉。本研究選擇五溴化PBDE BDE-99，進(jìn)一步探討多溴二苯醚對(duì)斑馬魚色覺破壞的作用機(jī)制差导。結(jié)果表明试躏，BDE- 99在受精后120 h可損害視網(wǎng)膜中的多個(gè)光感受器，干擾斑馬魚幼蟲在色視引導(dǎo)下的行為设褐。雖然由此產(chǎn)生的光感受器模式的改變與3,3’颠蕴，5-三碘-L-甲狀腺素的作用高度相似，但引入TH受體的拮抗劑并不能完全恢復(fù)這種改變助析，這表明參與了其他潛在的調(diào)節(jié)因素的參與犀被。通過(guò)調(diào)節(jié)中波長(zhǎng)視蛋白的關(guān)鍵誘導(dǎo)劑Six7的表達(dá)，我們證明了Six7在BDE-99的破壞中主導(dǎo)了光感受器模式外冀，而不是THs寡键。我們的工作促進(jìn)了對(duì)Six7在光感受器模式形成過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用的理解，并提出了多溴二苯醚視覺毒性的新機(jī)制雪隧。

關(guān)鍵詞：BDE-99西轩，視力障礙，光感受器模式脑沿，甲狀腺激素信號(hào)傳導(dǎo)藕畔，Six7

背景

多溴二苯醚（PBDEs）在其商業(yè)產(chǎn)品被禁止之前，一直是世界上使用最廣泛的溴化阻燃劑庄拇。由于多溴二苯醚具有優(yōu)越的化學(xué)穩(wěn)定性注服，因此仍可在人類生活環(huán)境中廣泛檢測(cè)到，包括飲用水、室內(nèi)空氣祠汇、和日常食物仍秤，通過(guò)多種暴露途徑對(duì)人類構(gòu)成嚴(yán)重的健康風(fēng)險(xiǎn)。其典型的同族物質(zhì)之一可很，2诗力、2‘、4我抠、4’苇本、5-五溴化二苯醚（BDE- 99）是商業(yè)penta-PBDEs的主要成分（占42?48%），在同族物質(zhì)中具有最強(qiáng)的生物積累能力菜拓。盡管BDE- 99在地表水中普遍較低瓣窄，但在某些特定情況下，如城市污水系統(tǒng)纳鼎，其濃度可達(dá)到μg/L的水平俺夕。PBDE暴露與糖尿病和肥胖等代謝性疾病以及人群中閱讀能力下降、認(rèn)知和記憶能力下降等神經(jīng)發(fā)育缺陷密切相關(guān)贱鄙。人們普遍認(rèn)為劝贸，多溴二苯醚的毒性機(jī)制主要是與甲狀腺激素（THs）類似，不僅因?yàn)樗鼈兊慕Y(jié)構(gòu)相似逗宁，而且還因?yàn)樗鼈児蚕淼拇x酶脫碘酶映九。

視力障礙是多溴二苯醚的一種標(biāo)志性的新興毒理學(xué)效應(yīng)。斑馬魚由于其在幼蟲階段成熟的四色視覺瞎颗，是此類研究的典型模式生物件甥。BDE-47（四溴化）、BDE-209（脫溴化）哼拔、DE-71（商業(yè)混合物）及其代謝物可誘導(dǎo)斑馬魚幼蟲視網(wǎng)膜形態(tài)變化引有，光感受器細(xì)胞是視網(wǎng)膜細(xì)胞中受影響最大的部分。視網(wǎng)膜（視蛋白）和晶狀體（晶體蛋白）中的核心功能蛋白也可能是BDE-47和BDE-209的靶點(diǎn)管挟。據(jù)報(bào)道轿曙，BDE-47和DE-71可以改變斑馬魚幼魚的視覺引導(dǎo)行為，包括光動(dòng)力學(xué)反應(yīng)（OKRs）僻孝、視動(dòng)反應(yīng)和逃避反應(yīng)导帝。一個(gè)有趣的現(xiàn)象是，BDE-47暴露顯著降低了斑馬魚幼蟲對(duì)藍(lán)光刺激的反應(yīng)穿铆，這表明幼蟲的色覺也受到了干擾您单。視覺功能受損往往會(huì)導(dǎo)致無(wú)法覓食和逃避野生動(dòng)物的危險(xiǎn)，因此降低個(gè)體的存活率和影響種群的連續(xù)性荞雏。對(duì)于人類來(lái)說(shuō)虐秦，視覺功能障礙和病理除了有不方便的行為外平酿，還與一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)疾病，包括藥物成癮和神經(jīng)退行性變有因果關(guān)系悦陋。在阿爾茨海默病患者中蜈彼，視力退化和色覺障礙的普遍癥狀早于記憶喪失和殘疾。

在顯微鏡下俺驶，色覺的建立依賴于不同光感受器的編程模式幸逆，其特征通常是視覺視蛋白的不同表達(dá)。巧合的是暮现，THs及其受體（通過(guò)TH信號(hào)）是眼睛發(fā)育和光感受器模式調(diào)節(jié)器的關(guān)鍵參與者还绘。一般來(lái)說(shuō)，TH信號(hào)的作用可以明顯地誘導(dǎo)錐體視蛋白分化為最長(zhǎng)波長(zhǎng)（LW）敏感的亞型栖袋。在TH受體β（THRβ）缺陷的人視網(wǎng)膜類器官中拍顷，LW視蛋白幾乎沒(méi)有分化；而短波長(zhǎng)（SW）和中波長(zhǎng)（MW）視蛋白被外源性3塘幅、3‘昔案，5-Triiodo-L-甲狀腺素（T3）治療抑制。在T3處理的和甲狀旁腺斑馬魚幼蟲中也觀察到類似的結(jié)果电媳。對(duì)于大多數(shù)沒(méi)有紅色錐體的哺乳動(dòng)物來(lái)說(shuō)爱沟，比如老鼠，T3主導(dǎo)著綠色錐體的發(fā)育匆背。然而，除了TH信號(hào)外身冀，光感受器模式還由復(fù)雜的調(diào)節(jié)因子協(xié)調(diào)钝尸。例如，正弦眼同源盒(Six)家族的轉(zhuǎn)錄因子深入?yún)⑴c了視覺系統(tǒng)的發(fā)育搂根，其中一個(gè)成員射線發(fā)現(xiàn)特異性six 7在硬骨魚的MW錐分化中發(fā)揮了重要作用珍促。敲除six 7基因完全消除了MW視蛋白的表達(dá)，但上調(diào)了斑馬魚幼蟲視網(wǎng)膜中LW視蛋白的表達(dá)剩愧。Mackin等報(bào)道猪叙，外源性T3處理可顯著抑制six 7的表達(dá)，這表明TH信號(hào)與six 7之間的潛在關(guān)系仁卷。全面了解多溴二苯醚和其他環(huán)境污染物的視力損害也需要考慮這些潛在的因素穴翩。

本研究選擇BDE-99研究多溴二苯醚對(duì)斑馬魚幼蟲視覺系統(tǒng)的潛在影響，發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)視蛋白o(hù)pn1lw1锦积，但抑制所有其他錐體視蛋白芒帕。通過(guò)干預(yù)相關(guān)調(diào)控因素，我們發(fā)現(xiàn)BDE-99對(duì)幼蟲光感受器模式的干擾主要是通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子six 7而不是TH信號(hào)丰介，這為多乙二苯醚誘導(dǎo)的視覺障礙和TH模擬在多乙二苯醚毒性中的作用提供了新的線索背蟆。

材料和方法

化學(xué)品BDE-99（99.1%鉴分，CAS#60348-60-9）購(gòu)自Accusparel（美國(guó)）。TR拮抗劑1（TRA1,98.89%带膀，CAS#500794-88-7）和T3（≥97%志珍，CAS#5817-39-0）分別來(lái)自med化學(xué)快遞公司（瑞典）和Yuanye生物技術(shù)公司（中國(guó)）。二甲基亞砜（DMSO垛叨，≥99.5%伦糯，CAS#67-68-5）購(gòu)自Sigma-Aldrich（美國(guó)）。

斑馬魚（AB菌株）來(lái)自上海FishBio有限公司（中國(guó)）点额，并保持如前所述舔株。產(chǎn)卵后，將大約50個(gè)正常發(fā)育的胚胎移植出去还棱，并在3小時(shí)內(nèi)暴露在一個(gè)60毫米的玻璃培養(yǎng)皿中载慈。根據(jù)初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果，測(cè)定BDE-99的最終暴露濃度分別為5和50μg/L（含0.01% DMSO和10%無(wú)菌Hanks緩沖溶液）珍手。暴露時(shí)間為受精后3h（hpf）至120 hpf办铡，每天記錄胚胎的死亡率和畸形率。T3和TRA1暴露溶液的制備和暴露設(shè)計(jì)與BDE-99相同琳要。T3（4和20 nM）和TRA1（50 nM）的劑量參照之前的研究和我們的初步實(shí)驗(yàn)寡具。所有暴露處理均重復(fù)3次。

BDE-99濃度的定量分析

暴露濃度的量化是基于我們之前的研究進(jìn)行了修改稚补。加入BDE-100（CAS#189084-64-8童叠，美國(guó)）作為內(nèi)標(biāo)。采用正己烷進(jìn)行液體?液體萃取课幕，提取BDE-99和BDE-100厦坛。然后將提取物在溫和的氮流下濃縮，并用異辛烷進(jìn)行重組乍惊。在檢測(cè)前將BDE-47（CAS#5436-43-1杜秸，Accuspem，US）加入到重組溶液中润绎，以校準(zhǔn)注入引起的誤差撬碟。使用安捷倫7890A-HP-5毛細(xì)管柱（安捷倫技術(shù)，美國(guó)）分離不同的多溴二苯醚莉撇，并使用μECD檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定呢蛤。HP-5柱的初始溫度為150°C，持續(xù)1 min棍郎，20°C/min上升到200°C顾稀，5°C/min上升到250°C，最后保持12 min坝撑。注射器和探測(cè)器的溫度分別為260°C和290°C静秆。在添加濃度為5 μg/L時(shí)粮揉，BDE-99的回收率為88.7%（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為6.5%）。BDE-99的檢測(cè)限（LOD）定義為信噪比的3倍抚笔，LOD值為0.2 μg/L扶认。

視覺引導(dǎo)的行為測(cè)試

趨光性試驗(yàn)是根據(jù)以往的研究進(jìn)行的。OKR測(cè)試和運(yùn)動(dòng)測(cè)試分別在VisioBox平臺(tái)（法國(guó)視點(diǎn)）和Zebrabox平臺(tái)（法國(guó)視點(diǎn)）上進(jìn)行殊橙，如前所述辐宾。

RNA提取和qRT-PCR分析

暴露處理后，用TRIzol試劑（Invitrogen膨蛮，US）提取約30只幼蟲的總RNA叠纹，然后按照制造商的說(shuō)明使用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（ABI，US）合成cDNA敞葛。使用PowerUp SYBR GreenMix（應(yīng)用生物系統(tǒng)誉察，美國(guó)）在7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（應(yīng)用生物系統(tǒng)，美國(guó)）上進(jìn)行了定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）惹谐。目的基因包括視覺感知和TH信號(hào)通路相關(guān)基因持偏，管家基因?yàn)棣?actin。采用2?ΔΔCT方法來(lái)量化基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平氨肌。每個(gè)治療組分別進(jìn)行了3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)鸿秆。

冷凍切片的制備及H&E染色

暴露結(jié)束時(shí)，用4%多聚甲醛在4°C下固定幼蟲過(guò)夜怎囚。然后卿叽，將幼蟲在分級(jí)的蔗糖（10、15和20%）中脫水恳守，最后在20%的蔗糖中浸泡過(guò)夜附帽。樣品用O.C.T化合物（服務(wù)生物，中國(guó)）包埋井誉，然后使用冷凍星NX50（賽默飛世爾科學(xué)公司，美國(guó)）以10 μm的厚度進(jìn)行冷凍和切片整胃。冷凍切片用蘇木精染色8 min颗圣，伊紅染色3 min，然后用乙醇洗滌屁使。這些圖像是使用奧林巴斯CX33生物顯微鏡（奧林巴斯在岂，日本）拍攝的。使用ImageJ軟件計(jì)算視網(wǎng)膜不同層的尺寸蛮寂。

TUNEL染色

簡(jiǎn)單地說(shuō)蔽午，使用DeadEnd熒光TUNEL系統(tǒng)（Promega，美國(guó)酬蹋，美國(guó)）進(jìn)行TUNEL染色及老。染色后抽莱，冷凍切片用4‘，6-二胺氨基-2-苯乙烯基（Beyotime骄恶，中國(guó)）覆蓋食铐。使用奧林巴斯IX71熒光顯微鏡（奧林巴斯，日本）捕獲圖像僧鲁，并使用ImageJ對(duì)圖像中的熒光區(qū)域進(jìn)行量化虐呻。

對(duì)斑馬魚中six7表達(dá)的調(diào)節(jié)

分別通過(guò)Crispr/Cas9系統(tǒng)和重建的質(zhì)粒載體建立了six7敲除和過(guò)表達(dá)的斑馬魚模型。關(guān)于這些突變斑馬魚所使用的sgRNA和質(zhì)粒的詳細(xì)信息在支持信息附錄寞秃，實(shí)驗(yàn)部分中提供斟叼。將重建質(zhì)粒載體合成的sgRNA和6個(gè)7mRNA顯微注射到野生型（WT）斑馬魚胚胎中，進(jìn)入單細(xì)胞階段春寿。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)都按照WT模型進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)朗涩。

分子對(duì)接

基于NCBI參考序列（NP_571415.1），利用瑞士在線建模服務(wù)器（http://swissmodel.expasy.org/）構(gòu)建了THRβ [ Danio rerio]的同源建模堂淡，并進(jìn)行了優(yōu)化馋缅。然后使用AutoDock Vina進(jìn)行分子對(duì)接，預(yù)測(cè)三種成分[BDE-99绢淀、T3和全反式維甲酸（RA）]與THRβ的結(jié)合模式和親和力萤悴，設(shè)置如前所述。

統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均以均值的平均±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM）表示皆的。采用單因素方差分析覆履，然后采用事后Dunnett的T3多重比較檢驗(yàn)來(lái)確定多個(gè)數(shù)據(jù)集之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（SPSS 22.0，IBM费薄，US）硝全。p值<為0.05被認(rèn)為為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

BDE- 99的暴露濃度和急性毒性

暴露5天后楞抡，5μg/L（實(shí)際濃度為4.08 ± 0.15 μg/L）組和50μg/L（實(shí)際濃度為43.1414±0.84μg/L）組BDE-99暴露濃度分別下降至標(biāo)稱濃度的14.5%和12.3%伟众。相比之下，在無(wú)胚胎的玻璃培養(yǎng)皿中召廷，BDE-99的濃度沒(méi)有明顯的變化凳厢。結(jié)果顯示，5和50 μg/L BDE-99均未導(dǎo)致斑馬魚幼蟲的明顯死亡或畸形竞慢。

BDE-99使斑馬魚幼蟲的視覺功能受損

雖然BDE-99暴露后總游泳距離沒(méi)有變化（圖1A先紫，B），但在50 μg/L BDE-99組中筹煮，斑馬魚幼蟲的趨光行為受到顯著抑制（p=0.027）（圖1C）遮精。趨光性是斑馬魚幼魚在受到光刺激時(shí)的一種先天行為。綜合結(jié)果表明败潦，斑馬魚具有光感應(yīng)受損的功能和完整的運(yùn)動(dòng)能力本冲。OKR是斑馬魚的注視穩(wěn)定行為准脂，已被廣泛用于模型生物中隱性視覺缺陷的篩選。因此眼俊，我們采用經(jīng)典的OKR檢驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)估了斑馬魚幼蟲的視覺功能意狠。暴露于對(duì)照、5和50 μg/L BDE-99的幼蟲平均每分鐘眼跳分別為11 ± 2.5疮胖、8.5 ± 1.8和6.8±2.0（圖1D）环戈。BDE-99導(dǎo)致眼跳運(yùn)動(dòng)減少，證實(shí)了斑馬魚幼蟲的視覺功能明顯受損澎灸。

圖1 BDE-99對(duì)斑馬魚幼蟲視覺引導(dǎo)行為的影響院塞。(A)運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)中斑馬魚幼蟲每分鐘游動(dòng)距離。陰影表示SEM性昭。(B)每10 min光/暗期的總游泳距離拦止。(C)去除隔板5或10 min后，斑馬魚幼蟲從黑暗室游到光室的百分比糜颠。(D)旋轉(zhuǎn)條紋鼓刺激斑馬魚幼蟲的眼跳運(yùn)動(dòng)汹族。箱形圖顯示了第25、第50和第75個(gè)百分位數(shù)的移動(dòng)其兴。虛線表示平均值顶瞒。誤差條用SEM表示。*表示p < 0.05元旬，**表示p < 0.01榴徐。

BDE-99誘導(dǎo)視網(wǎng)膜光感受器損傷

視覺引導(dǎo)行為的改變可能暗示了幼蟲視覺系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)損傷。為了驗(yàn)證這一假設(shè)匀归，我們準(zhǔn)備并觀察了幼蟲視網(wǎng)膜的組織學(xué)切片坑资。在5 μg/L BDE-99處理組的視網(wǎng)膜中沒(méi)有觀察到明顯的形態(tài)學(xué)變化，而在暴露在50 μg/L BDE-99組的切片中穆端，發(fā)現(xiàn)光感受器細(xì)胞層的厚度顯著下降（p=0.049）（圖2A袱贮，B）。采用TUNEL染色法檢測(cè)幼蟲視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況体啰。兩種治療組視網(wǎng)膜中均可見TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞攒巍，凋亡區(qū)域呈濃度依賴性的顯著升高，而對(duì)照組很少發(fā)生凋亡（圖2C狡赐，D）。在斑馬魚的視網(wǎng)膜中有幾個(gè)細(xì)胞亞類钦幔，包括感光細(xì)胞枕屉、雙極細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞鲤氢、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞搀擂。為了確定BDE-99發(fā)生破壞的位置西潘，我們測(cè)試了特定亞類的標(biāo)記。結(jié)果表明哨颂，50 μg/L BDE-99顯著降低了gnat2（錐體光感受器標(biāo)記物0.62倍喷市，p < 0.05）和vsx1（雙極細(xì)胞0.77倍，p < 0.05）的相對(duì)mRNA表達(dá)威恼。在BDE-99暴露后品姓，錐形光感受器是視網(wǎng)膜中受影響最大的細(xì)胞亞類。

圖2 BDE-99致視網(wǎng)膜損傷箫措。斑馬魚幼魚視網(wǎng)膜的(A) H&E染色（bar = 2 μm）腹备。簡(jiǎn)稱：PCL、感光細(xì)胞層斤蔓；INL植酥、內(nèi)核層、IPL弦牡、內(nèi)叢狀層友驮；以及GCL、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層驾锰。(B)視網(wǎng)膜每層厚度的統(tǒng)計(jì)分析卸留。(C)左圖，視網(wǎng)膜TUNEL染色（bar = 5 μm）稻据。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞用亮綠色熒光染色艾猜。右圖，染色區(qū)域的統(tǒng)計(jì)分析捻悯。(D)BDE-99暴露后視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物的變化匆赃。誤差條用SEM表示。*表示p < 0.05今缚，**表示p < 0.01算柳，***表示p < 0.001。

BDE-99改變的光感受器模式類似于T3的作用

斑馬魚具有5種感光細(xì)胞姓言，每種細(xì)胞特異性表達(dá)1 ~ 4種不同的視蛋白瞬项。通常，視覺視蛋白的基因表達(dá)譜被用作光感受器模式的反映何荚。在這里囱淋，我們測(cè)量了6個(gè)錐狀視蛋白，包括opn1sw1餐塘、opn1sw2妥衣、opn1mw1、opn1mw2、opn1lw1税手、opn1lw2（極低表達(dá)的opn1mw3和opn1mw4除外）和1個(gè)桿狀視蛋白（視紫質(zhì)蜂筹，即rho）。BDE-99暴露對(duì)除最長(zhǎng)波長(zhǎng)敏感的視蛋白o(hù)pn1lw1外的所有視蛋白均有顯著的抑制作用（圖3A）芦倒。使用我們改進(jìn)的多色OKR測(cè)試艺挪，我們發(fā)現(xiàn)暴露的幼蟲對(duì)綠色和藍(lán)光的眼跳反應(yīng)下降（圖3B）。有趣的是兵扬，BDE-99改變的模式類似于TH T3（圖3C麻裳，D)。T3對(duì)錐體視蛋白表達(dá)的影響表現(xiàn)出與BDE-99完全相同的模式（圖3A）周霉，但T3不影響視紫紅質(zhì)的表達(dá)掂器。

THs參與了視覺的發(fā)育和功能。特別是T3強(qiáng)烈引導(dǎo)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化為L(zhǎng)W錐細(xì)胞俱箱，并誘導(dǎo)opn1lw1的表達(dá)国瓮。暴露于20 nM的T3使opn1lw1的表達(dá)顯著上調(diào)約12倍，而其他錐體視蛋白的表達(dá)從0.28倍降低到0.56倍狞谱。與錐體視蛋白表達(dá)一致乃摹，t3處理的斑馬魚幼蟲對(duì)短時(shí)間和MW光譜刺激表現(xiàn)出抑制反應(yīng)（圖3B）。同時(shí)跟衅，我們還檢測(cè)了BDE-99對(duì)TH信號(hào)通路相關(guān)基因的影響孵睬。BDE-99的μg/L顯著上調(diào)了參與T4脫碘到T3的酶dio2的表達(dá)，并輕微下調(diào)了thrb的表達(dá)伶跷，證實(shí)了TH信號(hào)的穩(wěn)態(tài)被破壞（圖3E）掰读。

圖3 BDE-99暴露影響了幼蟲的光感受器模式、視覺引導(dǎo)行為和TH信號(hào)傳導(dǎo)叭莫。(A)BDE-99暴露后視蛋白表達(dá)的變化蹈集。(B) BDE-99暴露后斑馬魚幼魚的OKR。（C雇初，D）T3的作用與BDE-99非常相似拢肆。(E)BDE-99暴露后，TH信號(hào)的部分基因發(fā)生了改變靖诗。誤差條用SEM表示郭怪。*表示p < 0.05，**表示p < 0.01刊橘，***表示p < 0.001鄙才。

TH信號(hào)通路不足以解釋BDE-99的作用

為了進(jìn)一步驗(yàn)證BDE-99對(duì)光感受器模式的影響是否與T3類似，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)系統(tǒng)中引入了TRA1促绵。TRA1通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地與THRα和THRβ結(jié)合來(lái)拮抗thr介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)攒庵。因此据途，它應(yīng)該挽救BDE-99暴露引起的相關(guān)變化。TRA1與BDE-99共處理后叙甸，三個(gè)錐體視蛋白和視紫質(zhì)的表達(dá)有恢復(fù)的趨勢(shì)，但對(duì)opn1mw1位衩、opn1mw2和opn1sw2沒(méi)有影響（圖4A裆蒸；支持信息圖S6）。結(jié)果表明糖驴，BDE-99的作用還涉及除THs外的一些潛在因素僚祷。例如，它們可能包括轉(zhuǎn)錄因子67贮缕，這是斑馬魚中分子量視蛋白的主要誘導(dǎo)劑辙谜。31在OKR試驗(yàn)中，在被BDE-99顯著抑制的兩組中感昼，TRA1的引入增加了幼蟲的眼跳反應(yīng)（圖4B）装哆。然而，與最初的BDE-99僅暴露于綠色（MW）光下相比定嗓，TRA1增加的反應(yīng)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義蜕琴。此外，分子對(duì)接的結(jié)果表明宵溅，BDE-99與THRβ的結(jié)合態(tài)度并不類似于T3凌简，但更像是RA，一種被懷疑是SW視蛋白的抑制劑（圖4C）恃逻。

考慮到six7在MW視蛋白中的作用雏搂，我們也研究了six7表達(dá)的可能變化。雖然BDE-99和T3暴露導(dǎo)致sie7的表達(dá)降低寇损，但BDE-99的作用機(jī)制可能獨(dú)立于TH信號(hào)凸郑，因?yàn)門RA1幾乎沒(méi)有改變BDE-99的影響（圖4D）。

圖4 TRA1未能完全挽救BDE-99引起的光感受模式润绵。(A)TRA1對(duì)視蛋白表達(dá)水平的影響线椰。星號(hào)表示與BDE-99暴露量相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TRA1對(duì)斑馬魚幼蟲OKRs的(B)影響尘盼。陰影代表了對(duì)照組中幼蟲的眼跳運(yùn)動(dòng)憨愉。與T3相比，BDE-99與THRβ的(C)結(jié)合位點(diǎn)更接近于全反式RA卿捎。(D)BDE-99配紫、T3和TRA1對(duì)轉(zhuǎn)錄因子six7的影響，這是分子量視蛋白的關(guān)鍵調(diào)控因子午阵。*表示p < 0.05躺孝，**表示p < 0.01享扔，***表示p < 0.001。

six7主導(dǎo)了BDE-99的受干擾的光感受器模式

為了揭示six7和THs在BDE-99誘導(dǎo)的光感受器模式中的作用植袍，我們調(diào)節(jié)了斑馬魚幼魚中six7的表達(dá)惧眠，構(gòu)建了敲除（six7 KD）和過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因（six7 tg）突變模型，由于注射質(zhì)粒劑量低于个，six7 tg模型的效果一般較溫和氛魁。以T3為陽(yáng)性對(duì)照。在圖5A中厅篓，與WT斑馬魚相比秀存，T3處理使six7 KD突變體中opn1lw1的表達(dá)顯著增加了35倍，這強(qiáng)烈表明six7的存在抑制了T3的原始作用羽氮。BDE-99與6個(gè)7KD模型暴露后或链，在LW/MW視蛋白和SW視蛋白之間表現(xiàn)出不同的結(jié)果（圖5B）。BDE-99暴露后档押，SW視蛋白仍發(fā)生變化澳盐，表明SW視蛋白的變化獨(dú)立于six7。此外令宿，在所有模型中洞就，T3均顯著抑制了除opn1lw1外的所有其他錐體視蛋白，而BDE-99則部分抵消了six7 tg模型中six7過(guò)表達(dá)的影響掀淘。

考慮到Six亞家族（包括six3旬蟋、6和7）之間的親緣關(guān)系，進(jìn)一步研究了暴露后這些基因的變化革娄。我們的敲除操作是轉(zhuǎn)錄后的倾贰；因此，在six KD模型中six的上調(diào)對(duì)于某種補(bǔ)償機(jī)制是合理的拦惋。過(guò)表達(dá)six導(dǎo)致six輕微（但顯著）上調(diào)匆浙，這可能是注射質(zhì)粒含量低的原因（圖5C）。簡(jiǎn)而言之厕妖，BDE-99和T3對(duì)six3亞家族的影響存在明顯的差異（圖5C首尼，D）。six7表達(dá)的缺失并沒(méi)有改變斑馬魚six6的表達(dá)言秸；然而软能，BDE-99暴露強(qiáng)烈刺激了six6b的表達(dá)。有趣的是举畸，在WT模型中查排，T3暴露幾乎抑制了除兩個(gè)six6個(gè)基因外的所有six成員。six6b可能是在MW視蛋白調(diào)控中具有six7功能的輔助因子抄沮。six7 tg模型中MW視蛋白水平不變可能與six6b表達(dá)下調(diào)有關(guān)（圖5A跋核，C）岖瑰。

圖5 six7調(diào)節(jié)對(duì)視覺視蛋白和six3亞家族的影響。(A)用T3處理的six7個(gè)突變體的視覺視蛋白的模式砂代。(B)用BDE-99處理的six7個(gè)突變體的視覺視蛋白的模式蹋订。(C)用T3處理的six7個(gè)突變體中six3亞家族的模式。(D)用BDE-99處理的six7個(gè)突變體中six3亞家族的模式刻伊。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義是用用不同的字母標(biāo)記的列來(lái)表示的辅辩。

圖6 BDE-99致視覺毒性不良結(jié)局途徑的框架示意圖。

討論

該視覺系統(tǒng)已被報(bào)道為環(huán)境污染物的一個(gè)新目標(biāo)娃圆，如多環(huán)芳烴，雙酚蛾茉、多溴二苯醚讼呢、和其他替代阻燃劑。在視覺系統(tǒng)的各種組成部分中谦炬，具有相應(yīng)視蛋白的光感受器對(duì)外來(lái)生物暴露最為敏感悦屏。在本研究中，5和50 μg/L BDE-99處理組均觀察到視蛋白的破壞键思，BDE-99對(duì)opn1lw1的誘導(dǎo)作用呈劑量依賴性(圖3A, S2)础爬。視蛋白是一組具有不同光譜敏感性的感光蛋白，視蛋白的遺傳缺陷往往會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的色盲/色弱吼鳞。有趣的是看蚜，我們改進(jìn)的OKR測(cè)試顯示，低劑量或高劑量BDE-99處理的幼蟲對(duì)藍(lán)綠光刺激的眼跳反應(yīng)下降（圖3B）赔桌，這與BDE-99誘導(dǎo)的SW和MW視蛋白的下調(diào)相一致供炎。然而，對(duì)紅光刺激的眼跳反應(yīng)保持不變（圖3B）疾党，我們認(rèn)為原因可能是斑馬魚LW視蛋白的峰值光譜吸光度遠(yuǎn)短于紅光的波長(zhǎng)音诫。在現(xiàn)有的研究中，不同的PBDE同系物表現(xiàn)出了以不同方式干擾斑馬魚幼蟲的光感受器模式的潛力雪位。在用BDE-47處理的幼蟲中也發(fā)現(xiàn)了類似的光感受器和色覺的破壞模式竭钝。它們的結(jié)果之間的差異在于，BDE-47易受SW視蛋白的影響雹洗，而幼蟲OKR對(duì)綠光的反應(yīng)相對(duì)較溫和香罐。然而，BDE-209對(duì)斑馬魚幼蟲視蛋白的作用完全不同时肿，即低劑量刺激了各種視蛋白的表達(dá)穴吹，而高劑量則導(dǎo)致了相反的變化趨勢(shì)∈任辏考慮到BDE-209微妙的微妙生物利用度港令，我們估計(jì)BDE-209對(duì)斑馬魚光感受器模式的影響可能不是主要影響啥容。

核受體經(jīng)常參與污染物引起的視覺損傷。例如顷霹，2-乙基己基二苯磷酸通過(guò)阻斷RA受體和視黃醛X受體導(dǎo)致日本青鳉的眼睛畸形和視力障礙咪惠。芳基烴受體的激活也被懷疑與視力障礙有關(guān)。然而淋淀，55多溴二苯醚因其類似于THs的毒理學(xué)作用模式而眾所周知遥昧，這已被許多先前的研究證實(shí)。由于通過(guò)TH信號(hào)的THs和/或THRs在光感受器模式和色覺形成中是必不可少的朵纷，BDE-99暴露的后果可能是由于TH信號(hào)的中斷炭臭，而BDE-99和T3暴露之間的相似性似乎證實(shí)了這一假設(shè)（圖3A，C）袍辞。然而鞋仍，除了TH信號(hào)外，其他因素可能參與了BDE-99的視覺毒性搅吁，因?yàn)門RA1拮抗并不能完全恢復(fù)光感受器模式的干擾威创。我們的分子對(duì)接分析也表明，BDE-99和THRβ聯(lián)合使用不太可能作為T3對(duì)THRβ產(chǎn)生強(qiáng)有力的激動(dòng)作用谎懦，USEPA Comptox數(shù)據(jù)庫(kù)和之前的一些研究也提供了類似的結(jié)果肚豺。

作為斑馬魚分子量視蛋白的主要調(diào)節(jié)因子，six7在本研究中對(duì)光感受器模式表現(xiàn)出更深遠(yuǎn)的影響界拦。BDE-99引起的six7的下調(diào)不能被TRA1挽救（圖4D）吸申，說(shuō)明six7可能是TRA1不能恢復(fù)BDE-99誘導(dǎo)的MW視蛋白水平的原因。WT斑馬魚中six7的存在可以將T3暴露后opn1lw1（TH信號(hào)標(biāo)記）的表達(dá)量壓縮到six7 KD模型中的1/3（圖5A）享甸，過(guò)表達(dá)six7可以進(jìn)一步抑制T3對(duì)opn1lw1的誘導(dǎo)作用呛谜。結(jié)合上述結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)TH信號(hào)（作為L(zhǎng)W錐的誘導(dǎo)劑）和six7（作為MW錐的誘導(dǎo)劑）相互作用枪萄，以平衡不同種類的光感受器问慎。此外滞伟，與BDE-99對(duì)WT斑馬魚的明顯影響相比，six7的沉默完全降低了BDE-99對(duì)MW和LW視蛋白的影響（圖5B）。因此摩钙，BDE-99誘導(dǎo)opn1lw1的關(guān)鍵是six7麻汰。BDE-99暴露減輕了被six7抑制的TH信號(hào)庐冯，而未連接的TH信號(hào)最終導(dǎo)致了T3類似物的結(jié)果吐绵。

光感受器模式是一個(gè)高度復(fù)雜的、多步驟的過(guò)程对妄，其中各種調(diào)節(jié)因子在不同的階段發(fā)揮作用湘今。在其最后階段（錐體分化），脊椎動(dòng)物中最可識(shí)別的因子是THs/THRs剪菱，它導(dǎo)致了SW錐體和LW/MW錐體之間的LW偏好摩瞎。對(duì)于靈長(zhǎng)類動(dòng)物和許多非哺乳動(dòng)物脊椎動(dòng)物拴签，LW和MW錐的細(xì)分需要額外的調(diào)節(jié)器。到目前為止旗们，只有少數(shù)基因蚓哩，例如硬骨魚基因six7，被確定為激活MW錐細(xì)胞的驅(qū)動(dòng)因素上渴，這表明我們對(duì)人類和大多數(shù)脊椎動(dòng)物中這種作用的了解相當(dāng)有限岸梨。這些因素之間的相互作用在很大程度上也是未知的。有限的證據(jù)表明稠氮，補(bǔ)充TH可以抑制WT斑馬魚中six7的表達(dá)曹阔，而在甲狀旁腺斑馬魚中six7的表達(dá)沒(méi)有變化。通過(guò)突變體模型隔披，我們認(rèn)為它們之間的關(guān)系確實(shí)是雙向調(diào)控的赃份。本研究中SW視蛋白的變化，特別是opn1sw2锹锰，包含了更多未明確的原因。之前的研究表明漓库，opn1sw2的表達(dá)與six7有關(guān)恃慧，與我們的圖4A和5A，B一致渺蒿。然而痢士，BDE-99對(duì)opn1sw2的影響可能是獨(dú)立的，因?yàn)樵趕ix7 KD模型中茂装，BDE-99可以刺激opn1sw2怠蹂。與LW和MW視蛋白相比，SW視蛋白的隸屬關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)少态；它們受到不同調(diào)節(jié)因子之間的相互作用的影響城侧。例如，硬骨魚中的生長(zhǎng)因子gdf6a與RA的信號(hào)通路彼妻。據(jù)報(bào)道嫌佑，DE- 71會(huì)破壞斑馬魚各種組織中RA的穩(wěn)態(tài)，從而對(duì)視覺系統(tǒng)產(chǎn)生有害影響侨歉。BDE-99作為DE-71的主要成分屋摇，是否能夠同時(shí)影響多個(gè)靶點(diǎn)，第三個(gè)靶點(diǎn)是否是RA信號(hào)幽邓？為了更好地描述機(jī)制事件和不良結(jié)局之間的聯(lián)系炮温，本文提出了一個(gè)不良結(jié)局途徑的框架，作為BDE-99暴露于視力障礙的毒理學(xué)過(guò)程的總結(jié)（圖6）牵舵。綜上所述柒啤，我們發(fā)現(xiàn)BDE-99暴露于斑馬魚不僅引起視網(wǎng)膜形態(tài)變化和細(xì)胞凋亡倦挂，而且還干擾視蛋白表達(dá)和與色覺相關(guān)的異常行為表型。盡管BDE-99對(duì)光感受器模式的外部結(jié)果與典型的TH T3高度相似白修，但THR拮抗劑TRA1未能完全恢復(fù)BDE-99誘導(dǎo)的影響妒峦，特別是對(duì)MW視蛋白表達(dá)的影響。通過(guò)調(diào)節(jié)MW視蛋白誘導(dǎo)劑six7的表達(dá)兵睛，我們發(fā)現(xiàn)了six7基因在抑制TH信號(hào)通路中的新作用肯骇。由于BDE-99對(duì)six7 KD模型的LW和MW視蛋白影響較小，可以得出BDE-99主要通過(guò)six7而不是TH信號(hào)破壞斑馬魚幼蟲的光感受器模式祖很。這些結(jié)果可能為揭示多溴二苯醚的毒理學(xué)機(jī)制和光感受器模式中調(diào)節(jié)因子之間的相互作用提供了有用的線索笛丙。

基金：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21876135、22036005假颇、92043302）胚鸯。

詳細(xì)網(wǎng)址：https://doi.org/10.1021/acs.est.1c08914

注：因文章篇幅有限，所有相關(guān)引用文獻(xiàn)笨鸡，以及補(bǔ)充圖姜钳、表可以點(diǎn)擊至原文查閱。