雜志：Cells

影響因子：6（2022-2023）

年份：2023

通訊作者：Erwin van Wijk

摘要

在全球范圍內(nèi)，約有40,000人因ADGRV1基因致病性變異引起的視網(wǎng)膜色素變性(RP)而逐漸喪失視力锅睛，目前尚無治療方案埠巨。模擬人類表型的模式生物對(duì)于揭示ADGRV1相關(guān)RP的確切病理生理機(jī)制以及評(píng)估未來的治療策略至關(guān)重要∠志埽基于CRISPR/Cas的基因組編輯技術(shù)的引入辣垒，顯著提高了以時(shí)間和成本效益的方式生成突變模型的可能性。斑馬魚被認(rèn)為是研究Usher綜合征相關(guān)視網(wǎng)膜功能障礙的合適模型印蔬。利用CRISPR/Cas9技術(shù)勋桶，我們?cè)赼dgrv1外顯子9 (adgrv1^rmc22)上引入了一個(gè)4bp的缺失。免疫組化分析顯示，Adgrv1在adgrv1^rmc22斑馬魚視網(wǎng)膜連接纖毛的光感受器區(qū)域缺失例驹。在這里捐韩，Adgrv1的缺失也導(dǎo)致USH2復(fù)合體成員usher和Whrnb的水平降低，這表明Adgrv1與斑馬魚光感受器中的usher和Whrnb相互作用鹃锈。將adgrv1^rmc22斑馬魚與野生型對(duì)照進(jìn)行比較時(shí)荤胁，我們進(jìn)一步觀察到光感受器細(xì)胞體中異常定位的視紫紅質(zhì)水平升高，視網(wǎng)膜電圖(ERG) b波振幅下降屎债，這表明缺乏Adgrv1會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜功能受損仅政。基于這些發(fā)現(xiàn)扔茅，我們將adgrv1^rmc22斑馬魚作為第一個(gè)顯示早期視網(wǎng)膜功能障礙的ADGRV1突變模型已旧。此外秸苗，在評(píng)估未來ADGRV1相關(guān)RP的新治療策略的療效時(shí)召娜，觀察到的表型變化可作為可量化的結(jié)果指標(biāo)。

關(guān)鍵詞:ADGRV1惊楼；Usher綜合征玖瘸；CRISPR/Cas9；斑馬魚檀咙；視網(wǎng)膜功能障礙雅倒；色素性視網(wǎng)膜炎。

介紹

Usher綜合征是一種常染色體隱性遺傳疾病弧可，以色素性視網(wǎng)膜炎(RP)引起的聽力損傷和視覺功能進(jìn)行性喪失為特征蔑匣。根據(jù)不同的臨床類型，患者也可能因前庭功能障礙而出現(xiàn)平衡問題棕诵。目前裁良，Usher綜合征(USH1-4)根據(jù)發(fā)病、嚴(yán)重程度和臨床特征的進(jìn)展情況可分為四種類型校套。ADGRV1基因的致病變異价脾，以前被稱為MASS1、VLGR1或GPR98笛匙，已被確定為Usher綜合征2C型(USH2C)的潛在原因侨把。這類Usher綜合征的特征是先天性聽力障礙和在沒有前庭功能障礙的情況下進(jìn)行性視力喪失。在全球范圍內(nèi)妹孙，約有40,000人患有USH2C秋柄，這些患者可能受益于助聽器或人工耳蝸來減輕他們的聽力損失。然而蠢正，目前還沒有治療方案可用于補(bǔ)償ADGRV1相關(guān)的視力喪失骇笔。

ADGRV1基因編碼人類已知的最大的細(xì)胞表面蛋白:粘附G-protein-coupled受體v1 (ADGRV1)。該蛋白由包含信號(hào)肽的非常大的細(xì)胞外尾部，多個(gè)calx-β結(jié)構(gòu)域蜘拉，癲癇相關(guān)重復(fù)(EAR)結(jié)構(gòu)域萨西，血栓反應(yīng)蛋白/戊氧嘧啶/層粘連蛋白G樣結(jié)構(gòu)域和GPCR蛋白水解位點(diǎn)(GPS)組成。一個(gè)7跨膜區(qū)域?qū)⒌鞍踪|(zhì)固定在細(xì)胞膜上旭旭，隨后是一個(gè)含有C端I類PDZ結(jié)合基序的短細(xì)胞質(zhì)區(qū)域谎脯。

在視網(wǎng)膜中，ADGRV1與usherin (USH2A)和whirlin (USH2D)共定位持寄，這些蛋白共同形成光感受器細(xì)胞睫狀膜上的USH2復(fù)合物源梭。視細(xì)胞分為視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞兩種，它們都是由外段(OS)稍味、內(nèi)段(IS)废麻、細(xì)胞體和突觸末端組成的。OS包含負(fù)責(zé)光轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)模庐，并通過連接的纖毛與IS分開烛愧。睫狀體周圍區(qū)域的膜，即USH2復(fù)合物所在的位置掂碱，形成環(huán)繞連接纖毛的IS的項(xiàng)圈狀延伸怜姿。研究表明，USH2復(fù)合物在纖毛周膜和連接纖毛的膜之間形成分子連接疼燥。此外沧卢，有研究表明，USH2復(fù)合物參與了反式高爾基衍生囊泡的運(yùn)輸和對(duì)接醉者，這些囊泡含有從IS到OS的功能和維護(hù)所必需的成分但狭。此外，對(duì)于ADGRV1撬即，有假設(shè)認(rèn)為該蛋白參與線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)立磁，并通過局灶黏附的機(jī)械感應(yīng)參與細(xì)胞的擴(kuò)散和遷移。然而搞莺，ADGRV1相關(guān)RP的確切病理生理機(jī)制尚不清楚息罗。

為了進(jìn)一步揭示ADGRV1相關(guān)RP的病理生理機(jī)制，并幫助未來治療策略的發(fā)展才沧，模擬人類表型的合適細(xì)胞或動(dòng)物模型是必不可少的迈喉。患者來源的細(xì)胞模型(如成纖維細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)來源的類器官)為我們提供了在患者自身遺傳和分子背景下進(jìn)行研究的機(jī)會(huì)温圆。然而挨摸，視覺是一個(gè)復(fù)雜的過程，它既依賴于光在視網(wǎng)膜上轉(zhuǎn)化為電刺激岁歉，也依賴于中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)這些信號(hào)的整合和解讀得运。因此膝蜈，動(dòng)物模型對(duì)于評(píng)估視覺功能水平的治療效果仍然是必不可少的。多種Adgrv1小鼠模型熔掺，無論是自然發(fā)生的還是轉(zhuǎn)基因的饱搏，已經(jīng)被報(bào)道。然而置逻，這些模型僅部分類似于人類表型推沸，因?yàn)樗鼈兇_實(shí)存在聽力損失，但不能概括在患者中觀察到的視網(wǎng)膜表型券坞。這可能是由于在表達(dá)Adgrv1的光感受器睫狀體周圍區(qū)域的種間解剖差異所致鬓催。先前有報(bào)道稱，與人類相比恨锚，嚙齒動(dòng)物的光感受器睫狀體周圍區(qū)域在很大程度上是不發(fā)達(dá)的宇驾，這使得嚙齒動(dòng)物不太適合研究ADGRV1相關(guān)的RP。作為替代方案猴伶，斑馬魚已被認(rèn)為是研究視網(wǎng)膜功能障礙的一個(gè)有吸引力的模型课舍。斑馬魚具有與人類相當(dāng)?shù)囊暰W(wǎng)膜結(jié)構(gòu)，并且光感受器睫狀體周圍區(qū)域高度保守蜗顽。此外布卡，斑馬魚的繁殖力高雨让、體外受精雇盖、發(fā)育快、胚胎透明等優(yōu)點(diǎn)使其易于進(jìn)行基因操作和實(shí)驗(yàn)栖忠。

基于CRISPR/cas的基因組編輯技術(shù)的引入大大提高了以時(shí)間和成本效益的方式生成突變斑馬魚模型的可能性崔挖。近年來，一些基于CRISPR/cas9的斑馬魚突變體被生成庵寞，以研究USH2A基因致病變異引起的視網(wǎng)膜功能障礙狸相。與小鼠模型相比，這些突變斑馬魚模型(ush2armc1捐川、ush2ab1245脓鹃、ush2ahzu6和ush2au507)在幼蟲期就已經(jīng)觀察到視網(wǎng)膜功能障礙，盡管沒有明顯的聽力學(xué)表型古沥。

由于需要?jiǎng)游锬Ｐ蛠硌芯緼DGRV1相關(guān)的RP瘸右，并且斑馬魚被認(rèn)為是研究視網(wǎng)膜功能障礙的一個(gè)有吸引力的模型，我們?cè)谶@里生成并表征了adgrv1^rmc22斑馬魚模型岩齿。在斑馬魚的基因組中太颤，adgrv1基因以單一拷貝的形式存在，與人類ADGRV1基因一樣盹沈，由90個(gè)外顯子組成龄章。我們利用基于CRISPR/cas9的基因組編輯技術(shù)，在adgrv1中引入蛋白截?cái)嗖∽儯瑢?dǎo)致Adgrv1缺失做裙，adgrv1^rmc22光感受器睫狀體周圍區(qū)域USH2復(fù)合物成員表達(dá)減少岗憋。功能分析顯示，敲除adgrv1會(huì)導(dǎo)致早發(fā)性視網(wǎng)膜表型锚贱。因此澜驮，我們提出adgrv1^rmc22突變體作為第一個(gè)動(dòng)物模型，可用于進(jìn)一步揭示ADGRV1在視網(wǎng)膜中的分子功能惋鸥，并評(píng)估ADGRV1相關(guān)RP的未來治療策略杂穷。

材料和方法

野生型AB系斑馬魚和adgrv1^rmc22突變型斑馬魚在奈梅亨Radboud斑馬魚設(shè)施按標(biāo)準(zhǔn)方法繁殖和養(yǎng)護(hù)。從野生型和突變型斑馬魚的成對(duì)交配中獲得斑馬魚卵卦绣。實(shí)驗(yàn)程序按照國(guó)際和機(jī)構(gòu)指南進(jìn)行(協(xié)議#RU-DEC, AVD10300202215892)耐量。

CRISPR/Cas9基因組編輯設(shè)計(jì)與顯微注射

為了生成adgrv1^rmc22突變型斑馬魚，我們鑒定了CRISPR靶點(diǎn)滤港，并使用網(wǎng)絡(luò)工具CRISPRscan設(shè)計(jì)了帶有Cas9設(shè)置的引導(dǎo)rna蝗羊。對(duì)于潛在的脫靶區(qū)，使用至少4個(gè)錯(cuò)配的臨界值來選擇sgRNA孟辑〖坡叮基于CRISPRscan的預(yù)測(cè)，我們從Integrated DNA Technologies (IDT)訂購了一個(gè)Alt-RTM CRISPR/Cas9 sgRNA添履，用于adgrv1外顯子9:5’-GGGTATTCAGAGTCAGCCAG-3’上的20bp基因組靶序列屁倔。

sgRNA和商業(yè)化的Alt-R?S.p Cas9核酸酶V3 (IDT, Coralville, IA, USA， #1081059)在單細(xì)胞期的野生型斑馬魚胚胎中共同注射暮胧。為此锐借，制備了100 ng/μL sgRNA、800 ng/μL Cas9核酸酶往衷、300 mM KCl和20% (v/v)酚紅溶液(#P0290, Sigma Aldrich, Amsterdam, The Netherlands)的注射混合物钞翔，并在37[數(shù)學(xué)處理誤差]下孵育5分鐘，以使sgRNA-Cas9核糖核蛋白復(fù)合物形成席舍。使用氣動(dòng)PicoPump pv280 (World Precision Instruments, Friedberg, Germany)將1nl的混合物注射到單細(xì)胞期的斑馬魚胚胎中布轿。注射后，胚胎在由5 mM NaCl来颤、0.17 mM KCl汰扭、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4和0.1% (v/v)亞甲基藍(lán)組成的E3胚培養(yǎng)基中于28.5°C培養(yǎng)脚曾。在受精后1天(dpf)东且，使用高分辨率熔化分析(HRM)分析200個(gè)注射胚胎中的16個(gè)是否存在基因組編輯事件。在檢測(cè)到基因組編輯的HRM特征后本讥，將其余的注射胚胎飼養(yǎng)到成年(F0條魚)珊泳。傳播種系突變的創(chuàng)始魚與野生型斑馬魚進(jìn)行了兩次異種雜交鲁冯，以進(jìn)一步減少可能存在的不可預(yù)見的CRISPR/cas9誘導(dǎo)的脫靶修飾。在第二輪異交后色查，將雜合子魚內(nèi)交產(chǎn)生后代薯演，將純合子魚及其野生型兄弟姐妹用于后續(xù)育種和表型分析。

高分辨率熔融分析

在1 dpf下秧了，注射和未注射的斑馬魚胚胎分別在25 μL熱裂解緩沖液(25 mM NaOH, 0.2 mM EDTA)中取樣跨扮，在95°C下孵育20分鐘。裂解物用2.5 μL 1 M Tris pH8中和验毡，稀釋5 - 10倍衡创，作為高分辨率熔融(HRM) PCR分析的輸入，在QuantStudio?3 Real-Time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)使用Q5?高保真DNA聚合酶(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)進(jìn)行分析晶通。#M0491L)和1x evgreen Dye (Biotium, Fremont, CA, USA璃氢， #31000)。用于PCR擴(kuò)增的引物列于表S1狮辽。PCR擴(kuò)增后一也，通過快速冷卻(4°C/s)至10°C和熔化曲線程序(0.1°C/s)啟動(dòng)HRM程序，在此過程中收集數(shù)據(jù)喉脖。當(dāng)超過25%的注射胚胎(n = 16)出現(xiàn)典型的HRM異工峰時(shí)椰苟，其余的注射胚胎將被飼養(yǎng)至成年。我們使用Sanger測(cè)序在顯示異源雙鏈HRM峰的樣本中驗(yàn)證基因組編輯事件树叽。

基因分型

用25 μL(胚胎)或75 μL(成年尾鰭)裂解緩沖液(25 mM NaOH, 0.2 mM EDTA)裂解斑馬魚標(biāo)本舆蝴，95°C孵育20 min，裂解液分別用2.5 μL或7.5 μL 1 M Tris pH 8中和菱皆，稀釋5 - 10倍须误，作為PCR輸入。采用標(biāo)準(zhǔn)PCR循環(huán)條件擴(kuò)增引入病變周圍adgrv1外顯子9的基因組區(qū)域仇轻。用于PCR擴(kuò)增的引物列于表S1。擴(kuò)增子和基因型用Sanger測(cè)序確認(rèn)奶甘。

記錄分析

從3個(gè)相同基因型的幼魚頭部(液氮速凍)中分離到總RNA篷店。裂解前將幼魚頭部均質(zhì)，根據(jù)制造商的說明(Qiagen, Hilden, Germany)臭家，使用RNeasy Micro試劑盒進(jìn)行RNA分離疲陕。隨后，使用SuperscriptTM IV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA钉赁， #18090200)蹄殃，以100 μg的總RNA為模板進(jìn)行cDNA合成。使用Q5?高保真DNA聚合酶試劑盒(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA你踩， #M0491L)擴(kuò)增adgrv1片段诅岩，片段長(zhǎng)度為外顯子7至外顯子11 (1500 bp)讳苦。rpl13擴(kuò)增子作為參考。循環(huán)條件為:98°C 1 min吩谦，循環(huán)35次鸳谜，98°C 10 s, 68°C 20 s, 72°C 2 min，最后72°C 5 min式廷。隨后咐扭，擴(kuò)增子在2%瓊脂糖凝膠上分離，使用Sanger測(cè)序進(jìn)行分析滑废。表S1列出了用于轉(zhuǎn)錄分析的所有引物蝗肪。

基因表達(dá)分析

按照“記錄分析”所述的相同程序，從每個(gè)基因型的5條幼魚(5 dpf)和2條幼魚視網(wǎng)膜(受精后3個(gè)月(3 mpf))中分離總RNA并生成cDNA蠕趁。采用GoTaq qPCR Master Mix (Promega)進(jìn)行定量PCR穗慕。轉(zhuǎn)錄特異性引物針對(duì)adgrv1從外顯子84到外顯子85,ush2a外顯子55到外顯子56,whrnb外顯子2到外顯子4。還包括一個(gè)針對(duì)內(nèi)參基因rpl13的靶標(biāo)妻导。擴(kuò)增使用QuantStudioTM 3 Real-Time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)逛绵。采用雙鏈PCR反應(yīng)，用2??Ct法測(cè)定與參比基因rpl13相比的相對(duì)基因表達(dá)量倔韭。所使用的引物列于表S1术浪。

抗體，免疫組織化學(xué)和組織學(xué)

斑馬魚幼魚(5dpf)和斑馬魚幼魚的眼睛(3mpf) (adgrv1^rmc22突變體和品系匹配的野生型)在PBS中用10%蔗糖冷凍保護(hù)5分鐘寿酌，然后嵌入到OCT化合物中(Sakura, Alphen aan den Rijn胰苏，荷蘭，Tissue-Tek醇疼， #4583)硕并。包埋后，使用液氮冷卻異戊烷緩慢冷凍樣品秧荆，并按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備7 μm的冷凍切片倔毙。未固定的冷凍切片用0.01% Tween-20在PBS中滲透20分鐘，并用封閉緩沖液(10%正常山羊血清和2%牛血清白蛋白在PBS中)封閉30分鐘乙濒。在封閉緩沖液中稀釋一抗和二抗陕赃，切片與一抗在4℃孵育過夜，隨后用PBS沖洗3次10 min颁股，二抗與DAPI (1:800;D1306;Thermo Fisher, Waltham, MA, USA)么库。第二輪沖洗后(用PBS沖洗3次，10 min)甘有，用4%多聚甲醛后固定冷凍切片10 min诉儒，然后用PBS沖洗3次，5 min亏掀。最后忱反，用延長(zhǎng)黃金抗褪色劑(P36930;Thermo Fisher, Waltham, MA, USA)泛释。使用以下一抗及其稀釋度:兔抗引產(chǎn)(1:1000;#DZ01481, Boster Bio, Pleasanton, CA, USA)，兔抗adgrv1抗體(1:100;# DZ41032;Boster Bio)缭受，兔anti-Whrnb (1:750;# 42690002, Cip98a;Novus Biologicals, Centennial, CO, USA)和小鼠抗中心蛋白(1:500;# 04 - 1624;密理博胁澳，達(dá)姆施塔特，德國(guó))米者。以1∶800稀釋度使用二抗(Alexa Fluor 568山羊抗兔(Thermo Fisher, Waltham, MA, USA韭畸， # a -11011)和Alexa Fluor 488山羊抗小鼠(Thermo Fisher, Waltham, MA, USA， # a -11029))蔓搞。使用配備AxioCam MCR5相機(jī)(蔡司胰丁，耶拿，德國(guó))的Zeiss Axio Imager熒光顯微鏡對(duì)載玻片進(jìn)行成像喂分。使用Fiji (v.1.51n)檢測(cè)引導(dǎo)強(qiáng)度和Whrnb免疫熒光锦庸。基于centrin免疫染色蒲祈，分離外節(jié)層甘萧。接下來，使用“Find Maxima”選項(xiàng)(噪聲= 25)根據(jù)中心染色生成一個(gè)掩膜梆掸，并擴(kuò)張5次扬卷。然后，將中心罩和引導(dǎo)層/Whrnb層組合酸钦，確定引導(dǎo)層或Whrnb染色的確切位置怪得。隨后，使用“Find Maxima”(噪聲= 10)識(shí)別中心區(qū)面具內(nèi)的引導(dǎo)符/Whrnb染色卑硫，并使用分水嶺選項(xiàng)分離觸摸物體徒恋。將得到的面罩?jǐn)U張6次，測(cè)量引導(dǎo)周圍面積和Whrnb免疫熒光信號(hào)欢伏。隨后入挣，當(dāng)識(shí)別區(qū)域的最大和最小灰度值在引入器/Whrnb免疫熒光的原始圖像上測(cè)量時(shí)，這可以校正背景噪聲(Analyze Particles選項(xiàng):大小= 0-180颜懊，像素圓度= 0.00-1.00)财岔。

為了進(jìn)行視紫紅質(zhì)標(biāo)記，在正常光照條件下(300 lux白光河爹，14/10 h晝夜節(jié)律)，將adgrv1^rmc22斑馬魚和品系匹配的野生型幼魚飼養(yǎng)在透明的10 cm培養(yǎng)皿中桐款，并在6 dpf早上光照后100分鐘采樣咸这。按照先前發(fā)表的方法對(duì)4% PFA固定的幼蟲冷凍切片(7 μm)進(jìn)行染色和成像。作為小鼠抗視紫紅質(zhì)一抗(1:4000魔眨，克隆4D2;NBP2-59690, Novus biicals, Centennial, CO, USA)與次級(jí)Alexa Fluor 488山羊抗鼠劑(Thermo Fisher, Waltham, MA, USA媳维， #A-11029)聯(lián)合DAPI (1:800;D1306;賽默飛世爾酿雪，馬薩諸塞州沃爾瑟姆，美國(guó))侄刽。使用配有AxioCam MCR5相機(jī)(蔡司指黎，耶拿，德國(guó))的Zeiss Axio Imager熒光顯微鏡對(duì)載玻片進(jìn)行成像州丹。隨后醋安，對(duì)圖像進(jìn)行盲法和隨機(jī)化處理，由兩名研究人員獨(dú)立量化視紫紅質(zhì)錯(cuò)位墓毒，方法是手動(dòng)對(duì)每個(gè)視網(wǎng)膜切片中視紫紅質(zhì)胞體中具有清晰視紫紅質(zhì)信號(hào)的感光細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行評(píng)分吓揪。

為了評(píng)估斑馬魚幼魚(3 mpf)和成魚(6 mpf)視網(wǎng)膜的形態(tài)，我們對(duì)adgrv1^rmc22突變體和品系匹配的野生型斑馬魚眼睛進(jìn)行了解剖所计。在PBS中加入4%多聚甲醛(PFA)柠辞，在4°C下固定眼睛過夜，在上升的甲醇系列中脫水主胧，在100%甲醇中孵育過夜叭首。然后用甲醇系列降水至0.1% PBS-Tween-20，再用0.1% PBS-Tween-20中10%的蔗糖冷凍15分鐘踪栋，在室溫下用0.1% PBS-Tween-20中30%的蔗糖冷凍1小時(shí)焙格。接下來，將眼睛包埋在OCT復(fù)合物(Sakura, Alphen aan den Rijn, the Netherlands, Tissue-Tek己英， #4583)中间螟，用液氮冷卻的異丁烷緩慢冷凍，并制備冷凍切片(7 μm)损肛，用蘇木精和伊紅染色厢破，使用蔡司Axioscope光學(xué)顯微鏡(蔡司，Oberkochen治拿，德國(guó))進(jìn)行分析摩泪。

視網(wǎng)膜電圖(ERG)記錄

對(duì)adgrv1^rmc22斑馬魚幼魚(受精后6-8周(wpf))和野生型斑馬魚進(jìn)行ERG記錄。在進(jìn)行ERG測(cè)量前劫谅，先將魚暗適應(yīng)至少30 min见坑。用0.016%三卡因甲烷磺酸溶液麻醉魚并切斷脊髓停止心跳。培養(yǎng)皿中充滿瓊脂糖凝膠捏检，并將參比電極放入凝膠中荞驴。接下來，將斑馬魚放在這個(gè)培養(yǎng)皿中贯城，右眼面向光源熊楼。使用25號(hào)注射器針頭，在右眼角膜邊緣做一個(gè)小切口能犯，置入充滿E3介質(zhì)(5 mM NaCL, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)的記錄電極鲫骗。連續(xù)兩次100ms白光刺激犬耻，強(qiáng)度約為550勒克斯，間隔8 s执泰。隨后枕磁，響應(yīng)以700-0.1 Hz的帶通放大10,000倍，并用Signal6.03軟件(劍橋電子設(shè)計(jì)有限公司术吝，劍橋计济，英國(guó))記錄。對(duì)記錄進(jìn)行基線校正顿苇，在50毫秒的時(shí)間范圍內(nèi)確定基線信號(hào)峭咒，作為給予刺激前的平均信號(hào)。取對(duì)兩種光刺激的平均反應(yīng)后計(jì)算最大B波振幅纪岁。所有的步驟都在昏暗的紅燈下進(jìn)行凑队。

統(tǒng)計(jì)分析

所有統(tǒng)計(jì)分析均使用PRISM軟件(v9.0.0)進(jìn)行。該軟件用于檢查正態(tài)性幔翰，計(jì)算平均分漩氨，并進(jìn)行雙尾非配對(duì)Student 's t檢驗(yàn)(用于usher和Whrnb定量，視紫紅質(zhì)定位和ERG記錄)遗增。

結(jié)果

分析人類和斑馬魚Adgrv1蛋白結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)的保守性叫惊，以確定適合生成adgrv1突變斑馬魚的CRISPR靶區(qū)。人類和斑馬魚Adgrv1具有相似的蛋白結(jié)構(gòu)域(圖1A)做修，多序列比對(duì)顯示氨基酸高度保守(52.6%的一致性)霍狰。隨后，我們制作了人類ADGRV1中所有蛋白質(zhì)截短的致病性變異體的清單(GPR98 LOVD突變數(shù)據(jù)庫饰及，https://databases.lovd.nl/shared/genes/GPR98;2021年1月4日)蔗坯。基于存在多種蛋白質(zhì)截短變異體(4種獨(dú)特的功能缺失變異體)燎含，外顯子9被選擇為目標(biāo)區(qū)域宾濒。利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)，我們?cè)赼dgrv1第9外顯子中引入了一個(gè)4bp的缺失(c.1571-1574delCAGA;p.Pro524fsTer (ENSDART00000008043.9))屏箍。預(yù)測(cè)該移碼突變會(huì)導(dǎo)致翻譯提前終止绘梦，由此產(chǎn)生的斑馬魚系命名為adgrv1^rmc22。純合的adgrv1^rmc22突變體是可行的赴魁，其發(fā)育卸奉、形態(tài)和游泳行為均未觀察到異常。此外颖御，沒有觀察到明顯的行為差異表明聽覺功能減弱择卦。對(duì)純合幼魚進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析，以觀察4bp缺失對(duì)adgrv1 pre-mRNA剪接的影響郎嫁。對(duì)幼蟲mRNA上從adgrv1外顯子7到外顯子11的擴(kuò)增子進(jìn)行擴(kuò)增秉继，沒有發(fā)現(xiàn)任何可選的剪接事件(圖1B)，而對(duì)adgrv1^rmc22擴(kuò)增子進(jìn)行Sanger測(cè)序證實(shí)了轉(zhuǎn)錄水平上的4bp缺失(圖1C)泽铛。adgrv1^rmc22樣品的PCR產(chǎn)物強(qiáng)度較低尚辑，可能表明突變adgrv1轉(zhuǎn)錄本的無義介導(dǎo)衰變。隨后的qRT-PCR分析證實(shí)盔腔，在突變樣本中杠茬，adgrv1的相對(duì)表達(dá)量顯著降低(p = 0.0001，雙尾非配對(duì)Student 's t檢驗(yàn))(圖1D)弛随。

圖1 人類和斑馬魚ADGRV1結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建及純合adgrv1rmc22突變斑馬魚的轉(zhuǎn)錄分析瓢喉。(A):人和斑馬魚ADGRV1蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)示意圖。這兩種蛋白質(zhì)具有相似的重復(fù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)舀透。Calx-β: Ca2+結(jié)合鈣交換器β結(jié)構(gòu)域;Lam G-like:凝血反應(yīng)蛋白/戊氧嘧啶/層粘連蛋白G-like結(jié)構(gòu)域;EAR:癲癇相關(guān)重復(fù)序列;GPCR: G蛋白偶聯(lián)受體;PDZ:突觸后密度95栓票，椎間盤大，封閉帶-1結(jié)合基序愕够。(B):對(duì)純合adgrv1rmc22斑馬魚幼魚(5 dpf)和野生型斑馬魚的adgrv1轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行RT-PCR分析顯示走贪，與野生型adgrv1轉(zhuǎn)錄本相比，突變adgrv1轉(zhuǎn)錄本減少惑芭。(C): Sanger測(cè)序證實(shí)純合adgrv1rmc22幼魚擴(kuò)增子中存在4個(gè)堿基對(duì)缺失坠狡。(D):野生型和adgrv1rmc22斑馬魚幼魚(5 dpf)中adgrv1轉(zhuǎn)錄本的qRT-PCR分析。采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)每個(gè)基因型5只幼魚進(jìn)行分析遂跟。***表示p = 0.0001(雙尾非配對(duì)Student 's t檢驗(yàn))逃沿。

adgrv1^rmc22光感受器睫狀體周圍區(qū)域缺乏Adgrv1

為了評(píng)估在adgrv1外顯子9中引入的基因組損傷對(duì)adgrv1表達(dá)和亞細(xì)胞定位的影響，我們使用針對(duì)adgrv1蛋白N末端區(qū)域的抗體幻锁，對(duì)5 dpf adgrv1^rmc22斑馬魚和野生型幼魚的視網(wǎng)膜冷凍切片進(jìn)行了免疫組織化學(xué)分析凯亮。由于Adgrv1先前被證明定位于連接纖毛附近的睫狀體周圍區(qū)域，anti-centrin被用作連接纖毛的標(biāo)記物越败。在野生型幼魚中触幼，Adgrv1確實(shí)定位于連接纖毛的光感受器附近，然而究飞，在adgrv1^rmc22斑馬魚幼魚的視網(wǎng)膜切片中置谦，未能在該位置檢測(cè)到Adgrv1蛋白(圖2)。對(duì)adgrv1^rmc22和野生型幼魚視網(wǎng)膜(3 mpf)進(jìn)行的免疫組織化學(xué)分析證實(shí)了這些結(jié)果(圖S1A)亿傅。

圖2 Adgrv1在野生型和adgrv1rmc22斑馬魚視網(wǎng)膜冷凍切片中的定位媒峡。野生型和adgrv1rmc22斑馬魚幼魚(5 dpf)的視網(wǎng)膜冷凍切片，標(biāo)記有針對(duì)Adgrv1(紅色)和centrin(綠色)的抗體(如圖所示)葵擎。細(xì)胞核用DAPI反染(藍(lán)色)谅阿。在野生型斑馬魚中，Adgrv1在連接纖毛標(biāo)記中心附近檢測(cè)到，而在adgrv1rmc22斑馬魚中签餐，該位置未檢測(cè)到Adgrv1信號(hào)寓涨。比例尺:10[數(shù)學(xué)處理誤差]。操作系統(tǒng):外段;CC:連接纖毛;IS:內(nèi)段;ONL:外核層氯檐。

Adgrv1的缺失影響USH2復(fù)合物成員usher和Whrnb的定位

由于有人提出Adgrv1與斑馬魚視網(wǎng)膜中的其他USH2復(fù)合物成員相互作用戒良，因此通過免疫組織化學(xué)分析來評(píng)估Adgrv1缺失對(duì)USH2復(fù)合物成員組成和定位的影響。先前的研究假設(shè)Adgrv1的細(xì)胞外區(qū)與usher的細(xì)胞外區(qū)相關(guān)冠摄，而Adgrv1的細(xì)胞內(nèi)區(qū)主要與Whrnb相互作用糯崎。免疫組織化學(xué)分析了5dpf adgrv1^rmc22斑馬魚和野生型斑馬魚的視網(wǎng)膜冷凍切片，使用了針對(duì)usherin和Whrnb的抗體(圖3)河泳。這兩種蛋白在野生型幼蟲視網(wǎng)膜的光感受器睫周區(qū)域檢測(cè)到沃呢，靠近連接的纖毛標(biāo)記中心。然而拆挥，在5 dpf adgrv1^rmc22斑馬魚的視網(wǎng)膜中薄霜，觀察到usher和Whrnb的熒光信號(hào)強(qiáng)烈減弱。信號(hào)強(qiáng)度的量化證實(shí)了這一點(diǎn)(p < 0.0001竿刁，雙尾非配對(duì)Student 's t檢驗(yàn))黄锤。對(duì)adgrv1^rmc22斑馬魚幼魚視網(wǎng)膜(3mpf)的免疫組織化學(xué)分析證實(shí)，在較晚的年齡階段食拜，usher和Whrnb的定位也有所減少(圖S1B,C)鸵熟。在幼蟲和幼體中，光感受器的其他部位沒有明顯的usherin和Whrnb免疫反應(yīng)负甸。這就提出了一個(gè)問題流强，即免疫反應(yīng)性降低是USH2復(fù)合物分解的結(jié)果，還是由基因表達(dá)水平改變引起的呻待。因此打月，我們通過qRT-PCR分析研究了幼蟲和幼體中ush2a和whrnb基因的相對(duì)表達(dá)水平(圖S2)。與野生型相比蚕捉，突變體adgrv1^rmc22幼蟲的ush2a轉(zhuǎn)錄本減少了34%奏篙，whrnb轉(zhuǎn)錄本減少了26%，而在adgrv1^rmc22幼體中迫淹，ush2a和whrnb的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量分別減少了9%和39%秘通。

圖3 adgrv1rmc22斑馬魚幼魚光感受器睫周區(qū)usher和Whrnb的表達(dá)降低。野生型和adgrv1rmc22斑馬魚幼魚(5 dpf)的視網(wǎng)膜冷凍切片敛熬，染色的抗體針對(duì)促素(紅色)(A)或Whrnb(紅色)(B)和中心化蛋白(綠色)肺稀。細(xì)胞核用DAPI反染(藍(lán)色)。(A):在野生型幼蟲中应民，usherin存在于靠近連接纖毛標(biāo)記中心的光感受器睫狀體周圍區(qū)域话原。與野生型(n = 7 adgrv1rmc22突變體幼魚和n = 4野生型幼魚)相比夕吻，adgrv1rmc22視網(wǎng)膜切片的引導(dǎo)信號(hào)強(qiáng)度顯著降低。(B):在野生型幼魚中繁仁，Whrnb存在于靠近連接纖毛標(biāo)記中心的光感受器睫狀體周圍區(qū)域涉馅。與野生型(n = 7 adgrv1rmc22突變體幼魚和n = 6野生型幼魚)相比，adgrv1rmc22視網(wǎng)膜切片中Whrnb信號(hào)的強(qiáng)度顯著降低改备。對(duì)熒光信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行量化(mean [Math Processing Error] SD)控漠，并在相應(yīng)圖片旁邊繪制散點(diǎn)圖。****表示p < 0.0001(雙尾非配對(duì)Student 's t檢驗(yàn))悬钳。比例尺:10[數(shù)學(xué)處理誤差]。

adgrv1^rmc22感光細(xì)胞中的視紫紅質(zhì)運(yùn)輸缺陷

在不同的動(dòng)物模型中偶翅，USH2復(fù)合物蛋白的缺失與視紫紅質(zhì)在光感受器中的運(yùn)輸受損有關(guān)默勾。因此，我們開始研究視紫紅質(zhì)在野生型(n = 21只眼)和adgrv1^rmc22 (n = 29只眼)幼魚(6 dpf)的光感受器細(xì)胞中的定位聚谁。使用抗視紫紅質(zhì)抗體進(jìn)行的免疫組化分析顯示母剥，視紫紅質(zhì)位于野生型幼魚視網(wǎng)膜的光感受器外段。偶爾在野生型光感受器細(xì)胞的胞體中也可以觀察到視紫紅質(zhì)形导，這與之前的研究一致环疼。然而，與野生型相比朵耕，adgrv1^rmc22幼魚視網(wǎng)膜部分視紫紅質(zhì)異常定位的光感受器數(shù)量顯著增加(p < 0.0001炫隶，雙尾非配對(duì)Student 's t檢驗(yàn))(圖4)。這一結(jié)果表明阎曹，Adgrv1的缺失導(dǎo)致視紫紅質(zhì)的異常纖毛運(yùn)輸伪阶。

圖4 adgrv1rmc22斑馬魚光感受器細(xì)胞體中視紫紅質(zhì)的異常定位。(A):在adgrv1rmc22突變體中觀察到的光感受器外段(OS)的視紫紅質(zhì)定位與光感受器細(xì)胞體中視紫紅質(zhì)異常定位的示意圖处嫌。(B):野生型和adgrv1rmc22斑馬魚幼魚(6 dpf)的視網(wǎng)膜冷凍切片栅贴，標(biāo)記有針對(duì)視紫紅質(zhì)的抗體(綠色)。細(xì)胞核用DAPI反染(藍(lán)色)熏迹。與野生型相比檐薯，adgrv1rmc22幼魚(用白色箭頭表示)的視紫紅質(zhì)定位異常的光感受器數(shù)量明顯增加。(C):繪制每張視網(wǎng)膜切片中視紫紅質(zhì)定位異常的細(xì)胞總數(shù)注暗，用平均SD (n = 29 adgrv1rmc22突變體幼魚和n = 21野生型幼魚)坛缕。雙尾非配對(duì)Student 's t檢驗(yàn)顯示adgrv1rmc22突變型與野生型之間存在顯著差異。****表示p < 0.0001友存，比例尺:10[數(shù)學(xué)處理錯(cuò)誤]祷膳。CC:連接纖毛;IS:內(nèi)段;ONL:外核層;INL:內(nèi)核層。

adgrv1^rmc22斑馬魚顯示視覺功能下降

最后屡立，我們記錄了adgrv1^rmc22幼魚(6-8 wpf, n = 35)和年齡和品系匹配的野生型幼魚(n = 31)的視網(wǎng)膜電圖(ERG)痕跡直晨，以評(píng)估光感受器包膜區(qū)Adgrv1的缺失是否對(duì)視覺功能有影響搀军。與野生型相比，adgrv1^rmc22突變體的最大B波振幅顯著降低(16%)(p = 0.011勇皇，雙尾非配對(duì)Student 's t檢驗(yàn))(圖5)罩句，這表明adgrv1^rmc22幼魚的視覺功能受損。

圖5 視網(wǎng)膜電圖記錄顯示adgrv1rmc22幼魚視網(wǎng)膜功能受損敛摘。(A): adgrv1rmc22和野生型斑馬魚的代表性ERG痕跡门烂。(B): adgrv1rmc22與野生型斑馬魚相比，最大B波振幅顯著降低(* p < 0.01兄淫，雙尾非配對(duì)Student 's t檢驗(yàn))屯远。在受精后6-8周的幼魚(n = 35 adgrv1rmc22突變型和n = 31野生型)的眼睛上記錄了ERG的痕跡。野生型B波平均振幅歸一化為1捕虽。平均B波振幅[數(shù)學(xué)處理誤差]SD在柱狀圖中繪制慨丐。

討論

由于ADGRV1基因突變，Usher綜合征2C型患者表現(xiàn)為先天性聽力障礙和RP導(dǎo)致的進(jìn)行性視力喪失泄私。在缺乏預(yù)防ADGRV1相關(guān)RP的治療策略的情況下房揭，一個(gè)類似于人類視網(wǎng)膜表型的合適模型對(duì)于揭示確切的病理生理機(jī)制和評(píng)估未來的治療策略至關(guān)重要。在這項(xiàng)研究中晌端，我們生成并鑒定了adgrv1^rmc22斑馬魚作為ADGRV1相關(guān)視網(wǎng)膜功能障礙的模型捅暴。利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)，我們?cè)诎唏R魚adgrv1外顯子9中引入了一個(gè)4bp的缺失咧纠。我們已經(jīng)證明蓬痒，adgrv1^rmc22等位基因?qū)е鹿飧惺芷鹘逘铙w周圍區(qū)域Adgrv1缺失，其缺失導(dǎo)致USH2蛋白復(fù)合物解體惧盹。此外乳幸，在adgrv1^rmc22突變體的幼魚中觀察到視紫紅質(zhì)異常定位的增加，ERG記錄表明adgrv1^rmc22斑馬魚幼魚的視網(wǎng)膜功能下降钧椰〈舛希基于這些發(fā)現(xiàn)，我們提出adgrv1^rmc22斑馬魚作為研究adgrv1相關(guān)視網(wǎng)膜功能障礙的合適模型嫡霞。

到目前為止瓶埋，僅報(bào)道了Adgrv1突變小鼠模型，與本文報(bào)道的adgrv1^rmc22突變斑馬魚不同诊沪，該模型在視網(wǎng)膜表型不明確的情況下表現(xiàn)出了聽覺表型养筒。然而，近年來斑馬魚被認(rèn)為是研究ush2a相關(guān)視網(wǎng)膜功能障礙的合適模型端姚。由于在體外受精晕粪，斑馬魚很容易受到基因操作，與基于ZFN和TALEN的基因組編輯相比渐裸，CRISPR/Cas9技術(shù)的引入從根本上減少了生成靶向敲除模型的工作量巫湘。為了填補(bǔ)動(dòng)物模型研究adgrv1相關(guān)視網(wǎng)膜功能障礙的空白装悲，我們制作了CRISPR/cas9誘導(dǎo)的adgrv1^rmc22突變斑馬魚。

免疫組化分析證實(shí)野生型斑馬魚視網(wǎng)膜連接纖毛區(qū)域存在USH2蛋白Adgrv1尚氛、usherin和Whrnb诀诊，這與前人研究一致。我們發(fā)現(xiàn)阅嘶，在adgrv1的N端區(qū)域引入蛋白質(zhì)截?cái)嗤蛔儗?dǎo)致光感受器細(xì)胞的睫狀體周圍區(qū)域缺乏蛋白質(zhì)属瓣。迄今為止，只研究了morpholino反義寡核苷酸誘導(dǎo)的敲除后Adgrv1缺失對(duì)斑馬魚視網(wǎng)膜的影響讯柔。然而抡蛙，Ebermann等在他們的研究中并沒有報(bào)道adgrv1被敲除后出現(xiàn)視網(wǎng)膜缺陷。當(dāng)我們將adgrv1^rmc22斑馬魚與adgrv1敲除幼魚進(jìn)行比較時(shí)磷杏，觀察到的視網(wǎng)膜表型差異可能歸因于morpholino反義寡核苷酸誘導(dǎo)的短暫和部分敲除溜畅，而不是CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的永久性蛋白質(zhì)截?cái)嗤蛔儭Ａ硗饧觯庖呓M織化學(xué)分析顯示，Adgrv1在adgrv1^rmc22斑馬魚視網(wǎng)膜中的缺失也導(dǎo)致了usherin和Whrnb熒光信號(hào)的強(qiáng)烈減少怠晴。這些結(jié)果證實(shí)了我們之前基于在ush2armc1和ush2ab1245斑馬魚中的類似結(jié)果而提出的這些蛋白在正確形成睫狀周USH2蛋白復(fù)合體中的相互依賴性遥金。因此，我們的研究結(jié)果證實(shí)了Adgrv1在斑馬魚光感受器睫狀體周圍區(qū)域與其他USH2蛋白介導(dǎo)蛋白和Whrnb蛋白復(fù)合物相互作用的模型蒜田。為了揭示該區(qū)域的usherin和Whrnb的免疫反應(yīng)性降低是由于USH2復(fù)合物的分解稿械，還是由于基因表達(dá)水平的改變，我們分析了ush2a和Whrnb的基因表達(dá)水平冲粤。在adgrv1^rmc22突變體幼魚中美莫，ush2a和whrnb的相對(duì)基因表達(dá)量分別下降了34%和26%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義梯捕。據(jù)報(bào)道厢呵，僅20%的功能性u(píng)sh2a轉(zhuǎn)錄本就足以導(dǎo)致斑馬魚光感受器睫狀體周圍區(qū)域的引導(dǎo)定位。因此傀顾，adgrv1^rmc22斑馬魚視網(wǎng)膜中usherin和Whrnb定位減少可能是Adgrv1缺失導(dǎo)致USH2復(fù)合物解體的結(jié)果襟铭。

據(jù)推測(cè)，USH2蛋白網(wǎng)絡(luò)有助于向光感受器外段運(yùn)送諸如視紫紅質(zhì)的纖毛短曾。人們也普遍認(rèn)為寒砖，由于纖毛運(yùn)輸功能障礙而導(dǎo)致的內(nèi)節(jié)蛋白質(zhì)的積累可能是通過激活細(xì)胞應(yīng)激途徑導(dǎo)致光感受器變性的基礎(chǔ)。此外嫉拐，有報(bào)道視紫紅質(zhì)定位錯(cuò)誤導(dǎo)致異位光轉(zhuǎn)導(dǎo)哩都，這一過程已被發(fā)現(xiàn)加速光感受器細(xì)胞死亡。adgrv1^rmc22幼魚視網(wǎng)膜部分中視紫紅質(zhì)異常定位的光感受器數(shù)量的顯著增加確實(shí)支持了纖毛蛋白運(yùn)輸缺陷可能是adgrv1相關(guān)視網(wǎng)膜變性起源的觀點(diǎn)婉徘。有趣的是漠嵌，對(duì)幼年(3 mpf)和成年(6 mpf) adgrv1^rmc22斑馬魚視網(wǎng)膜進(jìn)行的組織學(xué)檢查未顯示進(jìn)行性視網(wǎng)膜變性的任何跡象(圖S3)咐汞，因?yàn)?span style=";padding: 0px;outline: 0px;max-width: 100%;letter-spacing: 0.034em;box-sizing: border-box !important;overflow-wrap: break-word !important">adgrv1^rmc22斑馬魚視網(wǎng)膜各層在形態(tài)學(xué)上與野生型視網(wǎng)膜難以區(qū)分。然而献雅，與之前發(fā)表的ush2a突變型斑馬魚模型相一致碉考，在ush2a突變型斑馬魚模型中，與野生型相比挺身，也沒有觀察到形態(tài)學(xué)差異侯谁。光感受器細(xì)胞無進(jìn)行性變性的一個(gè)合理解釋是斑馬魚視網(wǎng)膜的再生能力，因?yàn)榕c人類視網(wǎng)膜不同章钾，斑馬魚視網(wǎng)膜能夠替代失去的視網(wǎng)膜神經(jīng)元墙贱。錯(cuò)誤定位的視紫紅質(zhì)導(dǎo)致光感受器細(xì)胞死亡的光毒性作用可能因此被持續(xù)的光感受器再生所掩蓋。在adgrv1^rmc22斑馬魚中贱傀，缺乏進(jìn)展型表型惨撇，纖毛周圍區(qū)域USH2蛋白復(fù)合體的恢復(fù)和正常的視紫紅質(zhì)運(yùn)輸提供了有價(jià)值的生物標(biāo)志物，可用于評(píng)估adgrv1相關(guān)視網(wǎng)膜變性的未來治療策略府寒。

在本研究中魁衙，我們?cè)u(píng)估了定位于光感受器睫狀體周圍膜的Adgrv1的功能。有趣的是株搔，最近的一篇論文在來自Vlgr1缺陷小鼠模型的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(MAMs)上的ADGRV1剖淀，這表明ADGRV1具有一種新的功能。這些細(xì)胞膜上缺乏ADGRV1會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間的距離增加纤房，并減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的釋放纵隔，從而破壞細(xì)胞的生物能量學(xué)。由于光感受器細(xì)胞的高能量需求炮姨，很容易推測(cè)這些機(jī)制也可能是光感受器細(xì)胞功能障礙的基礎(chǔ)捌刮。然而，根據(jù)我們的免疫組織化學(xué)分析舒岸，我們沒有發(fā)現(xiàn)Adgrv1存在于光感受器細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和MAMs上的跡象绅作，因?yàn)檫@需要高分辨率顯微鏡技術(shù)。

最后吁津，我們對(duì)adgrv1^rmc22 (6-8 wpf)突變體幼魚和野生型幼魚的眼部進(jìn)行了ERGs記錄棚蓄。在這個(gè)年齡，斑馬魚的桿狀和錐狀光感受器被認(rèn)為是成熟的碍脏，兩者都有助于視覺功能梭依。當(dāng)檢查ERG痕跡時(shí)，首先觀察到一個(gè)小的初始A波典尾，代表光感受器細(xì)胞的超極化役拴。A波在很大程度上被隨后的代表ON雙極細(xì)胞去極化的B波所掩蓋。ERG記錄顯示钾埂，與野生型相比河闰，adgrv1^rmc22斑馬魚的B波振幅顯著下降科平。B波振幅的下降可能是光導(dǎo)或向ON雙極細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)缺陷的結(jié)果。無論如何姜性，adgrv1^rmc22斑馬魚B波振幅的顯著下降可以被認(rèn)為是視網(wǎng)膜功能受損的一個(gè)指示瞪慧。這些結(jié)果與之前發(fā)表的關(guān)于ush2a突變斑馬魚幼魚眼睛的ERGs記錄一致，其中記錄了類似的B波振幅降低部念。

結(jié)論

綜上所述弃酌，我們建立了一個(gè)adgrv1^rmc22突變斑馬魚模型，值得注意的是儡炼，這是第一個(gè)表現(xiàn)出早期視網(wǎng)膜功能障礙的ADGRV1突變動(dòng)物模型妓湘。先前的研究已經(jīng)證明了斑馬魚作為研究視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良的模型的轉(zhuǎn)化價(jià)值。此外乌询，Schellens等人和Dulla等人的研究已經(jīng)證明斑馬魚在評(píng)估治療策略時(shí)的相關(guān)性榜贴，如USH2A相關(guān)性RP的單外顯子或雙外顯子跳躍治療。具體來說妹田，我們?cè)?span style=";padding: 0px;outline: 0px;max-width: 100%;letter-spacing: 0.034em;box-sizing: border-box !important;overflow-wrap: break-word !important">adgrv1^rmc22幼魚的光感受器細(xì)胞中觀察到的早期分子表型為評(píng)估和優(yōu)化adgrv1相關(guān)RP的潛在治療策略提供了一個(gè)絕佳的機(jī)會(huì)唬党。因此，本研究的斑馬魚模型使我們朝著adgrv1相關(guān)RP的未來治療又邁進(jìn)了一步鬼佣。

原文：Stemerdink M, Broekman S, Peters T, et al. Generation and Characterization of a Zebrafish Model for ADGRV1-Associated Retinal Dysfunction Using CRISPR/Cas9 Genome Editing Technology[J]. Cells, 2023, 12(12): 1598.

原文地址：https://doi.org/10.3390/cells12121598

注：因文章篇幅有限初嘹，所有相關(guān)引用文獻(xiàn)，以及補(bǔ)充圖沮趣、表可以點(diǎn)擊至原文查閱。