雜志：Journal of Genetics and Genomics

影響因子：5.9（2022）

年份：2023

通訊作者：Dong Liu, Cheng Wang

通訊作者單位：Nantong Laboratory of Development and Diseases, School of Life Sciences, Co-innovation Center of Neuroregeneration, MOE Key Laboratory of Neuroregeneration, Nantong University, Nantong, Jiangsu 226019, China.

摘要

感覺毛細(xì)胞(HCs)損傷是感覺神經(jīng)性聽力損失的主要原因笆呆，但由于許多潛在的耳聾基因尚未確定，其病理機制尚未完全了解粱挡。Ftr82是魚類中主要的TRIMs家族成員赠幕，已被發(fā)現(xiàn)在耳小泡中特異性表達，但其功能尚不清楚询筏。在這里榕堰，我們利用斑馬魚模型研究了ftr82在HC發(fā)育和聽力功能中的作用。原位雜交結(jié)果表明嫌套，ftr82在不同階段總是局限于耳小泡內(nèi)逆屡。在ftr82突變體和突變體中均觀察到HCs的缺陷圾旨，包括嵴HCs明顯減少，纖毛縮短魏蔗，神經(jīng)鞘功能hcc明顯減少砍的，通過外源ftr82 mRNA共注射可成功挽救。驚嚇反應(yīng)行為實驗表明莺治，缺乏ftr82基因的幼蟲對外部聲音刺激的敏感性較低廓鞠。進一步研究發(fā)現(xiàn)，hcc的丟失主要是由caspase-3激活介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡引起的产雹。我們的研究表明诫惭，ftr82是調(diào)控HC形態(tài)發(fā)生和聽覺功能表現(xiàn)的重要聽力相關(guān)基因，為快速鑒定耳聾基因提供了新的思路蔓挖。

關(guān)鍵詞：ftr82夕土，TRIM蛋白，毛細(xì)胞發(fā)育瘟判，聽力損失怨绣，斑馬魚

前言

感覺毛細(xì)胞(HC)損傷通常是引起感音神經(jīng)性聽力損失的原因，這一過程可由多種因素引起拷获，包括遺傳改變篮撑、噪音、耳毒性藥物匆瓜、衰老等赢笨。聽力損失正在成為一個全球性的健康問題，由耳聾基因突變引起的遺傳性聽力損失占80%驮吱。因此茧妒，尋找新的耳聾關(guān)鍵基因并闡明聽覺器官發(fā)育的調(diào)控機制是至關(guān)重要的。到目前為止左冬，已經(jīng)確定了120多個耳聾基因(https://hereditaryhearingloss.org)桐筏，近年來還有許多其他基因被證明與聽力損失有關(guān)。探索耳聾基因的功能依賴于動物模型的構(gòu)建拇砰。已建立的模型生物梅忌，如小雞、斑馬魚除破、小鼠和大鼠牧氮，已被廣泛應(yīng)用于聽覺研究。哺乳動物通常被認(rèn)為優(yōu)于非哺乳脊椎動物皂岔，因為它們的耳蝸結(jié)構(gòu)和與人類的關(guān)系更密切蹋笼。然而，它們的局限性也很明顯，包括復(fù)雜的耳蝸解剖分離剖毯、耗時表型讀數(shù)圾笨、高成本和低通量等。斑馬魚具有高繁殖力逊谋、透明度擂达、易于可視化和基因操作等特點，使其成為快速耳聾基因鑒定和聽覺研究的經(jīng)濟和有吸引力的模式生物胶滋。

斑馬魚HCs是分布在檢測聲音和運動的機械感覺器官板鬓，包括位于頭部和側(cè)線(LL)系統(tǒng)的耳泡。耳囊泡主要由三個正交排列的半規(guī)管究恤、小囊和球囊組成俭令。垂直插入壺腹的三個典型的HC簇，被稱為嵴HCs部宿，它們可以將外部振動刺激轉(zhuǎn)化為由神經(jīng)系統(tǒng)傳遞的電生理信號抄腔。此外，LL系統(tǒng)理张，另一個重要的感覺器官赫蛇，由系列有規(guī)則排列的神經(jīng)瘤組成，其中HCs被支持細(xì)胞和套膜細(xì)胞包圍雾叭。神經(jīng)肥大系統(tǒng)是LL的基本功能單位悟耘，其特征是位于人工表面體，易于染色和成像织狐。許多研究人員已經(jīng)致力于探索HC的發(fā)育和再生的分子機制暂幼。據(jù)報道，Wnt移迫、Notch和Fgf信號通路粟誓，部分轉(zhuǎn)錄因子(Atoh1, Sox2, Math1, Gata3)，以及新發(fā)現(xiàn)的microRNA廣泛參與了這些過程起意。目前已鑒定出120多個非綜合征性聽力損失基因，但仍有許多耳聾基因有待發(fā)現(xiàn)病瞳。

三元基序(TRIM)蛋白揽咕，也稱為RBCC蛋白，由一個環(huán)結(jié)構(gòu)域套菜、一個或兩個b -盒和一個預(yù)測的線圈區(qū)域組成亲善，該區(qū)域通常后面是高度可變的c端結(jié)構(gòu)域，如B30.2結(jié)構(gòu)域(PRY-SPRY)逗柴。作為E3泛素連接酶的一種蛹头，廣泛參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡渣蜗、細(xì)胞周期調(diào)控屠尊、抗病毒先天免疫應(yīng)答等多種生物學(xué)過程。ftr82屬于TRIM基因的一個大的新子集耕拷，稱為魚類新TRIM (finTRIM, ftr)讼昆，僅在硬骨魚中存在，與之最接近的哺乳動物親戚是TRIM16和TRIM25骚烧，但不是真正的同源基因浸赫。有限的研究表明，finTRIM基因主要與抗病毒感染的先天免疫有關(guān)赃绊。研究表明既峡，ftr36可觸發(fā)IFN通路，介導(dǎo)病毒復(fù)制抑制碧查。FTR83的過表達誘導(dǎo)IFN上調(diào)并抑制RNA病毒感染运敢，如IHNV、VHSV和SVCV么夫。對ftr82的有限研究表明者冤，在斑馬魚中，過表達ftr82不會誘導(dǎo)IFN的上調(diào)档痪，也不會表現(xiàn)出抗病毒活性涉枫。而在橙斑石斑魚中，ftr82負(fù)調(diào)控IFN反應(yīng)腐螟，增強SGIV和RGNNV的病毒顆粒復(fù)制愿汰。此外，一篇論文發(fā)現(xiàn)ftr82是一個血管基因乐纸，在斑馬魚的血管發(fā)育中起著重要作用衬廷。此外，ftr82在早期斑馬魚胚胎的卵泡中特異性表達(Kudoh et al.汽绢， 2001)吗跋。由此可見，ftr82基因的功能在很大程度上仍然未知宁昭，在聽覺研究中也沒有對TRIM蛋白的相關(guān)描述跌宛。

在這里，我們利用斑馬魚模型研究了ftr82在HC發(fā)育和聽力功能中的作用积仗。采用全載原位雜交(WISH)技術(shù)詳細(xì)表征了ftr82的表達譜疆拘，并觀察了ftr82在耳小泡hc中的特異性表達。morpholino注射或CRISPR-Cas9的功能缺失實驗均可誘導(dǎo)crisa hc和神經(jīng)鞘在形態(tài)和功能上的缺陷寂曹。ftr82基因敲低或敲除均會導(dǎo)致驚恐反應(yīng)缺陷哎迄。同時注射外源ftr82 mRNA可恢復(fù)相關(guān)表型變化回右。此外，在ftr82缺失中檢測到毛細(xì)胞凋亡信號漱挚，這在很大程度上解釋了HC丟失的表型翔烁。綜上所述，我們的研究揭示了ftr82在斑馬魚HC發(fā)育和聽覺功能中起重要作用棱烂。這項工作不僅有助于我們?nèi)媪私鈌tr82的基因功能租漂，也為潛在耳聾基因的鑒定提供了新的見解。

結(jié)果

為了描述ftr82基因的進化特征哩治，我們分析了斑馬魚ftr82在幾種魚類中的同源關(guān)系，也分析了人中最相似的同源關(guān)系衬鱼。對來自不同物種的ftr82氨基酸序列進行了比對业筏，并利用鄰域連接（NJ）方法構(gòu)建了ftr82的系統(tǒng)發(fā)育樹。NJ樹和比對結(jié)果顯示鸟赫，ftr82基因在硬骨魚中具有高度同源性蒜胖，與人類TRIM蛋白的同源性較低性（圖1A和1C）。進一步分析表明抛蚤，斑馬魚ftr82 包含典型的finTRIMs的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)台谢，包括一個RING/B-Box/卷曲線圈TRIM和一個特定的B30.2結(jié)構(gòu)域（圖1B和1C）。結(jié)果表明岁经，ftr82基因在硬骨魚中具有進化保守性朋沮，具有典型的TRIMs特征。為了探討ftr82基因在斑馬魚胚胎發(fā)育中的潛在作用缀壤，我們利用地高辛標(biāo)記的ftr82反義探針WISH對ftr82的空間表達譜進行了表征樊拓。結(jié)果顯示，ftr82在斑馬魚胚胎24hpf~96hpf的耳泡中高表達（圖1D-1I）塘慕。耳囊泡的放大圖顯示ftr82 mRNA定位于嵴HCs（圖1D‘-1I’）筋夏。此外，ftr82 mRNA在頭部間充質(zhì)图呢、干血管条篷、尾靜脈神經(jīng)叢（CVP）、心臟和腸道中也檢測到的mRNA（圖1D-1I）蛤织。ftr82在耳小泡發(fā)育過程中的特異性表達表明拥娄，ftr82可能在斑馬魚的聽覺器官發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖1 Ftr82基因在硬骨魚中保守瞳筏，并在發(fā)育中的卵囊中特異性表達。(A)利用MEGA 6.0版軟件牡昆，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹姚炕，包括斑馬魚ftr82(用紅星標(biāo)記)及其在幾種魚類中的同源物摊欠，以及與人類最相似的同源物。(B) ftr82基因典型結(jié)構(gòu)域示意圖柱宦。(C)斑馬魚ftr82(用紅星標(biāo)記)與魚類和人類相似同源物的氨基酸序列比對些椒。ftr82的保守結(jié)構(gòu)域包括RING(橙色)、B-Box(藍色)和coil - coil(綠色)掸刊。(D- I)斑馬魚胚胎在24免糕、36、48忧侧、60石窑、72和96 hpf時ftr82 mRNA的橫向表達譜。在胚胎發(fā)育過程中觀察到Ftr82 mRNA定位于耳小泡(用紅色橫線矩形標(biāo)記)蚓炬。(D ' i ')放大后的耳囊內(nèi)陽性信號松逊。

ftr82基因的敲除導(dǎo)致HCs降低、神經(jīng)瘤減少和纖毛縮短

為了研究ftr82在斑馬魚聽覺器官發(fā)育中的功能肯夏，我們通過向轉(zhuǎn)基因系Tg(Brn3c:mGFP)中注射剪接阻斷型morpholino來敲低ftr82基因经宏。首先通過PCR驗證了morpholino的有效性，結(jié)果表明驯击，ftr82特異性的morpholino可以成功地在目標(biāo)位點引起有效的錯誤剪接(圖S1)烁兰。隨后，記錄并分析了耳小泡中典型的三簇嵴HCs的發(fā)育情況(圖2)徊都。圖像顯示沪斟，與72 hpf時正常幼蟲的三簇嵴HCs相比，微注射ftr82特異性morpholino的幼蟲的嵴HCs較少碟贾，纖毛較短(圖2B)币喧。為了排除發(fā)育遲緩的因素，我們觀察了96 hpf時幼蟲的嵴HCs袱耽，表型一致(圖S2)杀餐。統(tǒng)計結(jié)果還顯示，敲除ftr82基因后朱巨，嵴 HCs的數(shù)量和纖毛的長度均顯著減少(圖2C-2F)史翘。

圖2 ftr82基因的敲低導(dǎo)致耳小泡中典型的三簇crissta hcc顯著減少和纖毛縮短。(A)含有典型三簇冠狀細(xì)胞的耳囊結(jié)構(gòu)示意圖冀续。ACHC琼讽，前嵴毛細(xì)胞;LCHC，側(cè)嵴毛細(xì)胞;后嵴毛細(xì)胞洪唐。(B)分別在對照組钻蹬、ftr82突變體組和ftr82 mRNA獲救組獲得72 hpf時耳小泡內(nèi)典型三簇crissta hc的代表性熒光圖像。比例尺:20μm凭需。(C, D)對照組问欠、ftr82突變體組和ftr82 mRNA獲救組在72 hpf和96 hpf時不同crissta HC簇中HC數(shù)量的統(tǒng)計分析肝匆。(E, F)對照組、ftr82突變體組和ftr82 mRNA搶救組在72 hpf和96 hpf時crissta HC簇纖毛平均長度的統(tǒng)計分析顺献。

眾所周知旗国，側(cè)線（LL）系統(tǒng)是斑馬魚的另一個重要的感覺器官，可以感知流體流動和聲音振動注整。為了確定ftr82是否參與了LL的發(fā)展能曾，我們在72 hpf和96 hpf下觀察和分析了后側(cè)線(pLL)的HC簇和神經(jīng)突(圖3A, 3B, 3D, 3E)。用GFP和eya1標(biāo)記基因分別識別HC簇和神經(jīng)突肿轨。圖像顯示寿冕，與對照幼蟲相比，ftr82變異體在不同階段的HC簇和神經(jīng)突都顯著減少(圖3A和3B)萝招。這與pLL中HC簇數(shù)和神經(jīng)突數(shù)的統(tǒng)計結(jié)果一致(圖3D和3E)贷洲。為了更詳細(xì)地描述LL中hc的變化郊霎，我們對單個神經(jīng)突進行放大和成像抖甘，并用FM4-64染料標(biāo)記功能性hc润绵。有代表性的圖表顯示，ftr82基因的敲低導(dǎo)致單個神經(jīng)肥大細(xì)胞的hcc顯著減少岗钩，并伴有不同階段功能性hcc的減少(圖3C和S3)纽窟。統(tǒng)計結(jié)果一致(圖3F和3G)。上述結(jié)果表明兼吓，ftr82的缺乏影響了耳小泡和耳小泡感覺器官的發(fā)育臂港，表現(xiàn)為耳小泡神經(jīng)突的嵴HCs減少、纖毛縮短以及耳小泡神經(jīng)突的功能性HCs減少视搏。

圖3 ftr82基因的敲低導(dǎo)致pLL中HC簇和神經(jīng)突的減少审孽，以及pLL單個神經(jīng)突中HC和功能性HC的減少。(A)對照浑娜、ftr82突變體和ftr82 mRNA獲救組在72 hpf和96 hpf時pLL中HC簇(用紅色箭頭標(biāo)記)的相對比和熒光顯微圖佑力。比例尺:500μm。(B) 72 hpf時正常筋遭、ftr82變形體和獲救幼蟲中eya1 mRNA的表達譜打颤。紅色箭頭指向pLL的神經(jīng)突。(C) 72 hpf時漓滔，對照組编饺、ftr82突變體組和ftr82 mRNA拯救組pLL單個神經(jīng)肥大HC簇(綠色)和功能HC簇(紅色)的代表性熒光顯微圖。比例尺:10μm响驴。(D, E)對照組透且、ftr82突變體和ftr82 mRNA搶救組pLL中HC簇和神經(jīng)突數(shù)量的統(tǒng)計分析。(F, G)對照組豁鲤、ftr82突變體和ftr82 mRNA拯救組在72 hpf和96 hpf時每個神經(jīng)肥大細(xì)胞的hc和功能性hc數(shù)量的統(tǒng)計分析石蔗。

ftr82基因的敲除會導(dǎo)致斑馬魚的聽力缺陷

眾所周知罕邀，斑馬魚的機械感覺HCs可以將外部振動轉(zhuǎn)換為由神經(jīng)系統(tǒng)傳遞的電生理信號，以感知聲音和周圍環(huán)境中的流體流動养距。ftr82基因的敲低導(dǎo)致耳泡和pLL的HC降低，斑馬魚的聽力功能是否也受到影響尚不清楚日熬。本文采用聲驚嚇反射行為實驗來評價斑馬魚幼體對外界聲音刺激的反應(yīng)棍厌。施加不同大小的聲刺激，記錄并提取聲刺激下的運動軌跡(圖4A和4B)竖席。統(tǒng)計結(jié)果顯示耘纱，在不同聲刺激強度下，ftr82 morphants的平均運動距離和運動峰值速度均顯著降低(圖4C和4D)毕荐。結(jié)果表明束析，ftr82基因敲低會損害幼蟲的聽覺功能，這反映在幼蟲對外部聲音刺激的敏感性低于對照組憎亚。

圖4 ftr82基因的敲除會導(dǎo)致斑馬魚幼蟲的聽力功能障礙员寇。(A)驚嚇響應(yīng)測試設(shè)備示意圖。(B)對照第美、ftr82突變體和ftr82 mRNA 541在9 dB的一次性刺激下以5dpf拯救幼蟲蝶锋。1 ms-2 。（C什往，D）在不同強度的聲音刺激下扳缕，5dpf幼蟲與對照組、ftr82突變體和ftr82 mRNA拯救組的平均距離和峰值運動速度的統(tǒng)計分析别威。

敲除ftr82基因會破壞HC的發(fā)育和聽覺功能

為了進一步鑒定ftr82基因在HC發(fā)育中的作用躯舔，我們首先利用CRISPR/Cas9對轉(zhuǎn)基因158斑馬魚的基因編輯技術(shù)構(gòu)建了ftr82突變體。我們合成了一個針對ftr82基因外顯子2的編碼序列的sgRNA省古，并將Cas9 mRNA共注射到單細(xì)胞階段的胚胎中（圖5A）粥庄。通過PCR和從生長中的胚胎中提取的基因組DNA測序來驗證該基因型。結(jié)果顯示衫樊，突變成功地發(fā)生在ftr82基因的靶位點（圖5B）飒赃。

為了描述ftr82敲除對HC形態(tài)發(fā)生的影響，我們觀察了HCs 163在耳囊泡和pLL系統(tǒng)中的發(fā)育過程科侈，以確定ftr82突變體的表型载佳。與ftr82嗎啡啉突變體的表型相似，在72 hpf時臀栈，ftr82突變體的前蔫慧、側(cè)、后嵴hc隨著纖毛的縮短而明顯減少（圖5D权薯、5G姑躲、5H）睡扬。在72 hpf時，ftr82 基因敲除的幼蟲中黍析，pLL中的HC簇顯著減少卖怜，單個神經(jīng)肥大中的功能HC顯著減少（圖5C、5E阐枣、5I马靠、5J）。在ftr82突變體中蔼两，在96 hpf時也觀察到了一致的現(xiàn)象(圖甩鳄。S4).進一步研究發(fā)現(xiàn)，在驚嚇反應(yīng)行為實驗中额划，ftr82突變體中運動的平均距離和峰值速度明顯降低（圖5F妙啃、5K、170 5L）俊戳。以上結(jié)果表明揖赴，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的ftr82突變深刻影響了斑馬魚 HC的發(fā)育和聽力功能。

圖5 在靶位點成功實現(xiàn)了CRISPR/cas9介導(dǎo)的ftr82突變品抽，敲除ftr82基因破壞了斑馬魚HC的形態(tài)發(fā)生储笑，導(dǎo)致聽力喪失。(A)靶向外顯子2產(chǎn)生ftr82突變的ftr82特異性sgRNA示意圖圆恤。(B)與野生型魚相比突倍，ftr82突變體的靶位點出現(xiàn)了多個突變。(C)對照盆昙、ftr82突變體和ftr82 mRNA獲救組在72 hpf時pLL中HC簇(用紅色箭頭標(biāo)記)的相襯和熒光顯微圖羽历。比例尺:500μm。(D)對照組淡喜、ftr82突變體組和ftr82 mRNA獲救組在72 hpf時的代表性囊泡熒光圖像秕磷，分別為ACHC、LCHC(用白色虛線圈標(biāo)記)和PCHC炼团。相應(yīng)組LCHC放大圖澎嚣。比例尺:20μm。(E)對照組瘟芝、ftr82突變體組和ftr82 mRNA獲救組在72 hpf時pLL單個神經(jīng)肥大HC簇(綠色)和功能HC簇(紅色)的重疊熒光圖像易桃。比例尺:20μm。(F)在9 dB re.1 ms-2的一次性刺激下锌俱，在5dpf條件下晤郑，對照、ftr82突變體和ftr82 mRNA獲救的幼蟲在驚嚇反應(yīng)實驗中的游動軌跡。 (G-H)對照組造寝、ftr82突變體組和ftr82 mRNA獲救組不同crissta HC簇中HC數(shù)量和72 hpf時纖毛平均長度的統(tǒng)計分析磕洪。(I-J)對照組、ftr82突變體組和ftr82 mRNA獲救組在72 hpf時每個神經(jīng)肥大中功能性HC數(shù)量和pLL中HC簇數(shù)量的統(tǒng)計分析诫龙。(K-L)不同聲刺激強度下析显，對照組、ftr82突變組和ftr82 mRNA搶救組5dpf幼蟲的平均運動距離和峰值運動速度的統(tǒng)計分析签赃。

ftr82突變體和突變體的缺陷表型可以通過微量注射ftr82 mRNA來挽救

為了證實在ftr82突變體和突變體中觀察到的表型是由ftr82缺失特異性誘導(dǎo)的叫榕，我們進行了經(jīng)典的mRNA拯救實驗。將外源性ftr82 mRNA與morpholino或sgRNA共注射到單細(xì)胞期胚胎中進行檢測姊舵。結(jié)果表明，在ftr82變異體中寓落，共注射ftr82 mRNA可以部分修復(fù)pLL中嵴hc減少括丁、纖毛縮短、神經(jīng)肥大和功能hc減少等異常表型(圖2伶选、3史飞、S2、S3)仰税。同時构资，共注射ftr82 mRNA也可以部分恢復(fù)聽力損失(圖4)。同樣陨簇，微量注射ftr82 mRNA也可以挽救ftr82突變體中出現(xiàn)的HC缺陷和聽力功能障礙(圖5C-5L, S4)吐绵。上述結(jié)果表明，HC形態(tài)發(fā)生異常和聽力功能障礙是由ftr82缺失特異性引起的河绽。

ftr82基因功能缺失誘導(dǎo)斑馬魚HC凋亡

為了進一步研究ftr82 186突變體中HC表型的細(xì)胞生物學(xué)機制己单，我們用抗凋亡標(biāo)記物caspase-3的抗體進行了細(xì)胞凋亡檢測。免疫熒光結(jié)果顯示耙饰，在正常幼蟲中沒有檢測到caspase-3的切割信號纹笼，而在ftr82突變體中，近一半的幼蟲中caspase-3的切割信號與HC共定位（圖6）苟跪。此外廷痘，我們發(fā)現(xiàn)ftr82的功能缺失并不影響支持細(xì)胞的發(fā)育(圖。S5)件已。這是ftr82在缺失時導(dǎo)致HC減少的主要機制笋额。

圖6 敲除ftr82基因可誘導(dǎo)HC細(xì)胞凋亡。(A)免疫熒光圖像識別565只對照和ftr82突變體的pLL中單個核（藍色）拨齐、HC（綠色）和切割的caspase-3信號（紅色）鳞陨。比例尺：20μm。(B)對對照組和ftr82突變組凋亡信號進行定量分析（n=20）。

討論

我們都知道厦滤，TRIM蛋白具有共同的特征援岩，它們包含相同的RBCC基序排列，包括RING掏导、B-box和螺旋-螺旋結(jié)構(gòu)域享怀。可變c端結(jié)構(gòu)域的多樣性決定了TRIM蛋白在不同的細(xì)胞過程中的作用趟咆，如細(xì)胞增殖添瓷、分化、發(fā)育值纱、腫瘤發(fā)生鳞贷、和凋亡。TRIM蛋白的保守結(jié)構(gòu)跨越了從低等脊椎動物魚類到哺乳動物的多個物種虐唠。哺乳動物中的TRIM蛋白被廣泛報道搀愧，主要有200種通過直接的病毒限制或調(diào)節(jié)先天免疫應(yīng)答參與抗病毒免疫。TRIM5α是第一個發(fā)現(xiàn)的TRIM蛋白疆偿，作為一種抗病毒藥物咱筛，可直接與人類免疫缺陷病毒（HIV）衣殼蛋白結(jié)合。與此同時杆故，許多TRIM蛋白正向調(diào)控抗病毒先天免疫信號通路（TRIM4迅箩、TRIM21、TRIM25和TRIM56）或負(fù)向調(diào)控（TRIM11处铛、TRIM27饲趋、TRIM28、TRIM38和TRIM59）罢缸。此外篙贸，TRIM蛋白在魚類的抗病毒免疫系統(tǒng)中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。魚類具有幾個大的特異性基因擴增枫疆，包括finTRIMs (ftr)爵川， TRIM39/嗜血相關(guān)TRIM (btr)和trim35樣基因/hls5 (hltr)。其中息楔，finTRIM（ftr）是一個新的亞群寝贡，只存在于硬骨魚中，但在高等脊椎動物中沒有明顯的同源性值依。有限的報道表明圃泡，在病毒感染或IFN誘導(dǎo)后，F(xiàn)TR36和FTR83的表達可能會上調(diào)愿险，而ftr01通過TBK1的自噬-溶酶體降解負(fù)調(diào)控IFN反應(yīng)颇蜡〖鬯担可以看出，TRIM基因中的絕大多數(shù)與從魚類到人類的多物種的先天免疫過程有關(guān)风秤。

Ftr82可能是一個基礎(chǔ)的和祖先的finTRIM基因鳖目，在主要魚類分支中具有同源性。對用NJ方法構(gòu)建的ftr82的系統(tǒng)發(fā)育樹也進行了驗證（圖1）缤弦。斑馬魚中的大多數(shù)功能ftr基因通常在非沉炻酰基礎(chǔ)的低水平表達，并通過病毒感染或 IFN治療顯著上調(diào)碍沐。與ftr基因的典型特性不同狸捅，ftr82具有相對較高的組成水平表達，允許ISH信號檢測累提。研究表明尘喝，ftr82在24 hpf之前僅局限于外側(cè)中胚層和前腎中胚層，在48 hpf時到達耳泡斋陪、腸道瞧省、心臟、肝臟鳍贾、咽和靜脈，而在72-96 hpf時交洗，專注于腦鰓骑科、腸道、表皮构拳、腎咆爽、肝、咽和脾臟置森。在我們的WISH實驗中觀察到普遍一致的結(jié)果斗埂，然而，區(qū)別在于ftr82陽性信號總是局限于在96 hpf之前的不同階段的耳部囊泡（圖1D’-I’）凫海。一個系統(tǒng)和更詳細(xì)的ftr82表達提供了表達譜呛凶，以深入了解潛在的組織特異性功能。此外行贪，ftr82 在SVCV感染期間的6h和48 h時僅出現(xiàn)了輕微的上調(diào)漾稀。與最近的親屬ftr83不同，過表達ftr82并不誘導(dǎo)IFN的上調(diào)建瘫。根據(jù)之前關(guān)于ftr82的報道崭捍，它似乎是finTRIM基因中的一個特殊的基因，但沒有抗病毒活性的證據(jù)啰脚。此外殷蛇，另一份報告顯示，ftr82 影響了由Notch/VEGF通路介導(dǎo)的斑馬魚的血管模式。它似乎表明粒梦，ftr82基因的功能仍然很大程度上未知亮航。

考慮到ftr82在斑馬魚耳囊中的特異性高表達，我們推測ftr82可能在聽器官的發(fā)育中起作用谍倦。為了確定ftr82是否為聽力相關(guān)基因塞赂，我們首先構(gòu)建了ftr82突變體。ftr82基因的下調(diào)不僅影響耳小泡HC的形態(tài)發(fā)生昼蛀，還影響pLL系統(tǒng)HC的形態(tài)發(fā)生宴猾，表現(xiàn)為pLL嵴HC減少、纖毛縮短叼旋、神經(jīng)鞘和功能性HC減少(圖2仇哆、3、S2夫植、S3)讹剔。在CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)介導(dǎo)的ftr82突變體中也觀察到一致的hc缺陷表型(圖5和圖S4)，進一步證實了這是由ftr82缺失引起的详民。此外延欠，在ftr82突變體中出現(xiàn)了HC的異常表型，通過顯微注射外源性ftr82 mRNA可以挽救突變體(圖2沈跨、3由捎、5)。結(jié)果表明饿凛，HC的丟失是由ftr82的功能喪失引起的狞玛。雖然在WISH檢測中沒有檢測到pLL系統(tǒng)中的陽性信號(圖1D-1I)，但ftr82基因確實破壞了pLL中hc和神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育(圖3涧窒、5心肪、S3、S4)纠吴，這可能是由于WISH檢測方法的靈敏度限制硬鞍。眾所周知，細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的主要方式之一戴已。HC細(xì)胞凋亡可由半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(caspases)膳凝、p53腫瘤抑制基因、活性氧等多種因素觸發(fā)恭陡。據(jù)報道蹬音，在人乳腺癌細(xì)胞中，TRIM24缺失導(dǎo)致p53依賴的自發(fā)凋亡休玩，TRIM69通過p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡調(diào)控斑馬魚的發(fā)育著淆。在這里劫狠，我們檢測了切割的caspase-3 252信號，一個細(xì)胞凋亡的標(biāo)記永部，在近一半的ftr82 突變體幼蟲中與HCs共定位（圖6）独泞。結(jié)果表明，caspase-3激活介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致HCs缺陷的主要原因苔埋。斑馬魚HCs被認(rèn)為是用于感知外部聲音刺激和流體流動懦砂。ftr82缺失導(dǎo)致的HCs缺失導(dǎo)致了斑馬魚行為改變，表現(xiàn)為對外部聲音刺激的敏感性較低(圖4和5）组橄。綜上所述荞膘，我們的研究表明，ftr82是調(diào)控HC形態(tài)發(fā)生和聽覺功能的關(guān)鍵基因玉工。

Ftr82是魚類TRIMs家族的一員羽资，在這項工作中首次被發(fā)現(xiàn)參與了聽覺器官的發(fā)育。雖然在哺乳動物中沒有相應(yīng)的同源物遵班，但這并不妨礙我們對TRIMs功能的深入理解和推測屠升。斑馬魚作為一種常見的模式生物，在聽覺器官發(fā)育研究中具有無需解剖即可快速讀出表型狭郑、實驗周期短腹暖、成本低、熒光染色分析方便等明顯優(yōu)勢翰萨。這項工作不僅為全面了解ftr82基因的功能提供了充分的信息微服，而且為快速鑒定耳聾基因提供了新的見解。

斑馬魚的飼養(yǎng)和倫理聲明

本研究采用轉(zhuǎn)基因系Tg(Brn3c:mGFP)和野生型菌株AB缨历。在前者中，膜定位的綠色熒光蛋白(GFP)在HCs中特異性表達糙麦。按照我們之前的方案辛孵，斑馬魚成年魚和胚胎在28.5℃的環(huán)境中飼養(yǎng)和維持。所有動物實驗均經(jīng)南通大學(xué)動物保護與利用委員會批準(zhǔn)赡磅。所有動物均嚴(yán)格按照南通大學(xué)動物護理與使用委員會批準(zhǔn)的動物程序處理魄缚，符合國家衛(wèi)生研究院實驗動物護理與使用指南。

按標(biāo)準(zhǔn)程序進行全載原位雜交(WISH)焚廊。用設(shè)計的引物從斑馬魚胚胎cDNA文庫中克隆出466 bp的ftr82 cDNA片段(表S1)冶匹，并插入到pGEM-T-easy載體中。使用線性化pGEM-T-easy插入ftr82片段和DIG RNA標(biāo)記試劑盒(SP6&.T7) (Roche咆瘟， #11175025910)嚼隘，通過體外轉(zhuǎn)錄獲得地高辛標(biāo)記的反義探針。之后袒餐，將不同發(fā)育階段的無色素的預(yù)先固定的斑馬魚胚胎用探針孵育過夜飞蛹，用堿性磷酸酶(AP)-偶聯(lián)抗地高辛抗體(Roche谤狡， #11093274910)檢測。隨后卧檐，使用堿性磷酸酶(AP) -底物NBT/BCIP溶液(Roche墓懂， #11681451001)進行顯色反應(yīng)，以可視化目標(biāo)基因的表達霉囚。按照上述步驟捕仔，用設(shè)計好的引物合成eya1 mRNA探針(表S1)，用于識別斑馬魚幼體的神經(jīng)鞘盈罐。

嗎啡肽顯微注射液及效率驗證

利用基因工具公司合成了ftr82特異性剪接阻斷嗎啉榜跌。將嗎啉粉溶解在無RNAse的水中制備原液。然后將稀釋濃度為0.3 mM的嗎啉工作溶液微注射到單細(xì)胞期的斑馬魚胚胎中暖呕。通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）驗證了嗎啉在外顯子4和內(nèi)含子4連接位點引起錯誤剪接的效率斜做。從注射或不剪接嗎啉的胚胎中提取RNA，并逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄到cDNA湾揽。將設(shè)計引物標(biāo)記在第3外顯子和第7外顯子上（表S1）來檢測ftr82 297的敲除效率瓤逼。

sgRNA/Cas9 mRNA的合成、顯微注射和突變體的鑒定

為了獲得ftr82突變體斑馬魚库物，首先合成了靶向ftr82外顯子2的特異性單導(dǎo)RNA (sgRNA)霸旗。采用含有ftr82基因靶向區(qū)(5′-GGAGGAGCTGAAGACAGCGG -3′)的正向引物和通用反向引物(表S1)，以pT7質(zhì)粒為PCR模板擴增sgDNA戚揭。然后诱告，根據(jù)制造商的說明，使用MAXIscriptTM T7轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen民晒， #AM1314)精居，用sgDNA體外轉(zhuǎn)錄生成sgRNA。使用mMESSAGE MmachinTM T7 Kit (Invitrogen潜必， #AM1344)靴姿，用線性化的pXT7-Cas9質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄獲得Cas9 mRNA。將濃度分別為300 ng/μL和100 ng/μL的Cas9 mRNA和sgRNA混合溶液2 nL微注射到單細(xì)胞期斑馬魚胚胎中磁滚。為了確定是否發(fā)生突變佛吓，隨機選擇注射胚胎提取基因組DNA，并使用設(shè)計的內(nèi)含子1和內(nèi)含子2的測序引物進行擴增(表S1)垂攘。對含有靶向位點的擴增片段進行測序以確定突變類型维雇。

mRNA合成和挽救實驗

用設(shè)計的引物ftr82-mRNA-BamHI-F和ftr82-mRNA- XbaI-R擴增了含有ftr82開放閱讀框約2000 bp DNA(表S1)。將擴增片段插入人工pCS2+載體中晒他，獲得重組質(zhì)粒ftr82-pCS2+吱型。使用mMESSAGE MmachineTM SP6 Kit (Invitrogen，#AM1340)陨仅，以線性化重組質(zhì)粒為模板唁影，體外轉(zhuǎn)錄ftr82 mRNA耕陷，然后使用RNeasy Mini Kit (Qiagen，#74104)進行純化据沈。將50 ng/μL的ftr82 mRNA溶液約2 nL與sgRNA或morpholino共注射到單細(xì)胞期胚胎中進行拯救實驗哟沫。

FM4-64染色和免疫熒光

使用紅色熒光生命染料FM4-64特異性標(biāo)記神經(jīng)鞘中的功能性HCs，具體步驟如下锌介。將自由游動的幼蟲置于3 μM FM4-64胚液中嗜诀，室溫黑暗浸泡45 s。然后去除染料溶液孔祸，用胚液輕輕沖洗三次后成像隆敢。采用免疫熒光法檢測caspase-3細(xì)胞凋亡信號。受精后72 h的幼蟲在室溫下用4% (w/v)多聚甲醛固定2 h崔慧，然后用1% Triton X-100滲透30 min拂蝎，用10%驢血清在37℃下阻斷1 h。加入兔單克隆抗裂解caspase-3(1:500稀釋惶室，CST, 329 #9664)和雞多克隆抗gfp(1:500稀釋温自，Abcam，#ab13970)的一抗皇钞，在4°C孵育過夜悼泌。然后，分別用Alexa FluorTM 555驢抗兔lgG (H+L)(1:1000稀釋夹界，Invitrogen馆里，# A -31572)和Alexa FluorTM 488山羊抗雞lgG (H+L)(1:1000稀釋，Invitrogen可柿，# A -11039)的二抗檢測一抗鸠踪。最后用Hoechst 33342(10μg/mL, Invitrogen，#62249)在室溫下染色20 min, PBS洗滌3次成像复斥。此外营密，使用兔多克隆抗sox2(1:500稀釋，Abcam永票，#ab 97959)的一抗特異性識別pLL神經(jīng)鞘中的支持細(xì)胞。

快速反應(yīng)試驗

聲驚嚇反射的行為實驗進行如下滥沫。隨機選取25只受精后5 d（dpf）的正常幼蟲侣集，放入薄層胚培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。在皿的底部兰绣，我們在實驗中使用了6 dB和9 dB re ms-2到30 ms的刺激世分。每個刺激水平重復(fù)20次，用紅外攝像機在6秒的時間內(nèi)記錄幼蟲對聲音刺激行為反應(yīng)缀辩。然后臭埋，從錄像帶中提取幼蟲的運動軌跡踪央。并分析了運動的平均距離和峰值速度，作為量化幼蟲對聲音刺激的驚嚇反應(yīng)的典型參數(shù)瓢阴。

成像和統(tǒng)計分析

使用立體顯微鏡（Olympus畅蹂，MVX10）記錄WISH 實驗的結(jié)果。用共聚焦顯微鏡（Nikon荣恐，A1-DUT）記錄ftr82敲除或敲除模型的HC表型結(jié)果液斜、染色和免疫熒光結(jié)果。首先用三卡因MS-222（Sigma叠穆，#A5040）麻醉少漆，然后用0.6%低熔點瓊脂糖成像。獲得的共焦圖像采用Imaris X64軟件（版本352 9.0.1）進行處理硼被。所有實驗至少重復(fù)3次示损，數(shù)據(jù)以平均± SEM 3由PraphPadPrism分析（版本8.0.2）分析。采用雙尾嚷硫、非配對學(xué)生t檢驗確定組間的顯著性差異检访，P < 0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。條形圖上“*论巍、***烛谊、****、*****”的符號分別表示P < 0.05嘉汰、P < 0.01丹禀、P < 0.001、P < 356 0.0001鞋怀，“ns”表示無顯著性双泪。

基金：本研究由國家自然科學(xué)基金項目（2018YFA0801004；81870359）密似、江蘇省高等教育學(xué)校自然科學(xué)基金項目（22KJB320020）焙矛、江蘇省“創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)博士”項目資助。

詳細(xì)網(wǎng)址：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1673852722002521

注：因文章篇幅有限残腌，所有相關(guān)引用文獻村斟，以及補充圖、表可以點擊至原文查閱抛猫。