雜志：Cellular and Molecular Life Sciences

影響因子：8（2023）

年份：2022

通訊作者：

Renjie Chairenjiec@seu.edu.cn

通訊作者單位：

1.南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院冠王，南通發(fā)展與疾病實驗室赶撰，南通226019

2.南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院神經(jīng)再生協(xié)同創(chuàng)新中心舌镶，江蘇省與教育部神經(jīng)再生重點實驗室柱彻，南通226019

摘要

背景：毛細胞在聽力和平衡中起著關(guān)鍵作用，毛細胞的損失會導(dǎo)致聽力損失或前庭功能障礙餐胀。毛細胞生物學(xué)的細胞和分子研究使我們對聽力和耳聾有了更好的了解哟楷。斑馬魚,由于其富含毛細胞的器官，在世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用于毛細胞相關(guān)研究否灾。和哺乳動物一樣卖擅，斑馬魚也有內(nèi)耳毛細胞。此外墨技，它們也有側(cè)線神經(jīng)肥大毛細胞惩阶。這些不同類型的毛細胞在形態(tài)和功能上各不相同。然而扣汪，對其分子特性的系統(tǒng)分析仍然缺乏断楷。

方法：本研究采用單細胞rna測序技術(shù)(scRNA-seq)分析了從Tg(Brn3c:mGFP)幼蟲中分離得到的所有毛細胞均表達GFP的GFP+細胞。通過標記基因的原位雜交分析崭别，我們鑒定了毛細胞的三種亞型冬筒，即黃斑毛細胞(MHC)，嵴毛細胞(CHC)和神經(jīng)肥大毛細胞(NHC)茅主。毛細胞scRNA-seq數(shù)據(jù)揭示了毛細胞特異性基因舞痰，包括已在人類中鑒定的聽力損失基因和可能參與毛細胞形成和功能的新基因。

結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)了兩個新的基因在NHCs和MHCs中特異性起作用诀姚，這與它們在NHCs和MHCs中的特異性表達相對應(yīng)响牛。

結(jié)論：本研究揭示了斑馬魚毛細胞亞群的特異性基因，為人類前庭毛細胞和耳蝸毛細胞功能的遺傳學(xué)研究提供了新的思路。

關(guān)鍵詞：毛細胞呀打；scRNA-seq论衍；斑馬魚

前言

毛細胞，得名于細胞體表面的毛發(fā)狀結(jié)構(gòu)聚磺，通過纖毛探測機械振動坯台。靜纖毛尖端的機電轉(zhuǎn)導(dǎo)(Mechanoelectrical transduction,MET)通道在刺激下打開，引起毛細胞去極化瘫寝，并將神經(jīng)遞質(zhì)釋放到毛細胞和聽覺神經(jīng)元之間的突觸間隙中蜒蕾。內(nèi)耳機械感覺毛細胞，包括耳蝸毛細胞和前庭毛細胞焕阿，在哺乳動物的聽力和平衡中起著至關(guān)重要的作用咪啡。耳蝸毛細胞作為聲振動的感受器，可分為外毛細胞(OHCs)和內(nèi)毛細胞(IHCs)暮屡。前庭感覺上皮有兩種類型:斑狀上皮和嵴上皮撤摸。黃斑位于橢圓囊和球囊內(nèi)，嵴位于三個半規(guī)管的末端褒纲。這兩個前庭感覺上皮都由毛細胞和支持細胞組成准夷。前庭毛細胞可分為ⅰ型和ⅱ型毛細胞。黃斑毛細胞能感知線性加速度和重力當量莺掠，嵴毛細胞能感知角加速度和角減速衫嵌。在哺乳動物中，耳蝸毛細胞從蓋膜獲得機械信號彻秆，但嵴毛細胞和黃斑毛細胞分別感知來自內(nèi)淋巴和耳石的振動楔绞。

作為脊椎動物，斑馬魚有許多與人類相似的器官唇兑，這使它們成為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的優(yōu)秀動物模型酒朵。斑馬魚有一個類似耳朵的結(jié)構(gòu)，耳囊扎附；然而蔫耽，它們沒有耳蝸。在斑馬魚的耳囊泡中帕棉，有5簇毛細胞针肥、3簇嵴毛細胞和2簇黃斑毛細胞。在嵴香伴，包括前嵴(AC)慰枕、側(cè)嵴(LC)和后嵴(PC)，毛細胞將其纖毛放入內(nèi)淋巴中即纲，檢測頭部旋轉(zhuǎn)引起的內(nèi)淋巴流動具帮。在黃斑區(qū)，包括橢圓囊斑(UM)和囊斑(SM)，毛細胞的纖毛與耳石接觸蜂厅，如果發(fā)生加速度匪凡，耳石會產(chǎn)生運動。因此掘猿，黃斑毛細胞可以感知線性加速度和重力病游。研究表明，在斑馬魚中稠通，橢圓囊斑負責(zé)前庭功能衬衬，而囊斑是聽覺器官。與哺乳動物不同改橘，斑馬魚的側(cè)線系統(tǒng)中有神經(jīng)肥大毛細胞滋尉。這些毛細胞位于皮膚表面，是周圍水的感受器飞主，幫助它們發(fā)現(xiàn)獵物狮惜，躲避捕食者。由于易于給藥和成像碌识，神經(jīng)肥大毛細胞已被廣泛應(yīng)用于毛細胞相關(guān)的生物醫(yī)學(xué)研究碾篡，例如耳毒性藥物篩選。

斑馬魚模型已被廣泛應(yīng)用于聽力研究領(lǐng)域丸冕。然而耽梅，目前尚缺乏對這些毛細胞之間分子和形態(tài)差異的系統(tǒng)分析。在本研究中胖烛，我們利用scRNA-seq分析了斑馬魚毛細胞的基因表達，并揭示了不同亞型毛細胞之間的分子差異诅迷。

斑馬魚胚胎

斑馬魚保存在28.5℃佩番。本研究使用了兩種斑馬魚系，包括野生型AB和轉(zhuǎn)基因系Tg(Brn3c:mGFP)罢杉，這在之前的工作中有描述趟畏。所有動物程序均按照南通大學(xué)動物護理與使用委員會批準的方案進行，并符合國家衛(wèi)生研究院實驗動物護理與使用指南滩租。

單細胞RNA測序

將受精后6天(dpf) Tg(Brn3c:mGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚幼魚麻醉后赋秀，用0.25%胰蛋白酶處理使其游離成單細胞，通過熒光活化細胞分選器將其分為gfp陽性細胞和gfp陰性細胞律想，獲得gfp陽性細胞中表達的RNA猎莲，并利用10 ×Genomics平臺進行測序。

單細胞測序分析

單細胞測序分析的基本程序按照進行技即。簡單地說著洼，使用大鼠V4.0.1對單細胞測序數(shù)據(jù)進行綜合分析，包括數(shù)據(jù)過濾、數(shù)據(jù)歸一化身笤、細胞聚類和聚類水平標記基因鑒定豹悬。首先，通過“Crea-teSeuratObject”函數(shù)創(chuàng)建Seurat對象液荸，原始數(shù)據(jù)主要通過參數(shù)設(shè)置“min.cells=5,min瞻佛。feature=200"，這要求只考慮在至少5個細胞中表達的基因娇钱，只保留檢測到最少200個基因的細胞涤久。然后，通過Seurat中的“子集”函數(shù)進一步過濾數(shù)據(jù)忍弛，參數(shù)設(shè)置為“nFeature_RNA<5000&%”响迂。Mt<10”世蔗，這要求細胞包含不超過10%的線粒體基因讀取和多達5000個檢測到的基因呼胚。其次，應(yīng)用大鼠的“SCTransform”功能對數(shù)據(jù)進行歸一化旺坠，并通過第二次非正則化線性回歸(variable.features)對多個因素(線粒體表達百分比疯兼、UMIs總數(shù)和檢測到的基因總數(shù))進行回歸然遏。N=1000,vars.to.;regression=c("nFeature_RNA"，"nCount_RNA"吧彪，"percent.mt"))待侵。在細胞聚類中，首先采用主成分分析(PCA)提取前50個主成分姨裸，然后通過共享k最近鄰圖構(gòu)建和聚類模塊化函數(shù)優(yōu)化(k.param=20秧倾，分辨率=0.25)識別細胞聚類。為了識別每種細胞類型的標記基因傀缩，使用Seurat中的“FindAllMarkers”功能那先，參數(shù)設(shè)置為“only”。pos=TRUE,min.pct=0.25,logfc赡艰。閾值=0.25”售淡。“FindAllMarkers”功能中默認的Wilcoxon秩和檢驗用于聚類之間的差異表達基因檢測慷垮，其中p值進一步通過Bonferroni校正進行調(diào)整揖闸。

氧化GO富集分析使用R包clusterPro-filer，Seurat鑒定的標記基因作為輸入料身。針對每個細胞簇的標記基因分別分析了三個GO類別:BP(biological-cal Process)汤纸、CC(Cellular Component)和MF(molecular Function)，并通過Benjamini&Hochberg(BH)方法校正了p值惯驼，其中顯著富集的GO項定義為BH調(diào)整后p值小于0.05的項蹲嚣。通過在clusterProfiler中集成的富集方法递瑰，進一步將GO富集結(jié)果可視化。

整塊原位雜交

全胚原位雜交的過程與我們之前的描述相似隙畜。簡而言之抖部，我們設(shè)計并合成了針對目標編碼序列的基因特異性引物。用PCR方法擴增后议惰，將片段亞克隆到pGEM-T Easy載體(Promega)中慎颗。以線性化重組質(zhì)粒為模板，體外轉(zhuǎn)錄dig標記RNA探針言询。雜交步驟:先用地高辛標記RNA探針孵育預(yù)處理后的斑馬魚胚胎過夜俯萎，然后用堿性磷酸酶偶聯(lián)的地高辛一抗檢測RNA探針，清洗三次运杭。隨后夫啊，洗滌非特異性結(jié)合物，將堿性磷酸酶的底物NBT/BCIP溶液加入反應(yīng)體系中進行顯色反應(yīng)辆憔。最后撇眯，對樣本進行成像，并通過顯微鏡觀察基因特異性mRNA的表達虱咧。用于探針合成的引物如下:

capgb-F: ACC TGG TGC TGG ATA ACA GG;

capgb-R: ATC TGA GCT TTG CCG TGT CT;

C5H11orf1-F: TGA TGT CCA ATA AAA GCCAGGT;

C5H11orf1-R: CAC ACA TTG AGG CTCTGA AGT;

zdhhc16b-F: CCT GTG GAA TTATGG GAT GG;

zdhhc16b-R: ATG CTG CAGTGA TGA GTT CG;

tekt3-F: AGA TTT CAGCGC TGT CCG AT;

tekt3-R: AAG CAG CACGTT CAC TCT GA;

mb-F: TGA TCT GGT TCTGAA GTG CTG;

mb-R: GGC AAA TCC GATCTC CTT GT;

s100 - f: CCA AGA TGC CACGCT CAA AG;

s100 - r: CCC GCT AAC ACTTCT CTC GG熊榛。

Morpholino介導(dǎo)的基因敲低

基因特異性嗎啉酰亞胺(MOs)由Gene Tools, LLC合成。為了進行基因敲除腕巡，2-3 nL 0.3 mM的基因特異性嗎啉酰亞胺被微量注射到1 - 2細胞期斑馬魚胚胎中玄坦。在這里，moro - philinos被用來阻斷pre-mRNA的剪接绘沉，從而下調(diào)靶基因的表達煎楣。本研究中使用的morpholinos序列如下:

capgb-MO: TCT GGA GGA ACA AAG ATG AGATGG T;

mb-MO: ATC AGA GAG TCC TGC TTTACC CTG A。

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT - PCR)

RT-PCR按照標準程序進行梆砸。簡單地說转质，從斑馬魚胚胎中提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA帖世。以cDNA為模板，進行PCR實驗檢測基因表達沸枯。其中日矫，用于PCR的引物如下:

capgb-F: TCT GAC AGC ATG CCG GAG C;

capgb-R: TAA CAT TGG TGA TCT GAGCTT TGC;

mRNA拯救實驗

通過將特異性mRNA與morpholino共注射進行拯救實驗绑榴。以線性化的重組質(zhì)粒為模板哪轿，體外轉(zhuǎn)錄mRNA，其中包含特定基因的編碼序列翔怎。用于PCR擴增特定基因的引物如下:

capgb-mRNA-F: ACC TAG GTG CAG GAA CAGG;

capgb-mRNA-R: ACA ACT GGT TGA GTGCAG TTTA;

mb-mRNA-F: GCC CCG ATA TTGAAG ACA GGT;

mb-mRNA-R: TGA CTC CCATTT GAG ATC TGGT窃诉。

驚跳反應(yīng)試驗

斑馬魚驚嚇反應(yīng)測試按照程序進行杨耙。試驗中，將20條5 dpf的斑馬魚幼魚放入培養(yǎng)皿中自由游動飘痛。當聲刺激發(fā)生時珊膜，用高速攝像機(500 fps)記錄斑馬魚的行為。聽覺功能正常的斑馬魚在受到刺激時宣脉，會出現(xiàn)持續(xù)時間小于10 ms的特征性c型彎運動;而聽覺功能受損的斑馬魚則不會出現(xiàn)這種現(xiàn)象车柠。在這里，移動的距離和c型彎曲運動的次數(shù)被用來量化驚嚇反應(yīng)塑猖。

VOR測試

如前所述竹祷，VOR測試按照標準程序進行。簡單地說羊苟，用5%甲基纖維素將5 dpf的斑馬魚幼魚頭高位固定在艙內(nèi)塑陵。旋轉(zhuǎn)平臺，艙室單元固定蜡励，以30轉(zhuǎn)/分的速度來回旋轉(zhuǎn)令花。利用紅外攝像機記錄斑馬魚的眼球運動，并利用眼球投影區(qū)域的周期性變化來評價VOR值巍虫。

I成像并進行統(tǒng)計學(xué)分析

共聚焦熒光顯微鏡分析采用MS-222麻醉后將斑馬魚包埋在0.8%低熔點瓊脂糖中彭则，在尼康A(chǔ)1顯微鏡下進行成像。WISH實驗采用奧林巴斯MVX10顯微鏡進行亮視野成像占遥。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示俯抖，采用獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義瓦胎。

三種類型的形態(tài)特征斑馬魚的毛細胞

毛細胞在聽力和平衡中起著至關(guān)重要的作用芬萍，它們在形態(tài)和功能上是可變的。毛細胞區(qū)別于其他細胞的典型特征是細胞體表面的纖毛搔啊，包括纖毛和立體纖毛柬祠。毛細胞的纖毛可以通過立體纖毛束的偏轉(zhuǎn)來檢測機械振動，從而導(dǎo)致尖端連接的張力负芋，打開MET通道漫蛔，導(dǎo)致毛細胞去極化。在斑馬魚身上旧蛾，除了內(nèi)耳莽龟，還有毛細胞在其側(cè)線系統(tǒng)中，毛細胞按其形態(tài)可分為三種類型和位置锨天，即嵴毛細胞毯盈、黃斑毛細胞和神經(jīng)肥大毛細胞(圖1A)。前兩種都是位于內(nèi)耳病袄，在聽力和平衡中起著重要的作用搂赋，第三類是中耳道的關(guān)鍵組成部分側(cè)線系統(tǒng)赘阀，分布在皮膚表面，幫助魚感知環(huán)境水脑奠。雖然纖毛是所有毛細胞的共同結(jié)構(gòu)基公，這三種類型的毛細胞之間也存在差異。嵴毛細胞和黃斑毛細胞有直的肌纖毛捺信，看起來不靈活酌媒，神經(jīng)肥大的肌纖毛毛細胞可以彎曲自己來探測水的運動(圖1B–D))。對于纖毛的長度迄靠，以斑馬魚為例以3dpf幼魚為例秒咨，嵴毛細胞的纖毛最長，約為30μm黃斑毛細胞和神經(jīng)肥大毛細胞的肌纖毛分別約為10μm和20μm(圖1E)掌挚。從細胞體的大小來看雨席，黃斑毛細胞最大，神經(jīng)肥大毛細胞的細胞體最小其中最小(圖1F)吠式。

圖1 形態(tài)三種特征不同斑馬魚毛細胞的類型陡厘。A斑馬魚的示意圖毛細胞標記的幼魚。UO特占，橢圓耳石;SO糙置，囊性耳石;UMHC,囊狀的黃斑毛細胞;SMHC,囊狀黃斑毛細胞;ACHC,前嵴毛細胞;LCHC,側(cè)嵴毛細胞;PCHC,后嵴毛細胞。B-D高熒光圖像放大三種不同類型的毛細胞是目。不同類型的圖表細胞被呈現(xiàn)在盒子里用白色虛線繪制左下角谤饭。E-F:動纖毛的比較三種細胞體不同毛細胞的類型。*P < 0.05, ***P < 0.001, ****P < 0.0001

單細胞RNA測序顯示了不同斑馬魚毛細胞亞群

為了在分子水平上進一步區(qū)分不同類型的毛細胞懊纳，我們使用單細胞rna測序分析基因表達模式揉抵。本文以膜靶向綠色熒光蛋白(mGFP)標記毛細胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系Tg(Brn3c:mGFP)(圖2A)作為動物模型。斑馬魚的幼蟲在6 dpf被胰蛋白酶分離成單個細胞,使用熒光和GFP-positive細胞分類活化細胞分選(FACS)方法(圖S1, S2)嗤疯。后基于10×Genomics系統(tǒng)進行高通量測序冤今，獲得基因表達數(shù)據(jù)∶浚基于Seurat分析戏罢，將細胞分為21個簇。通過分析每個簇中最頂端基因的基因表達模式脚囊，簇0帖汞、5、7凑术、12的4個細胞簇被注釋為毛細胞，簇2所意、3淮逊、10的細胞被鑒定為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞催首。毛細胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞都是Tg(Brn3c:mGFP)斑馬魚的gfp表達細胞。其余為其他細胞泄鹏，gfp陰性由于不可避免的技術(shù)問題引入了gfp陽性細胞郎任，包括紅細胞、淋巴細胞备籽、肌細胞等(圖2B舶治、S3)。圖2 C车猬、D顯示了每個簇中檢測到的細胞數(shù)量和標記基因霉猛。對于每個簇，列出了排名前幾的標記基因珠闰，和文中還介紹了這些基因的表達模式(圖2 e)惜浅。

圖2 斑馬魚毛細胞的單細胞RNA測序細胞。A Tg(Brn3c:mGFP)轉(zhuǎn)基因的熒光圖像斑馬魚幼魚在3dpf伏嗜。視神經(jīng)頂蓋中表達gfp的細胞坛悉，橙色虛線環(huán)繞的是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs)，耳囊泡和側(cè)線系統(tǒng)中其他表達gfp的細胞是毛細胞承绸。B.UMAP分析斑馬魚scRNA-seq數(shù)據(jù)裸影。紅色圈出的四個細胞簇虛線標注為毛細胞。C军熏、D每簇檢測到的細胞數(shù)和標記基因轩猩。E每個簇中最主要基因的點圖。

使用原位雜交驗證毛細胞亞型的基因表達

我們進一步分析了在四個簇中表達的頂級標記基因羞迷，發(fā)現(xiàn)一些基因主要特異性地表達在其中一個簇中界轩，例如，tectb在簇5,zpld1a在簇12,cal1b在簇0和簇7(圖3B, S3)衔瓮。功能富集分析顯示浊猾，上述4個細胞簇中表達的很多基因具有毛細胞相關(guān)的生物學(xué)功能(圖3C-F)，這表明這些細胞是毛細胞热鞍。為了進一步確認毛細胞的聚類和注釋葫慎，我們進行了全載原位雜交(WISH)。zpld1a基因主要在嵴毛細胞中表達薇宠，根據(jù)我們的分析偷办，嵴毛細胞被認為位于簇12(圖3H)，這與之前的研究[21]一致澄港。至于簇0和7的細胞椒涯，雖然都是神經(jīng)肥大毛細胞，但它們之間存在差異回梧。根據(jù)成熟和年輕毛細胞標志物s100s[22]和prox1a[23]在兩個簇中的表達情況废岂，簇0的細胞被歸類為成熟神經(jīng)肥大毛細胞祖搓，簇7被歸類為年輕神經(jīng)肥大毛細胞(圖S4)。

另一方面湖苞，我們分析了支持細胞的標記基因klf17[24]拯欧，發(fā)現(xiàn)它主要表達在簇1的細胞中(圖S5)，這表明這一簇細胞是支持細胞财骨。同樣镐作，我們還分析了據(jù)報道在套細胞中表達的基因，如tnfsf10隆箩、ponzr6该贾、pkhd1l1、fat1b摘仅、crb3b靶庙、cts12、ovgp1和cldne[17]娃属，發(fā)現(xiàn)高水平表達這些基因的細胞聚集在簇9中(圖S6)六荒。然而，它們表達了一些已被證明在毛細胞中特異性表達的基因矾端，如myo6b[25]掏击、myo7aa[26](圖S7)，這提出了它們是可以分化為毛細胞的支持細胞的可能性秩铆。因此砚亭，我們得出結(jié)論，來自簇1和9的細胞分別是支持細胞和套細胞殴玛，來自簇14的細胞可能是毛細胞祖細胞捅膘。

如上文所示，通過我們的分析滚粟，來自簇0寻仗、5、7凡壤、12的細胞被認為是毛細胞署尤。在我們后續(xù)的研究中，這些毛細胞可以分為三個亞群亚侠，即黃斑毛細胞(簇5)曹体、嵴毛細胞(簇12)和神經(jīng)肥大毛細胞(簇0、7)(圖3A)硝烂。我們進一步分析了在四個簇中表達的頂級標記基因箕别，發(fā)現(xiàn)一些基因主要特異性地表達在其中一個簇中，如tectb在簇5,zpld1a在簇12,cal1b在簇0和7(圖3B, S3)。功能富集分析顯示究孕，上述4個細胞簇中表達的很多基因具有毛細胞相關(guān)的生物學(xué)功能(圖3C-F)啥酱，這表明這些細胞是毛細胞。為了進一步確認毛細胞的聚類和注釋厨诸，我們進行了全載原位雜交(WISH)。如圖3G所示禾酱，tectb基因高表達的細胞主要聚集在簇5中微酬，通過WISH證實tectb基因在黃斑毛細胞中特異性表達，包括胞狀毛細胞和囊狀毛細胞颤陶。zpld1a基因主要在嵴毛細胞中表達颗管，根據(jù)我們的分析，嵴毛細胞被認為位于簇12(圖3H)滓走，這與之前的研究一致垦江。簇0和7的細胞由于其標記基因(如cal1b)的表達模式，被認為是神經(jīng)肥大毛細胞(圖3I)搅方。至于簇0和7的細胞比吭，雖然都是神經(jīng)肥大毛細胞，但它們之間存在差異姨涡。根據(jù)兩個簇中成熟和年輕毛細胞標志物s100s和prox1a的表達情況衩藤，簇0的細胞被分類為成熟神經(jīng)肥大毛細胞，簇7被分類為年輕神經(jīng)肥大毛細胞(圖S4)涛漂。

另一方面赏表，我們分析了支持細胞的標記基因klf17，發(fā)現(xiàn)它主要表達在簇1的細胞中(圖S5)匈仗，這表明這一簇細胞是支持細胞瓢剿。同樣地，我們也分析了被報道表達的基因套細胞tnfsf10悠轩、ponzr6间狂、pkhd1l1、fat1b哗蜈、crb3b前标、cts12、ovgp1距潘、cldne等細胞表達這些高水平的基因聚類在簇9 (Fig.S6)炼列。對于簇14，這些細胞更接近UMAP簇中的支持細胞(簇1)(圖1B);然而音比，它們表達了一些已被證明在毛細胞中特異表達的基因俭尖，例如myo6b， myo7aa(圖S7)，這提出了一種可能性稽犁，即它們是可以分化為毛細胞的支持細胞焰望。簇1和簇9的細胞分別為支持細胞和套細胞，簇14的細胞可能為毛細胞祖細胞已亥。

圖3 斑馬魚的毛細胞分類熊赖。A 4簇毛細胞可以進一步分為3種類型，分別是黃斑毛細胞(簇5)虑椎、嵴毛細胞(簇12)和神經(jīng)肥大毛細胞(簇0和簇7)震鹉。B 4簇毛細胞中頂端基因的點圖。C-F 4簇毛細胞中表達基因的富集圖捆姜。G-I WISH的結(jié)果传趾。這里展示的基因分別在黃斑毛細胞(G)，嵴毛細胞(H)和神經(jīng)肥大毛細胞(I)中表達泥技。G和H右下方的圖像顯示基因表達的背側(cè)和放大視圖浆兰。紅色箭頭和箭頭分別表示內(nèi)耳毛細胞和神經(jīng)肥大毛細胞。

三種類型毛細胞的分子特性

鑒于不同類型的毛細胞聚集在不同的群體中珊豹，我們在分子水平上對可區(qū)分的毛細胞進行了比較簸呈。如圖所示2D，在聚類0平夜、5蝶棋、7、12中檢測到的標記基因數(shù)量分別為2352忽妒、1023玩裙、2029、928段直。黃斑毛細胞和嵴毛細胞這兩種內(nèi)耳毛細胞(簇5和簇12)共有568個基因吃溅，成熟和年輕的神經(jīng)肥大毛細胞(簇0和簇7)都表達了1677個標記基因。然而鸯檬，神經(jīng)肥大毛細胞和內(nèi)耳毛細胞僅共享少量標記基因决侈，可見它們在基因表達水平上的差異(圖4A)。此外喧务，在不同簇中表達的頂級標記基因也存在明顯差異(圖4B)赖歌。我們還通過基因本體(GO)術(shù)語進行了基因富集分析，發(fā)現(xiàn)這些不同類型的毛細胞在生物學(xué)過程功茴、分子功能和細胞組成方面存在顯著差異庐冯。例如，與內(nèi)耳毛細胞相比坎穿，神經(jīng)肥大毛細胞具有更多的能量代謝相關(guān)活動展父，這增加了它們工作需要更多能量的可能性(圖4C-E)返劲。神經(jīng)肥大毛細胞富含MET基因表達，MET通道是毛細胞功能所必需的栖茉，它們是由TMC1篮绿、TMC2、TMIE吕漂、LHFPL5和CIB2等多種組分組成的復(fù)合物亲配。具有功能性MET通道的毛細胞對正常聽力和平衡至關(guān)重要。此外痰娱，尖端鏈接在立體纖毛偏轉(zhuǎn)和MET通道門控中起重要作用弃榨，并被證明由CDH23和PCDH15兩種鈣粘蛋白組成。為了確定這些關(guān)鍵分子是否也在斑馬魚毛細胞中表達梨睁，以及這些不同的毛細胞之間有什么差異，我們分析了編碼這些重要蛋白的基因的表達模式娜饵。如圖5A-F所示坡贺，哺乳動物MET復(fù)合物組分的同源物在大多數(shù)神經(jīng)肥大毛細胞中表達;然而，只有一小部分內(nèi)耳毛細胞表達這些基因箱舞。編碼尖端鏈接成分的基因cdh23和pcdh15a在少數(shù)毛細胞中表達(圖5G-H)遍坟。

圖4 不同毛細胞之間的分子差異。A在不同毛細胞中表達的標記基因及其相關(guān)基因之間的關(guān)系晴股。B每簇毛細胞中頂端標記基因的熱圖愿伴。GO分析揭示了不同毛細胞在生物過程(C)、分子功能(D)和細胞成分(E)方面的不同特性电湘。

斑馬魚毛細胞scRNA - seq揭示了潛在的聽力損失基因

聽力是最重要的感覺功能之一隔节，它依賴于有功能的毛細胞。健康的毛細胞是聲音信號的感受器;因此寂呛，負責(zé)毛細胞發(fā)育怎诫、存活和功能的基因?qū)τ谡５穆犃σ埠苤匾?19個基因已被確定為人類非綜合征性聽力損失(NSHL)基因(https:// hered itaryheari nglos.org/)。在這些基因中贷痪，有96個人類基因在斑馬魚中有同源基因(圖6A)幻妓，這表明斑馬魚在NSHL基因方面與人類非常相似。此外,51人類NSHL基因有57個同源基因在斑馬魚毛細胞中表達(簇0劫拢、5肉津、7、12)舱沧，詳細信息如圖6B所示妹沙。除了已鑒定的人類NSHL基因的同源物外，還有3000多個基因在斑馬魚毛細胞中特異性表達(圖6C)狗唉。其中一些基因被認為對毛細胞功能至關(guān)重要初烘，它們很有可能是潛在的聽力損失基因。換句話說，這些數(shù)據(jù)可能會為我們在聽力損失基因識別方面的科學(xué)研究提供明確的方向肾筐。在這一思路的指導(dǎo)下哆料，我們隨機選取了一些基因進行進一步分析，發(fā)現(xiàn)這些基因在斑馬魚內(nèi)耳和神經(jīng)肥大毛細胞中有一個或兩個都有特異性表達(圖6D)吗铐，說明這些基因在毛細胞相關(guān)的生物學(xué)過程中發(fā)揮作用东亦，甚至可能對聽力功能至關(guān)重要。

圖6 斑馬魚毛細胞scRNA-seq揭示了潛在的聽力損失基因唬渗。A已知人類NSHL基因與斑馬魚毛細胞富集基因之間的關(guān)系典阵。B人類NSHL基因列表，這些基因在斑馬魚毛細胞中有同源物表達镊逝。C斑馬魚中人類NSHL基因的同源物和斑馬魚各簇毛細胞中表達的標記基因的Venn圖壮啊。數(shù)字表示基因的數(shù)量。D斑馬魚胚胎中毛細胞富集基因的表達模式對參與毛細胞發(fā)育的候選基因進行功能分析撑蒜。

對參與毛細胞發(fā)育的候選基因進行功能分析

我們的scRNA-seq分析揭示了斑馬魚毛細胞中特異性表達的基因歹啼，其中一些是人類NSHL基因的同源物;然而，許多在毛細胞發(fā)育或功能中起作用的基因尚未被報道座菠。為了研究富集毛細胞的基因的功能狸眼，我們以capgb和mb基因為例，它們分別主要表達于神經(jīng)肥大毛細胞和黃斑毛細胞(圖6D, S8)浴滴。在這里拓萌，我們使用嗎啉介導(dǎo)的基因敲低來下調(diào)基因表達(圖S9)。如圖7A, B所示升略，與同窩對照相比微王，capgb-morphants的側(cè)系神經(jīng)突毛細胞減少，而這種異辰嫡可以通過提供野生型capgb-mRNA來挽救骂远。此外，在驚嚇反應(yīng)測試中腰根，capgb-morphants對聲刺激的反應(yīng)更少(圖7C, D)激才，這表明它們的毛細胞在一定程度上失去了功能。同樣额嘿，在另一項實驗中瘸恼，mb基因敲低導(dǎo)致黃斑毛細胞減少，這可以通過聯(lián)合注射mb- mrna來恢復(fù)(圖7E,F)册养，并且mb-morphants在前庭-眼反射(VOR)測試中顯示出嚴重異常的平衡能力(圖7G, H)东帅。

圖7 參與毛細胞發(fā)育的候選基因功能分析。A,B capgb基因敲低導(dǎo)致斑馬魚的神經(jīng)肥大毛細胞減少球拦。C, D capgb-morphants對聲刺激的反應(yīng)較弱靠闭。E, F mb基因敲低導(dǎo)致斑馬魚黃斑毛細胞減少帐我。G, H mb-morphants顯示出受損的平衡能力。* p< 0.05愧膀，** p<0.01拦键， **** p<0.0001

討論

在哺乳動物中，內(nèi)耳毛細胞可以檢測到機械信號并將其轉(zhuǎn)化為生理信號檩淋，然后通過聽覺神經(jīng)元傳遞到大腦芬为。內(nèi)耳毛細胞可分為耳蝸毛細胞和前庭毛細胞，分別在聽力和平衡中發(fā)揮重要作用蟀悦。兩種類型的毛細胞在結(jié)構(gòu)和功能上各不相同媚朦。斑馬魚作為一種優(yōu)秀的動物模型，擁有數(shù)百個毛細胞日戈，是研究毛細胞功能的良好模型询张。與哺乳動物類似，斑馬魚有內(nèi)耳浙炼，由半規(guī)管和耳石組成;然而瑞侮，斑馬魚的內(nèi)耳中卻沒有耳蝸。因此鼓拧，內(nèi)耳毛細胞在斑馬魚體內(nèi)可分為黃斑毛細胞和嵴毛細胞。除了內(nèi)耳毛細胞外越妈，斑馬魚的側(cè)線系統(tǒng)中還有第三種毛細胞——神經(jīng)肥大毛細胞季俩。這三種不同的毛細胞在形態(tài)上各不相同;然而，它們之間的分子差異尚不清楚梅掠。

本研究利用單細胞rna測序的方法分析了斑馬魚毛細胞的基因表達模式酌住，揭示了不同類型毛細胞之間的分子差異⊙质悖總之酪我，在質(zhì)量控制之后，scRNA-seq數(shù)據(jù)使用UMAP方法進行降維處理且叁，所有測序的細胞被分類為21個簇都哭。注釋后,根據(jù)已知的標記基因和基因表達模式在數(shù)據(jù)庫中(http:// zfin.Org/)，我們鑒定出4組細胞簇逞带，分別為黃斑毛細胞欺矫、嵴毛細胞和神經(jīng)肥大毛細胞。進一步的WISH驗證證實了我們在接下來的分析中所發(fā)現(xiàn)的細胞簇和注釋展氓。至于其他類型的細胞穆趴，如支持細胞、套細胞和上皮細胞遇汞，它們是gfp陰性(圖S3)未妹，但在我們的FACS分選中不能過濾掉簿废。可能的機制是它們與gfp陽性細胞络它，即毛細胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞相互作用族檬，并被分選，與gfp陽性細胞偶聯(lián)酪耕。

此外导梆，我們對這些不同亞型的毛細胞進行了比較，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)肥大毛細胞比內(nèi)耳毛細胞具有更強的MET成分表達和能量代謝相關(guān)活性迂烁。此外看尼，我們通過scRNA-seq分析了已知的人類NSHL基因與斑馬魚毛細胞標記基因之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)42.86%的人類NSHL基因在斑馬魚毛細胞中有同源基因表達盟步，進一步體現(xiàn)了我們數(shù)據(jù)的可靠性藏斩。另一方面，在我們的毛細胞scRNA-seq基因庫中却盘，有很多基因尚未被報道起作用毛細胞狰域，這就提出了這些基因在毛細胞功能甚至聽力損失基因識別方面具有潛在價值的可能性。我們隨機選取了一些標記基因進行進一步分析黄橘，發(fā)現(xiàn)mb和capgb基因分別在斑馬魚內(nèi)耳黃斑毛細胞和側(cè)線神經(jīng)肥大毛細胞中特異性表達兆览。基因功能分析也表明這兩個基因是毛細胞發(fā)育或功能所必需的;因此塞关，這兩個基因的敲除會導(dǎo)致毛細胞丟失和毛細胞功能障礙抬探。

據(jù)我們所知，Mb基因編碼的肌紅蛋白是一種含有153個氨基酸的單鏈血紅素蛋白帆赢。它主要存在于心臟和骨骼肌中小压，最近的研究表明，它也存在于多種非肌肉組織中椰于，如腦怠益、腎、鰓和肝瘾婿。肌紅蛋白在肌細胞中具有運輸和儲存氧氣的功能蜻牢，它還可以促進癌細胞中活性氧(ROS)和NO的清除。然而憋他，肌紅蛋白在毛細胞中的作用尚未見報道孩饼，本研究首次證明mb基因在斑馬魚內(nèi)耳毛細胞中表達，并且在毛細胞的發(fā)育和功能中起重要作用竹挡。我們需要進一步的研究來揭示毛細胞功能的分子機制镀娶。

CAPG編碼一種凝溶膠蛋白樣帽蛋白，作為原癌基因揪罕，參與多種癌細胞的遷移和侵襲梯码。最近宝泵，在突尼斯的1例自閉癥、智力障礙和聽力障礙患者及其患病基因中發(fā)現(xiàn)了染色體2p11.2區(qū)罕見的純合缺失主要包括ELMOD3轩娶、CAPG和SH2D6儿奶。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)capgb基因主要表達在斑馬魚的神經(jīng)肥大毛細胞中鳄抒，并且是聽力所必需的闯捎，表明它在聽覺功能中起著至關(guān)重要的作用。然而许溅，CAPG如何促進毛細胞發(fā)育和聽力瓤鼻，值得進一步研究。

結(jié)論

綜上所述贤重，在本研究中茬祷，我們通過scRNA-seq鑒定了三個毛細胞亞群，分別對應(yīng)于斑馬魚的斑斑毛細胞并蝗、嵴毛細胞和神經(jīng)肥大毛細胞祭犯。此外，我們還發(fā)現(xiàn)了斑馬魚毛細胞中的數(shù)千個基因滚停，這將有助于我們未來的毛細胞生物學(xué)研究沃粗。基于差異基因表達键畴，Lush陪每，等人發(fā)現(xiàn)毛細胞可以細分為年輕毛細胞和成熟毛細胞，這兩種不同的毛細胞有著與年輕毛細胞截然不同的分布和基因表達細胞形成一個環(huán)并表達atoh1b镰吵。不同的是，我們目前的工作首次揭示了三種不同類型毛細胞和特定標記基因之間的分子差異挂签，為理解聽力和平衡的機制提供了進一步的見解疤祭。

基金：國家自然科學(xué)基金資助項目:http://www.nsfc.gov.cn (2018YFA0801004，劉東81870359;31900484：謝剛才)饵婆；江蘇省自然科學(xué)基金勺馆，http://www.kjjh.jspc.org.cn (BK20180048, BRA2019278，劉東收到 )侨核；BK20190924送給謝剛才草穆；BK20190920給魏冠云)。資助者不參與研究設(shè)計搓译、數(shù)據(jù)收集和分析悲柱、決定發(fā)表或文稿撰寫。

文章原文：Single-cell RNA-sequencing of zebrafish hair cells reveals novel genes potentially involved

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