雜志：Ecotoxicology and Environmental Safety

影響因子：6.8（2022-2023）

年份：2023

通訊作者：Huiqiang Lu1损肛，Yijian Chen2

通訊作者單位：1Ganzhou Key Laboratory for Drug Screening and Discovery, School of Geography and Environmental Engineering, Gannan Normal University, Ganzhou 341000 Jiangxi, PR China

2Department of Osteology and Biomechanics, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Lottestr. 55A, 22529 Hamburg, Germany.The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University, Ganzhou 341000, China; The Endemic Disease (Thalassemia) Clinical Research Center of Jiangxi Province, Ganzhou 341000, China

摘要

噻氯匹定主要通過拮抗血小板p2y12受體發(fā)揮抗血小板作用。既往有研究表明噻氯匹定可引起肝損傷荣瑟，但其肝毒性的確切機制尚不清楚治拿。氧化應激、代謝紊亂笆焰、肝細胞凋亡劫谅、脂質過氧化、炎癥反應等均可導致肝臟損傷嚷掠，從而引起肝毒性捏检。

為了深入探討噻氯匹定肝毒性的潛在分子機制，本研究以斑馬魚為模式生物不皆，綜合評價噻氯匹定的肝毒性及其相關機制贯城。受精后3天，斑馬魚幼體暴露于不同濃度(1.5粟焊、1.75和2 μg/mL)的噻氯匹定72小時冤狡，而成年斑馬魚暴露于4 μg/mL的噻氯匹定28天。噻氯匹定暴露后项棠，斑馬魚幼魚肝臟形態(tài)發(fā)生改變悲雳，體長縮短，魚鰾發(fā)育延遲香追。噻氯匹定暴露的斑馬魚幼魚和成魚的肝組織經蘇木精-伊紅染色顯示肝組織內空泡化和細胞間間隙增加合瓢。此外，通過油紅O和過碘酸-希夫染色法以及噻氯匹定染毒斑馬魚幼魚和成魚的不同代謝酶檢測透典，提示噻氯匹定染毒斑馬魚幼魚和成魚均存在肝臟代謝異常和肝損傷晴楔。噻氯匹定還顯著升高炎癥和氧化應激，并降低肝細胞增殖峭咒。在使用n -乙酰半胱氨酸進行搶救干預時税弃，我們觀察到噻氯匹定引起的肝臟形態(tài)學改變明顯改善，體長縮短凑队，魚鰾發(fā)育延遲则果，肝組織增殖明顯改善。

綜上所述漩氨，噻氯匹定可能通過上調氧化應激水平抑制斑馬魚的正常發(fā)育和肝臟增殖西壮，從而導致胚胎發(fā)育毒性和肝臟毒性。本研究以斑馬魚為模式生物叫惊，闡明噻氯匹定上調氧化應激信號通路對斑馬魚的發(fā)育毒性和肝毒性款青，為臨床應用提供理論依據(jù)。

關鍵詞:肝毒性霍狰，噻氯匹定抡草，氧化應激饰及，斑馬魚，N-乙酰半胱氨酸渠牲。

介紹

糖尿病是一種以血糖升高為特征的慢性代謝性疾病旋炒，是全球范圍內快速增長的疾病，預計到2045年糖尿病患者數(shù)量將達到6.93億签杈。與糖尿病相關的大血管(如心瘫镇、腦血管和下肢血管疾病)和微血管并發(fā)癥(如糖尿病腎病、視網(wǎng)膜病變和神經病變)并發(fā)癥可導致嚴重后果答姥，如截肢铣除、半癱、失明和尿毒癥鹦付，給醫(yī)療機構和家庭帶來沉重負擔尚粘。研究表明，高血糖可導致血小板活化和聚集敲长，誘導炎癥和活性氧(ROS)產生郎嫁，導致血栓性疾病的發(fā)生。因此祈噪，控制血糖等相關指標以早期預防和治療糖尿病并發(fā)癥非常重要泽铛。

噻氯匹定是一種在臨床上用于預防血栓性疾病的酸性噻吩吡啶衍生物,有效抑制ADP誘導的血小板聚集，并作為P2Y12受體拮抗劑發(fā)揮作用辑鲤。在糖尿病患者中盔腔，使用噻氯匹定可有效預防血栓性并發(fā)癥，但已發(fā)現(xiàn)噻氯匹定在預防血栓性疾病時具有許多并發(fā)癥副作用月褥，例如噻氯匹定對人骨髓祖細胞的毒性作用呈劑量依賴性弛随。它對中性粒細胞和淋巴細胞也有毒性，對粒細胞的毒性更嚴重宁赤，其易感性是由于形成髓過氧化物酶的代謝物舀透。此外，已知噻氯匹定會引起隱桿菌的形態(tài)變化决左，急性暴露可能導致藥物積累和致死愕够。最近的研究發(fā)現(xiàn)，噻氯匹定對非洲爪蟾胚胎和人類臍靜脈內皮細胞具有致畸作用哆窿。重要的是链烈，噻氯匹定也顯示出明顯的肝毒性厉斟，并且有臨床報告稱使用噻氯匹定后患者出現(xiàn)肝損傷挚躯。然而，肝毒性的具體分子機制尚不清楚擦秽。

氧化應激通常被描述為生物體內氧化和抗氧化系統(tǒng)的破壞码荔，通常由ROS積累引起漩勤。ROS是由分子氧衍生而來的活性分子，主要包括超氧陰離子和過氧化氫缩搅。作為抗氧化系統(tǒng)的一部分越败，ROS在基礎水平上直接參與細胞增殖和分化，對人體的正常發(fā)育至關重要硼瓣，不僅參與人體細胞的正常增殖究飞，還在多種人類疾病的信號通路中發(fā)揮重要作用，如腫瘤和炎癥堂鲤。然而亿傅，ROS的過度積累會通過影響生物大分子(如蛋白質、RNA和DNA)和相應組織器官的功能瘟栖，對細胞造成嚴重的損傷葵擎。肝臟是人體物質和能量代謝的主要器官。它加工半哟、分配和代謝脂類酬滤、蛋白質、葡萄糖和其他重要營養(yǎng)素寓涨。此外盯串，肝臟在維持機體免疫和內分泌穩(wěn)態(tài)方面也發(fā)揮著巨大的作用。近年來的研究表明缅茉，許多肝臟疾病(如脂肪肝嘴脾、肝炎和肝硬化)可導致氧化應激，促進疾病的發(fā)展蔬墩。藥物或酒精可導致ROS在肝內持續(xù)累積译打，從而引起氧化應激。ROS的積累會嚴重影響肝臟的脂質代謝拇颅，引發(fā)肝臟脂毒性奏司。ROS蓄積還可激活肝臟核因子-κB (NF-κB)信號通路。這種激活反過來會促進肝臟炎癥樟插。由于ROS主要在線粒體中產生韵洋，ROS的積累會影響線粒體，最終導致肝細胞的損傷黄锤√掠В總之,氧化應激在肝損傷過程中起著重要的作用。

近年來鸵熟，斑馬魚被廣泛用作模式生物副编。出生5天的斑馬魚幼魚發(fā)育了包括肝臟在內的所有消化器官。因此流强，斑馬魚已成為研究肝臟疾病的一種有影響力的動物模型痹届。斑馬魚的其他重要特征有助于研究呻待，包括與人類有87%的遺傳同源性，高生育率和易于獲得队腐，以及透明的胚胎和幼蟲蚕捉，可以通過實時成像實時動態(tài)觀察肝臟。斑馬魚的肝臟在細胞組成柴淘、轉錄譜和功能方面與哺乳動物的肝臟非常相似迫淹。

我們之前的研究發(fā)現(xiàn)噻氯匹定顯著上調斑馬魚的氧化應激水平。因此为严，我們提出噻氯匹定可能通過上調氧化應激信號通路誘導斑馬魚的發(fā)育毒性和肝毒性的假說千绪。為了驗證這一假設，我們將受精后72小時(hpf)的斑馬魚幼魚暴露于不同濃度(0梗脾、1.5荸型、1.75和2μg/mL)的噻氯匹定。我們評估了以下幾個因素:(1)發(fā)展和死亡率炸茧；(2)肝臟形態(tài)瑞妇；(3)肝組織形態(tài)學改變及相關代謝指標；(4)氧化應激相關基因的表達梭冠；(5)肝毒性和發(fā)育遲緩辕狰。本研究旨在闡明噻氯匹定肝毒性及發(fā)育遲緩的分子機制，為其今后的臨床應用提供依據(jù)控漠。

材料和方法

噻氯匹定購自中國上海先鼎生物技術有限公司(分析標準品蔓倍，CAS號;53885-35-1) 。用二甲亞砜(DMSO)配制0.8 mg/mL的原液盐捷，?20℃保存偶翅。過碘酸希夫(PAS)染色、胞質異檸檬酸脫氫酶(ICDHC)碉渡、葡萄糖6-磷酸脫氫酶(G6PDH)聚谁、糖原分析試劑盒購自北京Solarbio公司。分析工具對谷胱甘肽轉氨酶(GPT)滞诺、谷胱甘肽轉氨酶(得到),過氧化氫酶(CAT)形导、超氧化物歧化酶(SOD)、甘油三酯(TG)习霹、總膽固醇(TC)和活性氧測定包被購自南京建成生物工程研究所(中國南京)朵耕。RNA提取試劑盒、cDNA逆轉錄酶試劑盒和SYBR green購自北京全風格黃金有限公司(北京)淋叶。蘇木精-伊紅(HE)試劑阎曹、油紅O檢測試劑盒等均購自上海三根生物技術有限公司。

斑馬魚品系和培養(yǎng)

斑馬魚成年野生型(AB)、轉基因Tg (mfap4: GFP)(標記巨噬細胞)和轉基因Tg (fabp10a: DsRed)(標記肝細胞)由國家斑馬魚資源中心(CZRC)提供芬膝，并根據(jù)CZRC方案在特定的pH和電導率下維持。

藥物暴露

為了驗證噻氯匹定對發(fā)育中的斑馬魚幼魚和成年魚是否具有肝毒性形娇，我們將斑馬魚幼魚和成年魚分別暴露于噻氯匹定锰霜。使用DMSO稀釋原液。將發(fā)育良好的72 hpf斑馬魚胚胎(每孔20只)置于6孔板中桐早，暴露于濃度為0 ~ 8 μ g/mL的噻氯匹定癣缅，測定24、48哄酝、72 h斑馬魚胚胎死亡率友存。從初始實驗開始，觀察斑馬魚的死亡率和肝臟表型陶衅。根據(jù)結果,我們決定暴露濃度的ticlopidine幼魚是0,1.5,1.75和2μg / mL, ticlopidine成年魚4μg / mL屡立。隨后，72 hpf的斑馬魚幼魚暴露于噻氯匹定溶液(0搀军、1.5膨俐、1.75和2 μg/mL) 72 h(每24h更換1次)。成年魚暴露于4 μg/mL的噻氯匹定溶液1個月罩句，每24h更換1次焚刺。

熒光顯微鏡

將Tg (fabp10a: DsRed)斑馬魚幼魚暴露于氯匹定溶液(0、1.5门烂、1.75和2 μg/mL)中乳愉，72 h后用三卡因麻醉。將幼魚用1%低熔點瓊脂糖固定在培養(yǎng)皿中屯远，使用熒光體視顯微鏡(Leica M205FA體視顯微鏡蔓姚，德國)獲取斑馬魚全身和肝臟的熒光圖像以及局部白光圖像。通過Image j計算斑馬魚胚胎的肝面積和體長來評估噻氯匹定對斑馬魚肝臟的影響慨丐。此外赂乐，將Tg (fabp10a: DsRed)和Tg (mfap4: GFP)雜交斑馬魚胚胎分別用噻氯匹定溶液(0、1.5咖气、1.75挨措、2 μg/mL)處理3 d，通過TCS SP8共聚焦顯微鏡(Leica崩溪，德國)獲取圖像浅役，檢測肝臟區(qū)域的巨噬細胞計數(shù)。

HE和PAS染色

將72 hpf的斑馬魚幼魚暴露于不同濃度的噻氯匹定(0伶唯、1.5觉既、1.75和2 μg/mL) 72 h后，分別收集在分離的離心管中，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次(每次洗滌5 min)瞪讼，在室溫和黑暗中固定在布因固定液中過夜钧椰。使用Leica石蠟切片機對包埋的蠟塊進行切片，并對切片進行染色(HE和PAS染色)和密封(使用中性樹脂和蓋玻片)符欠。這些切片最終使用徠卡DM2500顯微鏡成像嫡霞。

油紅O染色

將72 hpf的斑馬魚幼魚暴露于不同濃度(0、1.5希柿、1.75和2 μg/mL)的噻氯匹定72 h后诊沪，收集到不同的離心管中。然后使用4%多聚甲醛(4% PFA)在4℃固定過夜曾撤，隨后進行三次洗滌端姚，每次使用PBS持續(xù)5分鐘。然后用60%異丙醇孵育30 min挤悉，用60%異丙醇配制的3 mg/mL油紅O溶液染色2.5 h渐裸，用60%異丙醇洗滌去除多余的染色液，用PBS沖洗装悲。最后使用徠卡熒光體視顯微鏡進行圖像采集橄仆。成年斑馬魚暴露于不同濃度的噻氯匹定30天，隨后用4% PFA固定過夜衅斩。去除4% PFA后盆顾，將肝組織包埋于OCT包埋劑中，并切成10 mm厚切片(德國徠卡CM3050S)畏梆。切片用60%異丙醇孵育10 s您宪，油紅O染色15 min，洗去多余染色液后奠涌，蘇木精染色細胞核宪巨，甘油明膠和蓋玻片封片。使用徠卡DM2500顯微鏡采集圖像溜畅。

氧化應激與酶活性

為了觀察氧化應激捏卓，在不同條件下處理后，收集斑馬魚樣本慈格，用PBS洗滌3次5 min怠晴，在28.5℃(斑馬魚的最適生存溫度)與2 '，7 ' -二氯二氫熒光素二乙酸鹽(DCFH-DA;5μM),洗了三次PBS和使用激光共焦顯微鏡成像浴捆。不同的酶(GPT蒜田、GOT、ICDHC选泻、G6PDH冲粤、CAT和SOD)以及TG和TC水平根據(jù)各自試劑盒中列出的制造商說明進行測定美莫。

抗體染色試驗

將72 hpf的斑馬魚幼魚暴露于不同濃度的噻氯匹定(0、1.5梯捕、1.75和2 μg/mL) 72 h后厢呵，收集在分離的離心管中，使用4% PFA在黑暗中固定過夜傀顾。剝去斑馬魚幼魚肝部位表面皮膚襟铭，用抗pcna抗體(1:500;生命技術，Abcam锣笨，英國)。最后,圖像獲得使用TCS SP8共焦顯微鏡(德國徠卡)道批。

基因表達分析

使用TransZol Up (TransGen)從不同濃度(0错英、1.5、1.75和2 μg/mL)的噻氯匹定孵育72 h后的斑馬魚幼魚(72 hpf)中提取總RNA隆豹，隨后反轉錄形成cDNA椭岩。采用SYBR Green試劑盒(Takara，中國大連)進行qPCR璃赡，以β-actin作為內對照判哥。采用QTOWER3G系統(tǒng)(Analytik Jena，德國)評估炎癥和細胞增殖相關基因水平碉考。補充表1顯示了本研究中使用的引物序列塌计。

救援實驗

將72 hpf的斑馬魚幼魚分別置于6孔板(每孔20條)中，分別設置3組條件:(1)0.003% 1-苯基2-硫脲(對照組)侯谁、(2)1.75 μg/mL噻氯匹定(實驗組)和(3)1.75 μg/mL噻氯匹定+ 1.5 mM n -乙酰半胱氨酸(NAC)(挽救組)锌仅。所有三組接受治療72 h緊隨其后的是微觀分析如上所述。

統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism 9.0軟件進行統(tǒng)計學分析墙贱。比較了使用學生的學習任務或單向方差分析热芹。不同實驗(包括治療組和對照組的比較)的實驗值和相關誤差以均數(shù)±標準差表示。p值≤0.05表示差異有統(tǒng)計學意義惨撇。每個實驗重復3次伊脓。

結果

將斑馬魚幼魚暴露于噻氯匹定后，我們觀察到較高水平的胚胎死亡率魁衙，這種死亡率以劑量依賴性方式發(fā)生(圖1A)巢墅。此外讼溺，隨著噻氯匹定濃度的增加，斑馬魚幼魚的體長逐漸縮短(圖1C)。雖然肝臟面積沒有變化(圖1D)蚀苛，但隨著噻氯匹定濃度的增加，肝臟的形態(tài)學變化更加明顯痒钝。在濃度為2 μg/mL時痴昧，魚鰾逐漸變小甚至消失(圖1B)。

圖1 暴露于噻氯匹定的斑馬魚的胚胎和肝臟表型。(A)在指定時間點暴露于指定濃度噻氯匹定的胚胎死亡率統(tǒng)計米丘。(B)暴露于指定濃度的噻氯匹定72h后的白光和熒光圖像剑令。黃色箭頭表示魚鰾，紅色箭頭表示卵黃囊拄查。(C)暴露于指定濃度的噻氯匹定72h后吁津，在白光下的體長統(tǒng)計。(D)暴露于指定濃度的噻氯匹定72h后堕扶，肝臟的熒光面積統(tǒng)計(值代表平均值±標準差)***P < 0.05,P < 0.01,***P < 0.001,ns,無統(tǒng)計學意義)碍脏。

噻氯匹定對斑馬魚幼魚肝臟病理變化及代謝的影響

對照幼蟲肝組織切片染色可見正常肝組織形態(tài)，細胞完整稍算、飽滿典尾，細胞核呈球形，細胞間接觸緊密糊探。相比之下钾埂，暴露于噻氯匹定的幼蟲表現(xiàn)出肝細胞損傷，表現(xiàn)為變形科平、細胞間接觸疏松和實質性空泡形成(圖2A)褥紫。用PAS和油紅O染色法檢測對照組和染毒組斑馬魚幼魚的糖原和脂質含量時，對照組肝臟PAS染色較深瞪慧，表明糖原含量較高且分布較均勻髓考。相比之下，噻氯匹定暴露組的肝臟PAS染色較淺弃酌，表明糖原含量顯著減少(圖2B)绳军。此外，與對照組相比矢腻，噻氯匹定暴露組的肝臟油紅O染色顏色顯著增加门驾，顯示出噻氯匹定劑量依賴性的肝臟脂質含量增加(圖2C)。

圖2 噻氯匹定誘導斑馬魚幼魚肝臟組織學改變及代謝異常多柑。(A)暴露于指定濃度噻氯匹定72h后肝臟he染色圖像:黃色矩形框表示放大區(qū)域奶是，紅色和黃色箭頭分別表示細胞間隙和異常細胞腔。(B)暴露于指定濃度的噻氯匹定72h后的肝臟PAS染色:黃色矩形框表示放大區(qū)域竣灌。(C)暴露于指定濃度的噻氯匹定72h后的肝臟油紅O染色圖像:黃色虛線框代表斑馬魚幼魚的肝臟聂沙。

噻氯匹定對成年斑馬魚肝臟病理變化及代謝的影響

對照組成年斑馬魚HE染色顯示肝組織形態(tài)正常，細胞間接觸緊密初嘹，細胞完整飽滿及汉。相比之下，噻氯匹定(4 μg/mL)暴露的成年斑馬魚肝組織形態(tài)受損屯烦，肝細胞不規(guī)則變形坷随，有大量無核細胞房铭，細胞間接觸疏松，大量空泡形成(圖3A)温眉。與斑馬魚幼魚的結果相似缸匪，對暴露于4 μg/mL噻氯匹定的成年斑馬魚肝臟進行PAS染色，與對照組相比类溢，觀察到明顯較輕的染色凌蔬，提示糖原含量顯著降低(圖3B)。此外闯冷，與對照組相比砂心，噻氯匹定暴露的成年斑馬魚肝臟的油紅O染色明顯較深，表明噻氯匹定組肝臟的脂質含量較對照組顯著增加(圖3C)蛇耀。噻氯匹定染毒組GPT辩诞、GOT、G6PDH蒂窒、ICDHC活性及TG躁倒、TC含量均顯著高于對照組(圖3D-F)荞怒。結果表明洒琢，噻氯匹定暴露對成年斑馬魚有肝毒性，嚴重影響其肝臟代謝褐桌。

圖3 噻氯匹定致成年斑馬魚肝臟組織學改變及代謝異常衰抑。(A)暴露于指定濃度噻氯匹定30天后的肝臟HE染色圖像:黃色矩形框表示放大區(qū)域，紅色箭頭表示有核細胞荧嵌。(B)暴露于指定濃度的噻氯匹定30天后的肝臟PAS染色圖像:黃色矩形框表示放大區(qū)域呛踊，藍色箭頭表示糖原蓄積的位置。(C)暴露于指定濃度的噻氯匹定30天后的肝臟油紅O染色圖像:黃色虛線框表示放大區(qū)域啦撮。(D)暴露于指定濃度的噻氯匹定30天后谭网，肝臟GPT和GOT的活性。(E)暴露于指定濃度的噻氯匹定30天后的肝臟G6PDH和ICDHC赃春。(F)暴露于指定濃度的噻氯匹定30天后愉择，肝臟中的TC和TG水平(值代表平均值±標準差)* p < 0.05，**p < 0.01织中，***p < 0.001)锥涕。

噻氯匹定誘導斑馬魚幼魚氧化應激上調

為了研究噻氯匹定對斑馬魚幼魚氧化應激和炎癥的影響，我們進行了ROS染色和巨噬細胞熒光拍攝狭吼，測定了CAT和SOD活性层坠，并定量了TNF-α和TGF-β基因表達。與對照組相比刁笙，在噻氯匹定暴露組的肝臟部位觀察到顯著較高的綠色熒光強度(代表ROS積累)(圖4A)破花。噻氯匹定暴露還降低了CAT和SOD的活性(圖4B-C)谦趣，表明暴露于噻氯匹定的幼蟲的抗氧化能力顯著降低。為了觀察噻氯匹定對巨噬細胞分布的影響旧乞，我們使用Tg (fabp10a: DsRed)和Tg (mfap4: GFP)雜交產生的斑馬魚幼魚蔚润，發(fā)現(xiàn)與對照組(圖 1a)相比，噻氯匹定暴露的斑馬魚幼魚的巨噬細胞分布顯著增加尺栖，且呈劑量依賴性嫡纠。我們還發(fā)現(xiàn)，與對照組相比延赌，噻氯匹定暴露組的炎癥基因(TNF-α)和抗炎基因(TGF-β)的表達顯著上調(圖 1b)和下調(圖 1C)除盏。因此，噻氯匹定引起的肝毒性可能與氧化應激上調和炎癥水平升高有關挫以。

圖4 噻氯匹定誘導斑馬魚幼魚氧化應激上調者蠕。(A)暴露于指定濃度的噻氯匹定72h后，獲得ROS染色激光共聚焦圖像掐松。紅色和綠色熒光分別代表斑馬魚幼魚的肝臟和ROS的積累踱侣。黃色虛線框表示局部擴大區(qū)域。(B)暴露于指定濃度的噻氯匹定72h后的CAT活性大磺。(C)暴露于指定濃度的噻氯匹定72h后的SOD活性(值代表平均值±標準差)*p < 0.05抡句，**p < 0.01，***p < 0.001)杠愧。

噻氯匹定抑制斑馬魚增殖相關基因的表達待榔，從而抑制肝細胞增殖

為探討噻氯匹定對斑馬魚幼魚肝臟增殖的影響，我們進行了PCNA抗體染色流济。我們發(fā)現(xiàn)锐锣，與對照組相比，噻氯匹定暴露組的肝細胞增殖顯著降低(圖5A)绳瘟。我們還發(fā)現(xiàn)雕憔，與對照組相比，噻氯匹定暴露組中增殖相關基因(ccne1, ccdn1, cdk2和cdk6)的表達下調(圖5B-E)糖声。結果表明斤彼，噻氯匹定可能通過抑制增殖相關基因的表達而抑制肝細胞增殖，進而誘導肝毒性姨丈。

圖5 噻氯匹定抑制斑馬魚幼魚肝細胞增殖畅卓。(A)暴露于指定濃度的噻氯匹定72h后的PCNA染色圖像。紅色蟋恬、綠色和藍色熒光分別表示肝臟翁潘、增殖細胞和細胞核。黃色虛線圈代表肝臟歼争。(B-E)暴露于指定濃度的噻氯匹定72h后的增殖相關基因表達水平(值代表平均值±標準差)*P < 0.05拜马，**P < 0.01渗勘，***P < 0.001,ns，無統(tǒng)計學意義)俩莽。

NAC顯著改善噻氯匹定對斑馬魚幼魚肝細胞增殖的抑制和肝毒性

同時用噻氯匹定和NAC孵育斑馬魚幼魚后旺坠，我們觀察到幾個顯著的變化:(1)與噻氯匹定暴露組相比，綠色熒光強度顯著降低扮超，表明ROS在肝臟中積累(圖6A);(2)肝臟形態(tài)學和魚鰾大小明顯恢復(圖6b);(3)體長恢復正常(圖6C);(4) CAT和SOD活性顯著回升(圖6D-E)取刃。此外，與單用噻氯匹定組相比出刷，NAC挽救組肝細胞增殖顯著增加璧疗，增殖相關基因表達顯著上調(圖7A-C)。這些結果表明馁龟，NAC可顯著改善噻氯匹定誘導的肝毒性崩侠，其機制可能與上調氧化應激有關。

圖6 NAC挽救噻氯匹定誘導的斑馬魚幼魚肝毒性坷檩。(A)對照組却音、噻氯匹定組和救援組斑馬魚幼魚的ROS染色圖像。黃色虛線框表示放大區(qū)域矢炼。綠色熒光代表ROS的積累系瓢。(B)對照組、噻氯匹定組和救援組斑馬魚幼魚肝臟的白光和代表性熒光圖像裸删。紅色虛線框表示放大區(qū)域八拱，黃色箭頭表示魚鰾阵赠，紅色箭頭表示卵黃囊涯塔。(C)對照組、噻氯匹定組和救援組斑馬魚幼魚體長統(tǒng)計清蚀。(D-E)對照組匕荸、噻氯匹定組和救援組斑馬魚幼魚CAT和SOD酶活性。NAC枷邪、n -乙酰半胱氨酸榛搔、TIC、噻氯匹定(值代表均數(shù)±標準差)*p < 0.05东揣，**p < 0.01践惑，***p < 0.001)。

圖7 NAC挽救噻氯匹定誘導的斑馬魚幼魚肝臟增殖的減少嘶卧。(A)對照組尔觉、噻氯匹定組和挽救組的PCNA抗體染色圖像，紅色熒光代表肝臟芥吟，顆粒綠色熒光代表增殖細胞侦铜。(B-C)對照組专甩、噻氯匹定組和挽救組中增殖相關基因(ccne1和cdk2)的表達水平。NAC钉稍、n -乙酰半胱氨酸涤躲、TIC、噻氯匹定(值代表均數(shù)±標準差)*p < 0.05贡未，**p < 0.01种樱，***p < 0.001)。

討論

糖尿病是一種以高血糖為常見特征的慢性代謝性疾病俊卤。高血糖常常與許多其他并發(fā)癥同時發(fā)生缸托，導致重大的醫(yī)療挑戰(zhàn)。高血糖可通過上調氧化應激瘾蛋、內皮功能障礙俐镐、炎癥和血小板活化引起高凝狀態(tài)。因此哺哼，抗血小板聚集是預防缺血事件發(fā)生和復發(fā)的重要工具佩抹。噻氯匹定通過抑制血小板p2y12受體抑制血小板聚集。臨床上常用于預防和治療糖尿病血管并發(fā)癥取董，如腦梗死和冠狀動脈疾病棍苹，還可降低血液黏度。雖然噻氯匹定與肝毒性之間的相關性已被明確茵汰，但確切的分子機制仍不清楚枢里。在本研究中，我們以斑馬魚為模式生物蹂午，證明噻氯匹定暴露以劑量依賴的方式引起斑馬魚的發(fā)育遲緩和肝毒性栏豺。體長變短、卵黃囊攝取減慢豆胸、魚鰾變小甚至沒有魚鰾奥洼、肝臟形態(tài)發(fā)生顯著變化以及死亡率增加等證據(jù)支持這一觀察結果。

近年來晚胡，氧化應激被認為是一種廣泛存在的細胞過程灵奖，與許多疾病的發(fā)病機制密切相關。氧化應激的典型特征是源自各種內部和外部損傷源的ROS和活性氮物種(RNS)的積累估盘。我們的研究發(fā)現(xiàn)瓷患，噻氯匹定藥物暴露組斑馬魚肝臟部位ROS水平呈濃度依賴性顯著上調，結果表明噻氯匹定可以上調斑馬魚肝臟部位氧化應激水平遣妥，而氧化應激水平是人體衰老和疾病的重要調節(jié)劑擅编，通過多種生化過程損害脂質、DNA和蛋白質燥透。氧化應激可破壞肝細胞膜沙咏，增加細胞膜通透性辨图，導致細胞內GPT和GOT的釋放，導致GPT和GOT水平升高肢藐。因此故河，GPT和GOT的升高反映了肝臟結構完整性受損的程度。酶活性檢測發(fā)現(xiàn)噻氯匹定染毒后斑馬魚GOT和GPT顯著升高吆豹，HE染色結果提示噻氯匹定染毒后斑馬魚肝組織出現(xiàn)細胞間隙增寬和空泡化鱼的，熒光顯微鏡也顯示斑馬魚肝組織形態(tài)發(fā)生改變。結果表明痘煤，噻氯匹定可以誘導肝損傷凑阶，并且由于肝臟部位表現(xiàn)出顯著升高的氧化應激水平，我們推測噻氯匹定通過上調氧化應激通路誘導肝損傷衷快。在正常情況下宙橱，機體內維持氧化還原平衡，在缺乏抗氧化能力的情況下蘸拔，氧化還原平衡被擾亂师郑，引起氧化應激，并產生高水平的氧调窍、羥基自由基和其他活性物質宝冕。據(jù)報道，ROS具有“雙側”作用;它在細胞級聯(lián)反應中充當?shù)诙攀共⒕S持細胞表型邓萨，同時它也可以誘導細胞衰老和凋亡地梨。低水平的ROS促進細胞信號傳導，但氧化應激產生大量ROS缔恳，導致細胞壞死和凋亡宝剖。此外,據(jù)報道,氧化應激可以影響正常細胞增殖行為。

SOD和CAT作為體內重要的抗氧化劑褐耳，在清除肝臟代謝物質時產生的大量ROS方面發(fā)揮著重要作用诈闺。我們還發(fā)現(xiàn)噻氯匹定暴露后SOD和CAT水平降低渴庆。噻氯匹定暴露還導致氧化失衡铃芦，抗氧化防御系統(tǒng)受損，大量ROS積累襟雷，炎癥水平上調刃滓，氧化應激導致細胞膜脂質過氧化，減弱細胞的抗氧化能力耸弄，破壞肝細胞膜的完整性咧虎。ROS的過度積累會導致肝功能障礙和肝細胞凋亡。

肝臟是機體重要的代謝器官计呈。為了進一步評價噻氯匹定對斑馬魚肝功能的影響砰诵，我們檢測了TG和TC水平以及G6PDH和ICDHC酶的活性征唬，結果表明噻氯匹定暴露后，斑馬魚的TC茁彭、TG以及G6PDH和ICDHC酶的活性顯著升高总寒。G6PDH具有高度特異性，在磷酸戊糖途徑中NADPH的生成中發(fā)揮著非常重要的作用理肺。ICDHC在肝臟中分布豐富摄闸，主要由肝臟釋放，可以反映肝壞死的程度妹萨。G6PDH和ICDHC是肝臟糖代謝的關鍵酶年枕，油紅O染色和糖原染色也顯示噻氯匹定染毒后肝臟脂質和糖原含量顯著異常。這些結果表明乎完，噻氯匹定暴露后斑馬魚肝臟受到損傷熏兄，脂質和糖代謝紊亂。此外树姨，我們還觀察到噻氯匹定暴露后霍弹，斑馬魚幼魚的卵黃囊吸收顯著延遲，魚鰾發(fā)育延遲和體長減少娃弓，表明噻氯匹定也會誘導斑馬魚的發(fā)育毒性典格。

細胞周期是一個嚴格調控的過程，具有顯著的復雜性台丛。細胞生長和分裂是由細胞周期蛋白(CCN)和細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)復合物確定的精確序列調控的耍缴；其中，ccne1挽霉、ccnd1防嗡、cdk2和cdk6參與細胞周期和復制。在本研究的qPCR分析中侠坎，ccne1, ccnd1, cdk2和cdk6在噻氯匹定暴露組中顯著下調蚁趁，表明噻氯匹定可以影響斑馬魚幼魚的細胞增殖。我們還通過PCNA染色證明了這一點实胸，在噻氯匹定暴露后他嫡，斑馬魚幼魚的肝細胞增殖顯著降低。

NAC是一種抗氧化劑庐完，為體內合成谷胱甘肽(GSH)提供必要的原料钢属，GSH是體內一種重要的抗氧化劑，在正常的細胞過程中發(fā)揮重要作用门躯。許多研究表明淆党，抗氧化應激對肝臟具有保護作用。眾所周知，谷胱甘肽是一種直接抗氧化劑和許多抗氧化酶的底物染乌，當對乙酰氨基酚毒性導致藥物解毒過程耗盡肝臟谷胱甘肽池時山孔，NAC可以恢復谷胱甘肽池。NAC作為谷胱甘肽前體荷憋，對超氧化物和過氧化物的清除作用較小饱须，只是一種間接抗氧化劑。然而台谊，NAC含有親核游離巰基蓉媳，可以對抗氧化自由基的許多親電子基團，發(fā)揮直接抗氧化作用锅铅。此外酪呻，NAC還具有一定的抗炎特性，可以破壞呼吸道病原體形成的生物膜盐须。在本研究中玩荠，為了進一步驗證斑馬魚胚胎的肝毒性和發(fā)育毒性與氧化應激的上調有關，我們用NAC處理斑馬魚幼魚贼邓，發(fā)現(xiàn)NAC降低了噻氯匹定誘導的氧化應激水平阶冈，表明NAC具有顯著的抗氧化作用，后來我們發(fā)現(xiàn)塑径，NAC在一定程度上挽救了噻氯匹定暴露導致的發(fā)育延遲和肝毒性女坑。它通過下調噻氯匹定誘導的CAT和SOD活性上調，上調cne1和cdk2的表達统舀，從而促進肝細胞增殖匆骗。然后我們進行了PCNA染色，發(fā)現(xiàn)NAC顯著恢復了噻氯匹定誘導的斑馬魚幼魚肝細胞增殖的減少誉简。因此碉就，噻氯匹定誘導的斑馬魚胚胎發(fā)育遲緩和肝毒性與氧化應激的上調密切相關。

結論

噻氯匹定可誘導斑馬魚胚胎發(fā)育延遲和肝毒性闷串，其機制可能與上調氧化應激瓮钥，導致ROS蓄積，抑制肝細胞增殖有關烹吵。本研究鼓勵進一步了解噻氯匹定對人體的潛在危害碉熄，為其臨床安全使用提供充分的理論依據(jù)。

基金：這項研究得到了國家自然科學基金(81160073),江西省衛(wèi)生部門基金(202210870),教育部的科學和技術基礎的江西,中國(GJJ2201434),流行疾病的臨床醫(yī)學研究中心(地中海貧血)江西省(20223 bcg74003),國家重點研發(fā)計劃(2018YFA0801000)年叮，國家自然科學基金(32170853)具被，江西省自然科學基金(20212ACB205007)，江西省教育廳科技基金(GJJ201002)的支持只损。

原文：Xu R, Xu P, Wei H, et al. Ticlopidine induces embryonic development toxicity and hepatotoxicity in zebrafish by upregulating the oxidative stress signaling pathway[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2023, 262: 115283.

原文地址：https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2023.115283