雜志：Journal of Bone and Mineral Research

影響因子：6.2（2022-2023）

年份：2018

通訊作者：Bj?rn Busse

通訊作者單位：Department of Osteology and Biomechanics, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Lottestr. 55A, 22529 Hamburg, Germany.

摘要

絕大多數(shù)成骨不全(OI)患者的過(guò)度骨骼變形和脆性骨折是骨質(zhì)量大幅下降的結(jié)果庇麦。由于骨的力學(xué)能力依賴于小長(zhǎng)度尺度的組織特征计技，因此評(píng)估骨成骨不全在骨的微納米尺度上的表現(xiàn)是至關(guān)重要的。在這種背景下山橄，吉娃娃(Chi/+)斑馬魚在I型膠原蛋白α1鏈中攜帶雜合甘氨酸取代垮媒，最近被提出作為經(jīng)典顯性成骨不全的合適動(dòng)物模型，表現(xiàn)出骨骼畸形航棱，礦化模式改變睡雇，體型較小。

本研究使用顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描(micro-CT)饮醇、組織形態(tài)學(xué)測(cè)量它抱、定量背散射電子成像、傅里葉變換紅外光譜朴艰、納米壓痕和x射線顯微鏡評(píng)估了Chi/+在多個(gè)長(zhǎng)度尺度上的骨質(zhì)量特性观蓄。在骨骼水平上，Chi/+顯示出較小的身體尺寸祠墅、畸形和肋骨中的骨折愈傷組織蜘腌。全骨水平形態(tài)學(xué)變化表明，Chi/+椎體尺寸較小饵隙，厚度較小，形狀扭曲沮脖。在組織水平上金矛，與野生型斑馬魚相比，Chi/+表現(xiàn)出更高的礦化程度勺届、更低的膠原成熟度驶俊、更低的礦物質(zhì)成熟度、改變的成骨細(xì)胞形態(tài)和更低的骨細(xì)胞腔隙密度免姿。Chi/+骨的細(xì)胞饼酿、組成和結(jié)構(gòu)特性的改變可以解釋局部力學(xué)特性受損，從而促進(jìn)Chi/+整體骨脆性的增加胚膊。因此故俐，Chi/+骨質(zhì)量的定量評(píng)估進(jìn)一步驗(yàn)證了該突變體作為反映與人類經(jīng)典顯性成骨不全相關(guān)的骨特征的重要模型。

關(guān)鍵詞：骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)紊婉；遺傳動(dòng)物模型药版；骨基質(zhì)；成骨不全癥喻犁。

介紹

成骨不全癥(Osteogenesis imperfecta, OI)是一種骨骼和結(jié)締組織的遺傳性疾病槽片，其發(fā)病率約為萬(wàn)分之一何缓，對(duì)骨骼生長(zhǎng)和骨礦化具有多重影響』顾ǎ患病骨的機(jī)械完整性經(jīng)常嚴(yán)重受損碌廓，導(dǎo)致骨脆弱性增加。因此剩盒，患者遭受過(guò)度的骨骼變形和多發(fā)脆性骨折谷婆。在絕大多數(shù)成骨不全患者中，骨折抵抗能力受損是由于負(fù)責(zé)合成I型膠原蛋白(骨的有機(jī)框架)的基因發(fā)生顯性突變勃刨。這導(dǎo)致了有機(jī)基質(zhì)結(jié)構(gòu)的減少波材，伴隨著礦化的延遲，從而延緩了骨骼的生長(zhǎng)和成熟身隐。

疾病的嚴(yán)重程度可根據(jù)成骨不全的類型而有所不同廷区。在影響I型膠原蛋白基因的顯性突變中，I型成骨不全是最輕微和最常見的形式贾铝，其表型包括兒童開始走路時(shí)發(fā)生的自發(fā)性骨折隙轻、輕微畸形、幾乎正常的身材和輕度骨脆性垢揩。最嚴(yán)重和致命的形式是II型玖绿，胎兒經(jīng)歷子宮內(nèi)骨折和出生前死亡。中間類型是III型叁巨，嚴(yán)重表型包括骨折斑匪、脊柱側(cè)凸、嚴(yán)重變形和身材非常小锋勺，以及IV型蚀瘸，中度表型包括骨折和身材小。

由于這些類型的成骨不全通常在骨骼和全骨水平表現(xiàn)為低骨量并骨折或畸形庶橱，因此最初的診斷方法通常采用x線吸收儀和x線攝影贮勃。根據(jù)患者的骨活檢，在骨的微觀和納米尺度上進(jìn)一步在組織水平上表征成骨不全苏章，觀察到超微結(jié)構(gòu)的改變與成骨不全的臨床嚴(yán)重程度密切相關(guān)寂嘉。對(duì)于I型至IV型成骨不全的組織，有報(bào)道稱其在亞微米尺度上的力學(xué)行為受損枫绅，存在不規(guī)則的高礦化區(qū)域泉孩，以及納米級(jí)骨成分(膠原原纖維和羥基磷灰石晶體)結(jié)構(gòu)的變化。由于骨在小長(zhǎng)度尺度上的材料特性決定了骨在全骨和骨骼水平上的力學(xué)能力并淋，因此評(píng)估成骨不全以何種方式損害骨組織質(zhì)量至關(guān)重要棵譬。然而，目前的治療方案主要是通過(guò)增加整體骨量來(lái)增加骨強(qiáng)度预伺。因此订咸，包括肌肉骨骼運(yùn)動(dòng)在內(nèi)的常規(guī)措施經(jīng)常與廣泛基于抗吸收雙磷酸鹽治療的藥理學(xué)方法相結(jié)合曼尊。然而，考慮到成骨不全癥患者的年齡范圍特別大脏嚷，臨床變異性和遺傳多樣性也很大骆撇，這種治療方法的成功與否往往尚無(wú)定論。

因此父叙，為了更好地了解該疾病對(duì)所有骨骼長(zhǎng)度尺度的影響神郊，并加快尋找脆性骨病的強(qiáng)化治療方案，已經(jīng)建立了大量的動(dòng)物模型并進(jìn)行了表征趾唱。除了研究得很好的哺乳動(dòng)物模型涌乳，包括老鼠和狗，新的小型動(dòng)物模型正在出現(xiàn)甜癞。斑馬魚(Danio rerio)因其發(fā)育時(shí)間短夕晓、與人類遺傳相似、體型小悠咱、養(yǎng)殖成本低等特點(diǎn)蒸辆，已成為生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域有價(jià)值的動(dòng)物模型。在OI和類似的遺傳性骨骼疾病的背景下析既，迄今為止很少有斑馬魚突變被產(chǎn)生并表征骨骼表型躬贡。Fisher等人首先描述了吉娃娃(Chi/+)斑馬魚的顯性G574D突變，該突變影響編碼I型膠原α1鏈的col1a1a基因眼坏，因此與嚴(yán)重的顯性人類OI具有遺傳相似性拂玻。在α1(I)中攜帶甘氨酸取代，這些斑馬魚在骨骼生長(zhǎng)和成熟方面存在缺陷和遲緩宰译。最近纺讲，Gioia等人對(duì)Chi/+的骨骼表型進(jìn)行了更全面的描述，他們通過(guò)對(duì)固定和體內(nèi)樣本進(jìn)行特異性骨染色囤屹，證實(shí)了嚴(yán)重的骨骼畸形和延遲礦化，從而支持Chi/+突變體作為經(jīng)典顯性成骨不全的有希望模型的適用性逢渔。

為了擴(kuò)大Chi/+作為人類OI模型的有效性肋坚，我們需要與健康對(duì)照相比，關(guān)于病變骨骼的組織和生物力學(xué)特征的進(jìn)一步數(shù)據(jù)肃廓。本研究的目的是提供Chi/+斑馬魚在骨骼形態(tài)智厌、脆性、結(jié)構(gòu)和成分以及細(xì)胞和機(jī)械特性方面的變化的定量數(shù)據(jù)盲赊。采用多模態(tài)技術(shù)陣列從宏觀到納米尺度比較Chi/+和野生型斑馬魚的骨骼铣鹏，以檢驗(yàn)以下假設(shè):Chi/+斑馬魚的骨骼材料特性的損害是導(dǎo)致骨骼脆性增加的原因，如對(duì)人類OI的描述哀蘑。

材料和方法

吉娃娃魚(Chi/+诚卸， col1a1a^dc124/+)和野生型AB (WT)斑馬魚在意大利帕維亞大學(xué)放射生物學(xué)研究中心進(jìn)行室內(nèi)飼養(yǎng)葵第。突變體Chi/+在col1a1a中攜帶G2207A突變，導(dǎo)致I型膠原α1鏈中的G574D雜合替代合溺。Gioia等人詳細(xì)描述了斑馬魚的飼養(yǎng)卒密、繁殖和飼養(yǎng)條件。幼蟲體內(nèi)骨形成特征已被量化;對(duì)成年斑馬魚進(jìn)行了離體骨組織表征棠赛，該斑馬魚在10月齡時(shí)被處死哮奇，并在-80°C冷凍保存。

幼蟲動(dòng)態(tài)骨組織形態(tài)測(cè)定

在幼蟲期進(jìn)行動(dòng)態(tài)骨組織形態(tài)學(xué)測(cè)定睛约，以量化突變對(duì)椎組織骨形成率(BFR)的影響鼎俘。在受精后8天(dpf)和10天(dpf)，使用0.2%鈣黃蛋白作為重要染料對(duì)WT和Chi/+斑馬魚的鈣化骨進(jìn)行染色(每組n=6)辩涝。簡(jiǎn)單地說(shuō)贸伐，將幼蟲在溶液染料中轉(zhuǎn)移10分鐘，并用胚胎水洗滌膀值。顯微鏡成像根據(jù)既定方法確定椎體中心2棍丐、3和4的面積。通過(guò)測(cè)量每個(gè)椎體在10 dpf和8 dpf時(shí)量化的椎體面積之間的比率來(lái)確定BFR沧踏。

整體骨架染色

為了表征成人骨骼骨折歌逢，按照Gioia等人的描述，對(duì)WT (n?24)和Chi/+ (n?29)斑馬魚的軟骨和骨進(jìn)行了阿利新藍(lán)和茜素紅染色翘狱。簡(jiǎn)單地說(shuō)秘案，將魚固定在4%磷酸鹽緩沖的多聚甲醛溶液中，去鱗和內(nèi)臟潦匈，用丙酮脫脂阱高，并用0.02%阿利新藍(lán)8GX染色(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)。去除軟組織后茬缩，用0.01%茜素紅S (Sigma Aldrich)染色赤惊。圖像采集使用徠卡M165 FC顯微鏡(徠卡，Wetzlar凰锡，德國(guó))連接到徠卡DFC425 C數(shù)碼相機(jī)未舟。存在于肋骨中的愈傷組織由三名獨(dú)立的觀察者進(jìn)行量化，對(duì)魚的基因型不知情掂为。

微型計(jì)算機(jī)斷層掃描(Micro-CT)

使用5μm空間分辨率的微型計(jì)算機(jī)斷層掃描(micro-CT)評(píng)估骨骼形態(tài)和骨微結(jié)構(gòu)(Skyscan 1272, Bruker, Kontich, Belgium)裕膀。每組6條魚在3.5%福爾馬林中固定24小時(shí)，掃描時(shí)放置在潮濕的箱中勇哗。在55kv和166μA下進(jìn)行全身掃描昼扛，不使用x射線濾光片。在NRecon (Bruker, Kontich, Belgium)的重建過(guò)程中欲诺，所有樣品的環(huán)形偽影和光束硬化校正保持不變抄谐。在對(duì)所有樣本應(yīng)用固定閾值后渺鹦，使用CTAn (Bruker, Kontich, Belgium)進(jìn)行3D評(píng)估。在每只魚的第一和第二前椎骨上量化Chi/+和WT的骨形態(tài)變化斯稳。神經(jīng)弓和血管弓被排除在分析之外海铆。確定的參數(shù)為椎體長(zhǎng)度(VL, μm)、椎體厚度(V.Th, μm)挣惰、偏心率(Ecc, 0-1)和骨體積(BV, mm3)卧斟，定義為沒有內(nèi)腔的椎體。

傅里葉變換紅外光譜學(xué)

利用傅里葉紅外光譜分析了礦物相和膠原相的組成憎茂。每組6只斑馬魚在3.5%福爾馬林中固定24小時(shí)珍语，隨后在增加濃度的乙醇中逐步脫水，然后包埋在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)中竖幔。樣品塊被拋光共面用于組織成分分析板乙，其中在外側(cè)平面切割的前椎體終板被選擇為感興趣的區(qū)域。使用FTIR光譜(Spotlight 400連接到Frontier 400, perkins - elmer, Waltham, MA, USA)以衰減全反射(ATR)模式掃描Chi/+和WT椎骨拳氢。獲得尺寸為65μm ×130μm的地圖募逞，空間分辨率(像素大小)為1.56μm，每像素掃描8次馋评，波數(shù)范圍為4000 ~ 570 cm-1放接。使用自定義編寫的Matlab腳本(R2016b, MathWorks, Natick, MA,USA)進(jìn)行后處理和光譜分析，包括PMMA信號(hào)的減法留特，吸光度信號(hào)的平滑和線性基線的去除纠脾。根據(jù)原始光譜的二階導(dǎo)數(shù)識(shí)別出感興趣的峰。磷酸鹽峰位于1154 ~ 900 cm-1之間蜕青，碳酸鹽峰位于870 cm-1中心苟蹈，酰胺I峰位于1710 ~ 1600 cm-1中心。通過(guò)劃分各自的峰面積來(lái)確定骨組織參數(shù)右核，包括膠原成熟度(酰胺I亞峰1660/1690 cm-1)慧脱、碳酸鹽-磷酸鹽比(碳酸鹽/磷酸鹽面積)、結(jié)晶度(磷酸鹽亞峰面積1028/1018 cm-1)和礦物-基質(zhì)比(磷酸鹽/酰胺I面積)贺喝。

定量背散射電子成像(qBEI)

為了分析Chi/+和WT斑馬魚的前椎椎骨的骨密度分布菱鸥，我們對(duì)相同的樣品和相同的感興趣區(qū)域進(jìn)行了電子成像，就像之前用FTIR光譜分析的那樣搜变。在成像之前，樣品被碳涂層针炉。掃描電鏡觀察每組6個(gè)標(biāo)本(LEO 435 VP;LEO Electron Microscopy Ltd, Cambridge, UK)在20kv和680 pA下工作挠他，恒定工作距離為20mm(瘋牛病探測(cè)器，202型;K.E.發(fā)展有限公司篡帕，劍橋殖侵，英國(guó))贸呢。根據(jù)先前描述的方案確定灰度值圖像上的骨礦物質(zhì)密度分布。使用碳鋁標(biāo)準(zhǔn)對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)拢军，便于骨礦物質(zhì)作為鈣重量百分比的定量楞陷。測(cè)定的參數(shù)包括平均鈣含量(caamean, wt%)、骨礦物質(zhì)分布的異質(zhì)性(CaWidth, △wt%)和高度礦化骨的面積(CaHigh茉唉，%B.Ar.)固蛾。

納米壓痕

用納米壓痕分析了Chi/+和WT中椎組織的納米力學(xué)性能。每組4個(gè)共面PMMA包埋的樣品用3μm的金剛石懸浮液拋光度陆，然后用1μm的金剛石懸浮液拋光艾凯，最后用0.05 μm的氧化鋁懸浮液拋光，以降低表面粗糙度懂傀。為了去除表面碎屑趾诗，樣品在去離子水中進(jìn)行超聲清洗。使用配備Berkovich鉆石尖端的納米壓痕器(Nano壓痕器G200, Keysight Technologies, Santa Rosa, CA, USA)對(duì)每個(gè)樣品的兩個(gè)椎骨進(jìn)行8個(gè)壓痕蹬蚁。在深度傳感連續(xù)剛度模式下進(jìn)行壓痕恃泪，最終深度為500 nm。在每次測(cè)量之前和之后對(duì)熔融石英進(jìn)行校準(zhǔn)犀斋。凹痕的位置至少間隔20μm贝乎。在泊松比為0.3的情況下，使用內(nèi)部軟件(NanoSuite, Keysight Technologies, Santa Rosa, CA, USA)闪水，根據(jù)olive - pharr方法獲得彈性模量(E)和硬度(H)糕非。此外，計(jì)算了彈性模量與硬度的比值球榆，作為斷裂韌性的替代指標(biāo)朽肥。

靜態(tài)骨組織形態(tài)測(cè)定

通過(guò)靜態(tài)骨組織形態(tài)測(cè)量法評(píng)估成人WT和Chi/+的細(xì)胞和組織特征。如上所述持钉，將魚包埋在PMMA中(n=4/組)衡招。用切片機(jī)沿脊柱制作4毫米厚的矢狀切片，隨后用甲苯胺藍(lán)染色每强。使用Ostemeasure組織形態(tài)測(cè)量系統(tǒng)(OsteoMetrics, Atlanta, GA, USA)測(cè)定骨細(xì)胞和組織指數(shù)始腾。提取以下參數(shù):每骨周成骨細(xì)胞數(shù)(N.Ob/B;Pm, 1/mm)，每骨體積的骨表面積(BS/BV, mm2/mm3)空执，每骨體積的類骨體積(OV/BV浪箭，%)，以及每骨面積的骨細(xì)胞腔隙數(shù)量(N.Ot/B.Ar,1/mm2)辨绊。在20倍放大鏡下對(duì)每條魚的兩個(gè)椎骨進(jìn)行評(píng)估奶栖。

三維x射線顯微鏡

使用x射線顯微鏡(3D XRM, ZEISS Xradia 520 Versa, Carl ZEISS x射線顯微鏡，Pleasanton, CA, USA)進(jìn)一步觀察Chi/+和WT椎組織中的骨細(xì)胞腔隙網(wǎng)絡(luò)。從新鮮冷凍動(dòng)物上解剖椎體宣鄙，仔細(xì)去除周圍軟組織袍镀，將樣品脫水并以0.75μm的空間分辨率掃描。重建后冻晤，使用3貶值軟件對(duì)椎體進(jìn)行分析(Visual SI Advanced, Object Research Systems Inc, Montreal, Canada;ImageJ2 v1.5, https://imagej.nih.gov/ij)苇羡。

統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS (Version 24, IBM, Armonk, NY, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布檢驗(yàn)采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)鼻弧，方差齊性檢驗(yàn)采用Levene檢驗(yàn)设江。組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，p < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義温数。結(jié)果以平均值±SD表示绣硝。

幼蟲成骨率

為了量化先前描述的Chi/+中骨形成的延遲，在8和10 dpf時(shí)對(duì)突變體和WT幼蟲進(jìn)行鈣黃蛋白生命染色(圖1A)撑刺。在評(píng)估了V2鹉胖、V3和V4椎體中心礦化面積的比例(10 dpf vs 8 dpf)后，與WT相比够傍，Chi/+中三個(gè)椎體的骨形成明顯較低(圖1B)甫菠。在V2和V3中，Chi/+的比值呈較小的趨勢(shì)冕屯，在VB4中達(dá)到顯著性(0.9±0.1比1.1±0.1,p< 0.05)寂诱。

成人骨折特征

對(duì)魚進(jìn)行茜素紅和阿利新藍(lán)全載染色，可以量化成年Chi/+和WT斑馬魚肋骨中愈傷組織的數(shù)量(圖1C-E)安聘。骨折愈傷組織是根據(jù)其圓形/橢圓形形態(tài)和深藍(lán)色染色來(lái)識(shí)別的痰洒，這使得它們與染色過(guò)程中由制備人工制品引起的骨折區(qū)分開來(lái)，后者的特征是骨骼清晰切割(圖1D)浴韭。盡管59%的突變體表現(xiàn)為骨折愈傷組織(25%為單個(gè)愈傷組織丘喻，34%為兩個(gè)或更多)，但8%的WT魚表現(xiàn)為單個(gè)愈傷組織(圖1E)念颈。值得注意的是泉粉，在染色過(guò)程中處理的骨折數(shù)量Chi/+(96%為多處骨折)比WT(38%單處骨折)高得多。

圖1 野生型(WT)斑馬魚和Chi/+斑馬魚在骨骼水平的表型差異榴芳。與野生型相比嗡靡，Chi/+在幼蟲期延遲了骨骼生長(zhǎng)(A,B)，而在成年Chi/+中增加了骨脆性(C,D)窟感。(A)在WT和用鈣黃綠素標(biāo)記的Chi/+幼蟲的三個(gè)椎體(V2, V3, V4)上評(píng)估骨形成讨彼。以受精后10天(dpf)的椎體面積除以受精后8天(dpf)的椎體面積來(lái)確定椎體面積比，作為骨形成率的衡量指標(biāo)柿祈。(B)與WT相比哈误，Chi/+斑馬魚的椎體面積比率顯著降低酣难。(C)成年Chi/+斑馬魚用阿利新藍(lán)和茜素紅進(jìn)行了整塊染色。(D)肋骨骨痂(紅色箭頭)和染色過(guò)程中處理引起的骨折(黑色箭頭)的放大黑滴。(E) WT和Chi/+魚的骨折愈傷組織百分比。59%的Chi/+魚和8%的WT魚肋骨處有骨折痂紧索。

骨骼形態(tài)學(xué)和全骨結(jié)構(gòu)

Chi/+和WT斑馬魚的顯微ct三維重建顯示袁辈，兩組之間在宏觀骨骼形態(tài)和礦化方面存在實(shí)質(zhì)性差異(圖2A, B)。Chi/+斑馬魚的體型與WT相比顯著減小珠漂，標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)度為15.9±0.5 mm晚缩，而WT為22.5±1.8 mm (p< 0.001)。隨著骨折愈傷組織和肋骨的變形媳危，Chi/+斑馬魚的骨骼器官呈現(xiàn)非均勻礦化荞彼，這是x射線吸收的差異所表明的。在全骨水平上待笑，特別是在Chi/+斑馬魚的脊柱沿線鸣皂，觀察到高礦化區(qū)域與低礦化區(qū)域直接相鄰:尾前和尾側(cè)區(qū)域的高礦化和融合椎骨位于兩者之間的低礦化脊柱區(qū)域旁邊。

與野生型斑馬魚相比暮蹂，Chi/+斑馬魚的椎體顯著較小寞缝，椎體長(zhǎng)度顯著較低，分別為288±44μm和488±52 μm, p < 0.001(圖2C);椎體厚度顯著較低仰泻，分別為13.5±1.0 μm和17.2±0.8μm, p < 0.001(圖2D)荆陆。值得注意的是，Chi/+的前椎體經(jīng)常呈現(xiàn)礦化核心(圖2B集侯，右)被啼，這被排除在形態(tài)計(jì)量學(xué)評(píng)估之外。盡管兩組椎體的偏心率(圓度)相似(圖2E)棠枉， Chi/+斑馬魚的BV顯著降低浓体，為0.004±0.001 mm3，而WT對(duì)照組為0.008±0.001 mm3, p < 0.001(圖2F)术健。

圖2 通過(guò)微型計(jì)算機(jī)斷層掃描(micro-CT)觀察Chi/+和野生型(WT)斑馬魚椎骨的骨骼形態(tài)和結(jié)構(gòu)汹碱。(A)成年野生斑馬魚的典型全身掃描(左)和典型雙錐幾何結(jié)構(gòu)的孤立前椎體(中)。形態(tài)測(cè)量參數(shù)顯示在椎體的縱向切割(右)荞估。(B) Chi/+突變體的代表性全身掃描(左)顯示顱骨和脊柱內(nèi)的不均一礦化咳促，肋骨和鰭的畸形，以及融合或塌陷的椎骨勘伺。Chi/+突變體的椎體顯示出異常的幾何形狀(中心)跪腹，其核心有礦化硬組織的積累(右)。前段椎體的形態(tài)測(cè)量分析顯示(C) Chi/+中椎體長(zhǎng)度(VL)顯著減小飞醉，(D)椎體厚度(V.Th)顯著減小冲茸，(E)偏心度相似屯阀，(F)骨體積(BV)減小。

組織成分和成熟度

通過(guò)FTIR光譜分析Chi/+和WT斑馬魚椎骨的骨組織成分轴术，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)膠原蛋白和礦物質(zhì)相關(guān)參數(shù)存在顯著差異(見圖3A-D)难衰。Chi/+組的膠原成熟度比明顯低于toWT組，分別為10.1±5.8和24.2±5.7,p < 0.001 3(圖3A)逗栽。Chi/+斑馬魚的碳酸鹽與磷酸鹽比率顯著高于WT盖袭，分別為0.092±0.002和0.089±0.002, p < 0.01(圖3B)，參數(shù)結(jié)晶度(衡量晶體成熟度和大小)顯著低于WT對(duì)照組彼宠，分別為11.5±1.6和20.1±6.3鳄虱，p=0.005(圖3C)。在Chi/+中凭峡，礦物與基質(zhì)的比值略高(圖3D)拙已。 

圖3 利用傅里葉變換紅外光譜評(píng)估野生型(WT)和Chi/+斑馬魚的前椎體組織成分。感興趣的區(qū)域?qū)?yīng)于兩個(gè)椎體之間的椎終板區(qū)域摧冀。(A)Chi/+突變體中膠原成熟度顯著降低倍踪。(B)在Chi/+中，碳酸鹽與磷酸鹽的比率(晶格中碳酸鹽取代的量度)明顯更高索昂。(C)結(jié)晶度惭适，衡量礦物晶體大小，晶格純度和晶體年齡楼镐，在Chi/+突變體中顯著降低癞志。(D)與WT相比，Chi/+的礦物與基質(zhì)比率呈現(xiàn)出更高的趨勢(shì)(p = 0.196)框产。插圖顯示了整個(gè)椎骨的代表性光譜圖凄杯。請(qǐng)注意，與Chi/+中改變的結(jié)構(gòu)相比秉宿，WT中典型的雙錐形狀戒突，包括Chi/+中的礦化核心，與WT和Chi/+中的皮質(zhì)殼(紅色像素)相比描睦，其礦物與基質(zhì)的比率較高(黃色像素)膊存。

骨密度分布

定量背散射電鏡獲得的骨礦物質(zhì)密度分布顯示，Chi/+和WT對(duì)照組的礦化模式存在明顯差異(圖4A-E)忱叭。如圖4B所示隔崎，鈣在Chi/+中的分布向高濃度轉(zhuǎn)移。Chi/+的平均鈣重量百分比(caman)明顯高于WT韵丑，分別為27.8±0.8 WT %和26.7±0.9 WT %爵卒， p = 0.039(圖4C)诚隙。在組織水平上巡语，各組間礦化的異質(zhì)性(CaWidth)相似，如圖4D所示诗祸。Chi/+和WT高鈣區(qū)(CaHigh)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(12.1%±8.1% B.Ar.和5.0±2.9% B.Ar.)(圖4E)疼阔。

圖4 通過(guò)定量背散射電子顯微鏡評(píng)估野生型(WT)和Chi/+斑馬魚的骨密度分布沟涨。(A)兩個(gè)相鄰椎體的終板區(qū)域附近的骨皮質(zhì)在Chi/+和WT之間的礦化程度有顯著差異伊脓。在Chi/+椎體的中心平酿，經(jīng)常出現(xiàn)不均勻的礦化核心(插圖，箭頭)受葛。(B)椎體終板區(qū)域顯示摆霉，與野生型相比，Chi/+斑馬魚的礦物質(zhì)含量更高奔坟。Chi/+斑馬魚的平均骨密度分布明顯向更高的值偏移。(C)與WT相比搭盾，Chi/+中的平均鈣含量(CaMean)顯著升高咳秉。(D)與WT相比，Chi/+中的礦化異質(zhì)性(CaWidth)沒有變化鸯隅，并且(E) Chi/+中含有高度礦化骨的區(qū)域(CaHigh)顯示出向高度礦化骨區(qū)域的趨勢(shì)(p = 0.092)澜建。

局部力學(xué)性能

納米壓痕顯示了Chi/+和WT斑馬魚椎骨組織的不同力學(xué)特性(圖5A-D)。結(jié)果顯示蝌以，與WT斑馬魚椎骨相比炕舵，Chi/+的彈性模量明顯較低，分別為21.2±0.8 GPa和24.7±1.8 GPa, p=0.02(圖5B)跟畅。兩組之間的硬度無(wú)顯著差異咽筋，分別為0.96±0.03 GPa和0.94±0.08 GPa(圖5C)，而Chi/+的彈性模量與硬度之比明顯低于WT徊件，分別為22.9±1.1和26.3±0.3,p=0.002(圖5D)奸攻。

圖5 野生型(WT)和Chi/+斑馬魚的局部力學(xué)特性。(A)電鏡圖像顯示虱痕，在椎體終板附近礦化皮質(zhì)骨中存在納米壓痕睹耐。插頁(yè)顯示縮進(jìn)的印記(箭頭)。(B)椎體的納米壓痕顯示了組織局部力學(xué)特性的差異部翘。彈性模量(E)硝训，衡量材料的剛度，在Chi/+中顯著降低新思。(C)組織硬度(H)在Chi/+和WT之間沒有差異窖梁。(D)彈性模量與硬度之比(斷裂韌性的替代指標(biāo))在Chi/+中明顯較低，表明骨折風(fēng)險(xiǎn)較高夹囚。

骨形成和骨細(xì)胞特征

感興趣的組織學(xué)區(qū)域的概述見圖6A窄绒。在Chi/+和WT的甲苯胺藍(lán)染色切片上進(jìn)行靜態(tài)骨組織形態(tài)測(cè)定，可以測(cè)定骨細(xì)胞和組織指數(shù)(圖6B-F)崔兴。如圖6B所示彰导，組織學(xué)切片支持Chi/+中存在結(jié)構(gòu)差異和較小的椎體大小蛔翅。在細(xì)胞指數(shù)方面，Chi/+突變體在矢狀切片(箭頭)表現(xiàn)出較少的骨細(xì)胞數(shù)量位谋。關(guān)于立方體的形狀山析。Chi/+與WT相比，每骨周成骨細(xì)胞數(shù)量(N.Ob/B.Pmr)有更高的趨勢(shì)掏父，分別為10.3±2.3細(xì)胞/mm和7.6±0.8細(xì)胞/mm, p=0.069(圖6C)笋轨。Chi/+的骨表面積/骨體積(BS/BV)高于WT，分別為103.4±12.0 mm2/mm3和82.5±9.7 mm2/mm3, p = 0.057(圖6D)赊淑。與WT相比爵政，Chi/+中發(fā)現(xiàn)了類骨體積/骨體積(OV/BV)反映的類骨積累趨勢(shì)(0.49±0.23%比0.24±0.06%，p =0.111)(圖6E)陶缺。Chi/+組的骨細(xì)胞數(shù)量(N.Ot/B.Ar)明顯低于WT組钾挟，分別為496±151細(xì)胞/mm2和883±242細(xì)胞/mm2, p = 0.034(圖6F)。

椎體的三維形狀和骨細(xì)胞腔隙網(wǎng)絡(luò)

使用x射線顯微鏡評(píng)估Chi/+和WT椎體中的骨細(xì)胞腔隙網(wǎng)絡(luò)饱岸，并允許可視化雙錐狀椎體中的骨細(xì)胞腔隙掺出。如圖6G所示，兩組骨細(xì)胞在椎終板附近呈同心分布苫费，在椎體狹窄的椎體中呈軸向分布汤锨。腔隙孔的目視檢查在兩組之間有明顯的差異。與WT相比百框，Chi/+中骨細(xì)胞腔隙密度降低闲礼。與Chi/+相比，WT中存在更多體積約為500 μm3的增大腔隙(紅色)铐维。

圖6 (A)野生型斑馬魚脊椎解剖概述位仁。上圖:示意圖顯示相鄰的椎體，包括典型的雙錐狀礦化骨(深灰色)方椎，椎體內(nèi)空泡狀脊索組織(淺灰色)聂抢，以及包括椎間韌帶(IVL)在內(nèi)的椎間生長(zhǎng)區(qū)域(圈)。圖中:von kossa染色切片的組織學(xué)概述:礦化骨(黑色)棠众，空泡脊索組織(橙色)琳疏，包括骨樣縫的椎間盤區(qū)域(紅粉色)。下圖:甲苯胺藍(lán)染色切片的組織學(xué)概述圖像顯示礦化骨(淺紫藍(lán)色)闸拿，不同染色強(qiáng)度的空泡脊索組織空盼，以及包括韌帶在內(nèi)的綠松石色椎體生長(zhǎng)區(qū)域。(B)對(duì)于組織形態(tài)學(xué)新荤，對(duì)WT和Chi/+的甲苯胺藍(lán)染色切片的高倍圖像進(jìn)行分析揽趾，允許在終板區(qū)域(即生長(zhǎng)區(qū)域)內(nèi)可視化和測(cè)量類骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。圖像顯示骨細(xì)胞(箭頭)嵌入礦化骨基質(zhì)中苛骨，成骨細(xì)胞(Ob)位于椎骨表面篱瞎。虛線表示脊索軟組織與礦化骨的邊界苟呐。Chi/+中椎體終板的形態(tài)與WT不同，包括更大的椎間隙俐筋，扭曲的幾何形狀牵素，以及椎間韌帶附近深色纖維組織的積累。生長(zhǎng)區(qū)域的典型特寫圖(下圖)顯示成骨細(xì)胞位于WT中厚度<1 μm的淺藍(lán)色類骨接縫上(箭頭)澄者。與WT相比笆呆，Chi/+組織呈現(xiàn)出更厚的類骨層(平均大于1 μm)和更立方體形狀的成骨細(xì)胞的趨勢(shì)。(C)每骨周成骨細(xì)胞數(shù)(N.Ob/B.Pm)顯示Chi/+與WT相比有更高數(shù)量的趨勢(shì)(p = 0.069)粱挡。(D) Chi/+與WT相比赠幕，每骨體積的骨表面積(BS/BV)有更高的趨勢(shì)(p = 0.057)。(E)與WT相比询筏，每骨體積的類骨體積(OV/BV)顯示Chi/+有類骨堆積的趨勢(shì)(p = 0.111)榕堰。(F) Chi/+中每個(gè)骨面積的骨細(xì)胞數(shù)量(N.Ot./B.Ar)明顯低于WT。(G) Chi/+和WT椎體的三維x射線顯微鏡圖像屈留，空間分辨率為0.75 μm。雙錐體形狀在WT和Chi/+中是明顯的测蘑，而骨細(xì)胞腔隙體積及其分布的差異是突出的灌危。腔隙在椎終板附近呈同心分布，在斑馬魚椎體狹窄的椎體中呈軸向分布碳胳。與WT相比勇蝙，Chi/+的骨細(xì)胞腔隙網(wǎng)絡(luò)不太明顯。

討論

通過(guò)顯微ct挨约、FTIR光譜味混、qBEI、納米壓痕诫惭、組織形態(tài)計(jì)量學(xué)和x射線顯微鏡等一系列骨質(zhì)量分析翁锡，本研究揭示了在I型膠原蛋白α1鏈中攜帶雜合甘氨酸替代的OI斑馬魚模型的骨質(zhì)量變化。突變引起的骨質(zhì)量改變?cè)谒醒芯康墓趋啦课欢加斜憩F(xiàn):從全骨到組織水平夕土。

幼年期Chi/+和WT的動(dòng)態(tài)骨組織形態(tài)測(cè)量顯示馆衔，Chi/+斑馬魚模型的骨形成延遲，這與之前的觀察結(jié)果一致怨绣。在Chi/+和WT斑馬魚的成年骨骼上進(jìn)行的三維形態(tài)測(cè)量進(jìn)一步驗(yàn)證了最近在Chi/+斑馬魚模型上進(jìn)行的放射學(xué)和組織學(xué)調(diào)查中描述的骨骼畸形的存在角溃。與人類成骨不全類似，這些異常同時(shí)存在于軸骨和尾骨篮撑。聚焦于椎體减细，本研究顯示骨體積大幅減少，椎骨皮質(zhì)殼更薄赢笨，這與人類I型至IV型成骨不全癥病例的臨床觀察結(jié)果完全一致未蝌。有趣的是驮吱，椎體的偏心率(它們的圓度)不受突變的影響，這表明Chi/+斑馬魚的橫向運(yùn)動(dòng)模式不會(huì)導(dǎo)致脊柱沿線全骨水平的永久性畸形树埠。然而糠馆，Chi/+斑馬魚在第一尾前椎骨和尾中椎骨中表現(xiàn)出明顯的椎體特征，其中包含一個(gè)非典型的礦化核心怎憋。與皮質(zhì)椎體區(qū)域(深色像素)相比又碌，整個(gè)前椎體中礦物質(zhì)與基質(zhì)的比例分布表明，礦化核心(明亮像素)中磷酸鹽與酰胺I的比例較高(圖3D绊袋，插圖)毕匀。這表明該區(qū)域的礦化程度較高或膠原蛋白含量較低。尾前椎骨相同區(qū)域的qBEI圖像(圖4A癌别，插圖)顯示皂岔，與皮質(zhì)區(qū)域相比，核心區(qū)域的礦物質(zhì)分布高度不均勻展姐，鈣含量較低(深色像素)躁垛。對(duì)這些數(shù)據(jù)集的綜合評(píng)估表明，椎體核心的礦化組織似乎是一種異質(zhì)性的圾笨、低礦化的教馆、膠原蛋白含量低的組織。

在人類成骨不全的病例中擂达，已確定多處椎體骨折的積累會(huì)導(dǎo)致進(jìn)行性脊柱畸形土铺。因此，觀察到的Chi/+斑馬魚脊柱變形也可能與骨折史有關(guān)板鬓。在臨床環(huán)境中悲敷，包括骨折和畸形在內(nèi)的大量宏觀異常通常可以根據(jù)影像學(xué)指征來(lái)識(shí)別成骨不全俭令。然而后德，這種方法還不足以作為可靠的骨折風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的基礎(chǔ)，因?yàn)榻】岛筒±砉堑牧W(xué)能力是由組織水平的材料特性決定的抄腔。在這種情況下探遵，成骨不全小鼠模型在很大程度上有助于將成骨不全影響骨的力學(xué)特性與微觀長(zhǎng)度尺度上的超微結(jié)構(gòu)缺陷聯(lián)系起來(lái)，從而更好地理解OI相關(guān)脆性的起源妓柜。

在這項(xiàng)對(duì)攜帶α1-G574D突變的斑馬魚進(jìn)行的研究中箱季，結(jié)構(gòu)和成分分析顯示，有機(jī)膠原基質(zhì)和無(wú)機(jī)礦物晶體相在Chi/+椎骨中均受到顯著影響棍掐。正如振動(dòng)光譜所證明的藏雏，膠原基質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)在Chi/+斑馬魚中顯著不同。雖然光譜分析中使用的膠原相關(guān)亞峰位置和比率還沒有通過(guò)生化分析(如高效液相色譜)與斑馬魚骨中的膠原I分子相關(guān)，但我們發(fā)現(xiàn)掘殴，已建立的膠原成熟度比率(1660/1690 cm-1)在Chi/+中對(duì)較低的膠原成熟度產(chǎn)生了顯著差異赚瘦。這一參數(shù)的改變被認(rèn)為與經(jīng)典顯性O(shè)I中異常的膠原纖維形成和結(jié)構(gòu)有關(guān)，這被認(rèn)為包括隨后基質(zhì)中的礦物晶體成核奏寨。

事實(shí)上起意，這項(xiàng)研究中評(píng)估的礦物相關(guān)參數(shù)在Chi/+斑馬魚中受到了影響。盡管OI患者表現(xiàn)為骨密度和骨量降低病瞳，但OI的礦化模式在整個(gè)骨骼中可能具有高度異質(zhì)性揽咕。因此，據(jù)報(bào)道套菜，在小鼠OI模型和人類OI模型中亲善，組織水平的礦化程度增加。類似地逗柴，Chi/+斑馬魚的鈣含量升高蛹头，而羥基磷灰石顆粒的礦物結(jié)晶度顯著低于WT。通過(guò)振動(dòng)光譜評(píng)估的參數(shù)結(jié)晶度與骨中羥基磷灰石晶體的成熟度戏溺、大小和純度相關(guān)渣蜗，因此表明Chi/+斑馬魚中的晶體更小、化學(xué)計(jì)量更少旷祸。此外耕拷，Chi/+斑馬魚顯示出較高的碳酸鹽/磷酸鹽比率，支持晶體晶格組成中較高的碳酸鹽取代肋僧，因此晶體成熟度較低斑胜。斑馬魚中的這些發(fā)現(xiàn)與之前在小鼠OI模型和ⅰ~ⅳ型OI的人類組織中觀察到的結(jié)果一致控淡，提示受累組織的礦物質(zhì)與基質(zhì)比和組織礦物質(zhì)密度(TMD)增加嫌吠，晶體較小但更豐富。

關(guān)于Chi/+骨組織的力學(xué)特性掺炭，這項(xiàng)研究支持以下觀點(diǎn):受損的礦物-基質(zhì)相互作用以及受損的膠原和晶體特性是OI中骨脆性增加的原因辫诅。從突變Chi/+斑馬魚骨獲得的力學(xué)測(cè)試數(shù)據(jù)與Imbert等人對(duì)人骨的研究一致，他們檢測(cè)到與使用納米壓痕的生理骨組織相比涧狮，受oi影響的骨組織的彈性模量顯著降低炕矮，但硬度沒有降低。在健康的骨骼中者冤，較高的礦物質(zhì)密度預(yù)計(jì)會(huì)導(dǎo)致硬度增加肤视。然而，在OI的情況下涉枫，基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和成分受損邢滑，礦物質(zhì)密度的增加并不能彌補(bǔ)與疾病相關(guān)的其他骨質(zhì)量因素的減少。此外愿汰，Chi/+(斷裂韌性的替代指標(biāo))中較低的彈性模量/硬度比值表明突變體對(duì)斷裂的抵抗力較低困后。

在人類成骨不全癥中乐纸，骨基質(zhì)性質(zhì)的改變可能與骨重塑率增加、破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞活性增加有關(guān)摇予。雖然有證據(jù)表明骨重建確實(shí)發(fā)生在硬骨魚中汽绢，但評(píng)估斑馬魚動(dòng)態(tài)骨重建的標(biāo)準(zhǔn)化方案尚未建立。在本研究中侧戴，靜態(tài)骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)顯示成骨細(xì)胞呈現(xiàn)出特殊的立方體形狀宁昭，這與之前關(guān)于斑馬魚成骨受損突變體的研究一致。與WT相比救鲤，Chi/+中的成骨細(xì)胞和類骨指數(shù)略有升高久窟，表明類骨的積累增加。此外本缠，通過(guò)2D的組織形態(tài)計(jì)量學(xué)和3D的x射線顯微鏡可以證明斥扛，與WT相比，Chi/+中的骨細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)顯著減少(見圖6)丹锹。這可能是在類骨積累后發(fā)生的組織礦化和成熟過(guò)程受損的結(jié)果稀颁，并進(jìn)一步表明Chi/+中的骨重塑和修復(fù)能力受到阻礙。由于OI中成骨細(xì)胞礦化類骨的能力受到阻礙楣黍，整體骨形成率受到負(fù)面影響匾灶。雖然Chi/+中骨形成的延遲在幼蟲階段已經(jīng)被檢測(cè)到(圖1)，但尚不清楚這種骨形成缺陷是否導(dǎo)致了在成年魚中觀察到的骨細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的改變租漂，還是網(wǎng)絡(luò)的減少是成骨細(xì)胞分化受損或突變體肌肉骨骼活性降低的結(jié)果阶女。為了更好地理解導(dǎo)致Chi/+斑馬魚骨質(zhì)量改變的細(xì)胞機(jī)制，我們需要進(jìn)一步研究生理和病理斑馬魚骨細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)哩治。

對(duì)斑馬魚突變體的研究有一些局限性秃踩。首先，與小鼠骨骼相比业筏，目前只有有限的標(biāo)準(zhǔn)化方案來(lái)評(píng)估斑馬魚骨骼的結(jié)構(gòu)和骨細(xì)胞特性憔杨。在斑馬魚骨骼中，不同年齡的骨形成和骨吸收的動(dòng)力學(xué)尚未完全闡明蒜胖。隨著斑馬魚成為骨骼生物學(xué)和疾病研究領(lǐng)域越來(lái)越受重視的動(dòng)物模型消别，評(píng)估該物種的代謝性骨骼特征將變得至關(guān)重要。第二台谢，本研究不能提供Chi/+骨的斷裂行為的直接測(cè)量寻狂。雖然斑馬魚的小尺寸在住房和大規(guī)模人群研究中具有優(yōu)勢(shì)，但進(jìn)行力學(xué)測(cè)試具有挑戰(zhàn)性朋沮。盡管大多數(shù)哺乳動(dòng)物骨可以在經(jīng)典的全骨力學(xué)測(cè)試中進(jìn)行測(cè)試蛇券，但對(duì)斑馬魚骨力學(xué)性能的評(píng)估仍然局限于納米壓痕，提供局部力學(xué)性能的信息。

綜上所述怀读，本研究為攜帶顯性膠原突變的斑馬魚骨的形態(tài)诉位、結(jié)構(gòu)、成分菜枷、力學(xué)性能以及組織和細(xì)胞指數(shù)提供了定量數(shù)據(jù)苍糠。多模態(tài)和多尺度的骨骼表征表明Chi/+斑馬魚骨骼中的骨質(zhì)量顯著受損。骨骼水平的具體表型包括身材矮小啤誊、骨畸形和骨折岳瞭；組織水平的分析反映了較高的骨密度分布，但降低了礦物質(zhì)和基質(zhì)成熟度蚊锹。后一種變化的總和導(dǎo)致了吉娃娃斑馬魚機(jī)械性能的降低瞳筏。與人類OI病例類似，骨脆性增加牡昆，在Chi/+突變體中觀察到的畸形和骨折是骨質(zhì)量改變的結(jié)果姚炕。吉娃娃斑馬魚可被認(rèn)為是一種合適的動(dòng)物模型，反映了人類經(jīng)典型顯性骨病患者發(fā)生的骨改變丢烘。對(duì)該模型的深入研究將對(duì)改善現(xiàn)有的OI治療策略柱宦，特別是新型藥物篩選試驗(yàn)和給藥，以及包括肌肉骨骼運(yùn)動(dòng)在內(nèi)的常規(guī)治療具有重要價(jià)值播瞳。

基金：這項(xiàng)研究得到了PIER(No.PIF-2014-28)掸刊、德國(guó)研究基金會(huì)(No.BU 2562/2-1/3-1)、Cariplo基金會(huì)(No.2013-0612)赢乓、Telethon(No.GGP13098)等的支持忧侧。

原文：Fiedler I A K, Schmidt F N, W?lfel E M, et al. Severely impaired bone material quality in chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta[J]. Journal of Bone and Mineral Research, 2018, 33(8): 1489-1499.

原文地址：https://asbmr.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jbmr.3445