雜志：Journal of Bone and Mineral Researc

影響因子：6.2（2022）

年份：2019

通訊作者： Yangli Xie, Lin Chen

通訊作者單位：Laboratory of Wound Repair and Rehabilitation, State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury, Trauma Center, Research Institute of Surgery, Daping Hospital, Army Medical University, Chongqing, 400042, China

摘要

軟骨-毛發(fā)發(fā)育不全（CHH）是一種常染色體隱性干骺端軟骨發(fā)育不良，其特征是骨發(fā)育不良和許多其他高度可變的特征爆阶。負責CHH的基因是線粒體RNA加工核糖核酸內(nèi)切酶（RMRP）基因的RNA成分燥透。目前，CHH患者的骨軟骨發(fā)育不良和骨骼外表現(xiàn)的發(fā)病機制仍不完全清楚辨图；此外班套，目前還沒有可行的CHH動物模型。我們建立了一個rmrp KO斑馬魚模型來研究CHH的發(fā)育機制故河。我們發(fā)現(xiàn)rmrp是咽弓的模式和塑造所必需的吱韭。軟骨內(nèi)骨骨化的異常是可變的，這取決于軟骨形成失調(diào)的程度鱼的。此外理盆，rmrp突變通過失調(diào)細胞周期和凋亡相關(guān)基因的表達來抑制細胞增殖，促進細胞凋亡凑阶。我們還證明猿规，rmrp突變上調(diào)了典型的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路；對Wnt/β-連環(huán)蛋白的藥理抑制可以部分緩解rmrp突變體的軟骨發(fā)育不良和增加椎骨礦化宙橱。我們的研究通過建立一個新的斑馬魚CHH模型姨俩，部分揭示了CHH的潛在機制，從而加深了我們對rmrp在骨骼發(fā)育中的作用的理解养匈。

關(guān)鍵詞：軟骨毛發(fā)發(fā)育不全哼勇；RMRP；斑馬魚呕乎；骨骼發(fā)育积担；wnt/β-連環(huán)蛋白

背景

軟骨毛發(fā)發(fā)育不全（CHH）或mckusick型干骺端軟骨發(fā)育不良（MCD；OMIM 250250）是一種多效性常染色體隱性遺傳疾病猬仁。雖然CHH在一般人群中極其罕見帝璧，在世界范圍內(nèi)沒有精確的發(fā)病率先誉，但計算出阿米什人和芬蘭人的攜帶者頻率分別高達1：19和1：76。CHH的臨床特征包括短肢侏儒癥和一系列骨骼外表現(xiàn)的烁，如低毛癥褐耳、胃腸道（GI）功能障礙、免疫缺陷渴庆、貧血和惡性腫瘤風險增加铃芦。CHH的表型變化很大。CHH最普遍的特征是不成比例的短肢矮小和短和增厚的長骨襟雷，通常在新生兒刃滓，偶爾在產(chǎn)前階段。管狀骨異常包括增寬耸弄、扇形和不規(guī)則硬化干骺端咧虎。通常，CHH患者的骨骺骨化中心在影像學上表現(xiàn)正常计呈，骨密度基本正常砰诵。

CHH是由RMRP（線粒體RNA加工核糖核酸內(nèi)切酶的RNA成分）的純合子或復合雜合子突變引起的，RNA組成是核糖核蛋白復合核糖核酸酶線粒體RNA過程（RNase MRP）捌显。RMRP是一種長鏈非編碼RNA（lncRNA）茁彭，是第一個被發(fā)現(xiàn)可引起遺傳性疾病的核非編碼RNA基因。到目前為止扶歪，已有133例CHH患者的突變被描述尉间。在RMRP轉(zhuǎn)錄本中鑒定出90個，其他在RMRP啟動子中击罪。大多數(shù)突變發(fā)生在高度保守的區(qū)域。一些研究表明贪薪，RMRP突變導致RNA轉(zhuǎn)錄本的豐度減少或不穩(wěn)定性媳禁。RNase MRP廣泛存在于真核生物中，并作為一種核糖核酸內(nèi)切酶画切，可以切割幾種RNA底物竣稽。在酵母中的研究表明，RNase MRP切割啟動線粒體DNA復制的RNA霍弹，并通過分裂細胞周期蛋白b2 mRNA毫别，在有絲分裂結(jié)束時的細胞周期調(diào)控中發(fā)揮作用。RMRP最廣為人知的功能是參與核糖體前RNA的加工典格，它促進A3位點的切割岛宦，產(chǎn)生5.8 S rRNA的短形式蔓涧。此外眉孩，RMRP可以與端粒酶相關(guān)逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）形成復合物苹熏，該RT發(fā)揮依賴RNA的RNA聚合酶活性翩蘸，能夠產(chǎn)生雙鏈RMRP RNA，以預測依賴的方式加工成小干擾RNA变汪。此外侠坎，RMRP RNA可以作為至少兩個其他短RNA RMRP- S1和RMRP-S2的生產(chǎn)池，它們作為miRNA具有強大的基因沉默活性裙盾，靶向與不同CHH表型直接相關(guān)的基因集实胸。

迄今為止，已有幾項研究調(diào)查了CHH的發(fā)病機制番官。人類CHH白細胞的轉(zhuǎn)錄譜顯示了幾種細胞因子和細胞周期調(diào)節(jié)基因的上調(diào)庐完。CHH中核糖體處理的改變似乎與最終分化細胞中細胞因子的產(chǎn)生和細胞周期進程的改變有關(guān)，如淋巴細胞和軟骨細胞譜系鲤拿〖偻剩克里斯蒂安和同事測試了不同突變的RNase MRP多蛋白特異性mRNA和rRNA的切割，顯示rRNA切割的減少與骨發(fā)育不良的程度之間有很強的相關(guān)性近顷，其中mRNA切割的減少與體外其他表型有關(guān)生音。最近，Mandy等人發(fā)現(xiàn)Rmrp RNA的表達在培養(yǎng)的ATDC5細胞的不同軟骨分化階段受到調(diào)控窒升，提示Rmrp RNA可能是軟骨分化的重要調(diào)控因子缀遍。

目前，目前還沒有可行的CHH動物模型饱须。在酵母中域醇，RMRP酵母同源物NME1功能的喪失是致命的，在小鼠E6.5之前蓉媳，RMRP基因的純合子缺失是致命的譬挚。斑馬魚，由于其快速發(fā)育過程酪呻、后代數(shù)量多减宣、外部發(fā)育、透明度和多種基因操作玩荠，是研究參與骨骼發(fā)育的基因功能的一個非常有吸引力的動物模型漆腌。此外，斑馬魚的基因組與人類基因組的同源性約為70%：斑馬魚和哺乳動物之間骨骼形成的分子基礎和關(guān)鍵調(diào)控因子似乎高度保守阶冈。最后闷尿，在骨骼特異性啟動子的控制下，表達熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚株系的廣泛應用女坑，使哺乳動物系統(tǒng)中細胞和信號動力學的體內(nèi)可視化難以解決填具。

在本研究中，我們建立了一個rmrp KO斑馬魚模型匆骗，以進一步了解CHH的發(fā)育機制灌旧。我們發(fā)現(xiàn)绑咱，rmrp突變通過失調(diào)細胞周期和凋亡相關(guān)基因的表達，破壞軟骨生成和骨骨化枢泰，抑制細胞增殖描融，促進細胞凋亡。我們還發(fā)現(xiàn)衡蚂，Wnt/β-連環(huán)蛋白通路的上調(diào)參與了rmrp突變導致的異常軟骨生成和骨骨化窿克。

斑馬魚株和轉(zhuǎn)基因系合成

采用AB遺傳背景的斑馬魚（Danio rerio）。轉(zhuǎn)基因株系Tg（col2a1a：EGFP）和Tg（col2a1a：mCherry）在我們實驗室使用1.7 kb的col2a1a啟動子生成毛甲。Tg（ostreix：EGFP）被贈予年叮；Tg（flk1：EGFP）之前已經(jīng)被描述。所有斑馬魚都被安置在半循環(huán)住房系統(tǒng)玻募，并在恒溫（27°至28°）保持14：10小時的光暗周期只损。所有的斑馬魚品系都按照前面描述的標準方案進行飼養(yǎng)和維護。所有體內(nèi)實驗和方案均經(jīng)抑郁醫(yī)院外科研究所機構(gòu)動物護理和使用委員會批準七咧。

RMRP的轉(zhuǎn)錄區(qū)和啟動子區(qū)的多序列比對

RMRP核苷酸序列從Ensembl（http://www.ensembl.org）下載跃惫。將人類ENST0000 0363046.1、小鼠ENSMUST00000157463.1和斑馬魚ENSDART000000115550.2進行轉(zhuǎn)錄區(qū)比對艾栋，轉(zhuǎn)錄起始位點-300用于啟動子區(qū)域比對爆存。采用Clustal W軟件（www.clustal.org）進行多序列比對。共識元素用BoxShade（http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html）突出顯示蝗砾。人類RMRP和斑馬魚RMRP的二級結(jié)構(gòu)從Ensembl下載先较，結(jié)構(gòu)信息主要來自Rfam（https://rfam.xfam.org/）提供的協(xié)方差模型。

原位雜交和抗體染色

擴增反義探針合成模板并克隆到pGEMT-easy載體（Promega悼粮，F(xiàn)itchburg闲勺，WI，USA）中扣猫。所有的探針序列可從相應的作者的要求霉翔。地高辛標記的探針通過體外轉(zhuǎn)錄生成（DIG RNA標記試劑盒；羅氏分子診斷公司苞笨，布蘭奇堡，新澤西州子眶，美國）瀑凝；原位雜交如前所述進行。圖像是使用立體發(fā)現(xiàn)20顯微鏡（卡爾蔡司臭杰，奧伯科琴粤咪，德國）拍攝的。全貼式抗體染色如前所述渴杆。胚胎首先與II型膠原蛋白抗體孵育（1：300）和Axin 2（1：300）寥枝，然后與Alexa熒光偶聯(lián)的二抗（1：500宪塔；美國加州，卡爾斯巴德）孵育囊拜。

利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)生成rmrp突變體

如前所述某筐，利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向Rmrp的酶促位點，生成Rmrp突變體冠跷。培養(yǎng)攜帶缺失突變的奠基魚（F0）和相應的F1胚胎南誊。將雜合子rmrp突變的F1魚進行雜交，鑒定具有表型的突變體蜜托。

Edu細胞增殖試驗和TUNEL試驗

胚胎在受精后3天（dpf）注射0.2m MEdu抄囚，并在28.5℃孵育1小時。胚胎用4%多聚甲醛在4℃下固定過夜后橄务，根據(jù)制造商的說明進行Edu檢測幔托。TUNEL細胞凋亡檢測在3 dpf下進行，使用原位細胞死亡檢測試劑盒TMR Red（羅氏12156792910）蜂挪，按照制造商的說明進行重挑。

實時定量聚合酶鏈反應

根據(jù)制造商的協(xié)議，使用Trizol試劑（Invitrogen 15596-026）從整個胚胎（每組30至40個胚胎）中分離總RNA锅劝。實時熒光定量qPCR檢測方法如前所述攒驰。所有樣品重復測量3次，并歸一化為內(nèi)對照gapdh故爵。退火溫度為58°C玻粪。本研究中使用的引物的序列信息將根據(jù)要求提供。

蛋白印跡分析

用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液（Roche）裂解4 dpf時的斑馬魚胚胎诬垂。等量的蛋白質(zhì)樣品在12%的SDS-PAGE凝膠上溶解劲室，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上（微波波，伯靈頓结窘，MA很洋，美國）。然后用非磷酸（活性）β-連環(huán)蛋白一抗(1：1000隧枫；細胞信號技術(shù)8814 S喉磁；細胞信號技術(shù)，丹弗斯官脓，MA协怒，美國）和磷酸-β-連環(huán)蛋白（1：1000；細胞信號技術(shù)9561 S）卑笨，然后用二抗孕暇。使用化學發(fā)光信號（Pierce NCI4106；皮爾斯，羅克福德妖滔，IL隧哮，美國）檢測信號。

骨骼染色和影像學檢查

標記軟骨和骨骼的阿利新藍和軟骨素紅染色使用了Walker和同事的修改方案座舍。體內(nèi)茜素紅染色沮翔，可以標記礦化骨和腸道，斑馬魚與0.05%茜素紅（Sigma-Aldrich簸州，圣路易斯鉴竭，莫，美國）孵育1小時岸浑，然后用系統(tǒng)水洗滌3次搏存。阿利新藍染色和椎體茜素紅染色使用SteREO Discovery 20顯微鏡成像。用抗體染色或其他活染色的胚胎用LSM880NLO共聚焦顯微鏡和20×水浸物鏡（Carl Zeiss）成像矢洲。使用ImageJ軟件（NIH璧眠，Bethesda，MD读虏，USA责静；https://imagej.nih.gov/ij/）測量茜素紅活染色后礦化骨的相對面積。

藥物處理

XAV939購自Selleck化學公司（休斯頓盖桥，TX灾螃，美國），用DMSO溶解揩徊，得到10 mM的原液腰鬼。WT斑馬魚和rmrp突變體分別用10μM XAV939或0.1% DMSO對照在受精后60-96小時（hpf）處理，研究咽弓軟骨的發(fā)育塑荒。此外熄赡，使用10μM XAV939或0.1% DMSO對照，從4 dpf到6 dpf齿税，研究7 dpf時的骨骨化彼硫。使用ImageJ（NIH）測量舌角骨長度。

統(tǒng)計分析

所有數(shù)值數(shù)據(jù)均以平均±標準差表示凌箕。誤差條表示SD拧篮。兩組之間的差異采用非配對的學生t檢驗，并采用單向方差分析進行多組（三組或三組以上）的比較牵舱。所有統(tǒng)計分析均使用GraphPad棱鏡（GraphPad軟件串绩，拉霍亞，CA仆葡，美國）和SPSS統(tǒng)計軟件（SPSS，芝加哥，IL沿盅，USA）進行把篓。p值在p < 0.05、p < 0.01和p < 0.001時被認為是顯著的腰涧。

斑馬魚rmrp在多個物種中高度保守

RMRP在多個物種中具有一些保守的序列區(qū)域和二級結(jié)構(gòu)元件韧掩，特別是在哺乳動物物種中高度保守。為了確定斑馬魚rmrp的序列保守性窖铡，我們對人類疗锐、小鼠和斑馬魚中rmrp的轉(zhuǎn)錄區(qū)域和啟動子區(qū)域進行了多個序列比對。RMRP的轉(zhuǎn)錄區(qū)域在斑馬魚與人類之間的序列相似性為59.9%（圖1A）费彼。完全保守的區(qū)域位于63-82和242-259之間滑臊，它們在參與RNA裂解的蛋白質(zhì)復合物的酶促位點上提供了一個第三級元素。有趣的是箍铲，根據(jù)我們的比對數(shù)據(jù)雇卷，CHH患者中大多數(shù)突變的轉(zhuǎn)錄核苷酸在人類、小鼠和斑馬魚中高度保守（圖1A）颠猴，這表明斑馬魚rmrp的轉(zhuǎn)錄區(qū)域高度保守关划。

我們還對RMRP的啟動子區(qū)域進行了比對，發(fā)現(xiàn)TATA box翘瓮、近端序列元件贮折、八聚體元件和SP1結(jié)合位點，它們是RNA聚合酶III啟動子元件资盅，是高度保守的（圖1B）调榄。TATA box和轉(zhuǎn)錄起始位點之間的長度經(jīng)常被插入、重復和三倍改變律姨，導致RMRP轉(zhuǎn)錄減少振峻，在24 bp~26 bp保守。斑馬魚中rmrp的二級結(jié)構(gòu)也與人類的RMRP相似（圖1C）择份。此外扣孟，rmrp轉(zhuǎn)錄本的整體頸環(huán)結(jié)構(gòu)在物種之間保持不變。

我們還對斑馬魚荣赶、人類和小鼠中的RMRP基因進行了共線性分析（圖1D）凤价。我們發(fā)現(xiàn)rmrp周圍的基因（tesk1和ccdc149b）與人和小鼠rmrp周圍的基因（TESK1和CCDC107）具有同源性。在人類和小鼠RMRP基因中發(fā)現(xiàn)6個下游基因（CLTA拔创、GNE利诺、RNF38、MELK剩燥、PAX5慢逾、ZCCHC7）在斑馬魚RMRP上游的同一染色體上立倍。這表明斑馬魚的rmrp基因與人類的RMRP和小鼠的Rmrp基因是同源的÷绿玻總之口注，這些數(shù)據(jù)表明斑馬魚rmrp是高度保守的，可能在多個物種中發(fā)揮保守作用君珠。

圖1 斑馬魚rmrp在多個物種中高度保守寝志。(A)對人類（264 bp）、小鼠（271 bp）和斑馬魚（256 bp）的RMRP轉(zhuǎn)錄區(qū)域進行多序列比對策添。已發(fā)表的與疾病相關(guān)的突變的核苷酸用紅色下劃線表示材部。（15）(B)RMRP啟動子區(qū)域在-300~-1之間的多序列比對。下劃線分別突出顯示了SP1結(jié)合位點唯竹、八聚體元件乐导、近端序列元件（PSE）和TATA box。對齊是基于ClustalW（www.clustal.org）對齊的摩窃；共識元素由(A)和(B)中的BoxShade（http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html）突出顯示(C)人類RMRP（集成條目ENST00000363046.1兽叮，左）和斑馬魚rmrp（集成條目ENSDART00000115550.2，右）的二級結(jié)構(gòu)猾愿，來自集成（http://www.ensembl.org）鹦聪。結(jié)構(gòu)信息主要來自于Rfam（https://rfam.xfam.org/）提供的協(xié)方差模型。(D)對斑馬魚蒂秘、人類和小鼠中RMRP基因的保守共時性分析泽本。基因名稱旁邊的數(shù)字代表染色體上基因位置的巨堿基對（Mbp）。染色體片段用藍線和藍色虛線表示姻僧。

斑馬魚發(fā)育過程中rmrp的表達模式

我們采用全體原位雜交法檢測了rmrp的表達模式规丽。結(jié)果顯示，rmrp在母體和合子中表達（圖2）撇贺。Rmrp轉(zhuǎn)錄本在原腸形成前的早期胚胎階段廣泛分布（圖2A-C）,然后后期階段在頭部和軀體區(qū)域富集（圖2D-K）赌莺。Rmrp廣泛分布于包括腦和眼在內(nèi)的各個組織，從體期到頭區(qū)48 hpf（圖2d-k）松嘶。rmrp在分節(jié)階段表達較強艘狭，在后期逐漸下降（圖2D-K）。早在48 hpf時翠订，在胸鰭芽（圖2J）和腸球原基（圖2K）中均檢測到rmrp的表達巢音。從72 hpf到4 dpf，該表達更為顯著尽超；在4 dpf時官撼，rmrp在腸球和腸管中明顯表達（圖2U，W)似谁。在48 hpf時在咽部袋中檢測到Rmrp轉(zhuǎn)錄物傲绣，然后在60 hpf時在下頜骨和舌骨弓軟骨中檢測到轉(zhuǎn)錄物（圖2M掠哥，N）。從72 hpf到4 dpf秃诵，rmrp在鰓弓1到5軟骨的軟骨細胞中逐漸表達龙致，但在頭部廣泛表達無明顯影響（圖2R，V）顷链。我們使用rmrp sense RNA探針作為陰性對照(補充圖。S1).這些觀察結(jié)果表明屈梁，rmrp可能在包括軟骨在內(nèi)的各種組織的發(fā)育中發(fā)揮作用嗤练。

圖2 通過全貼裝原位雜交檢測野生型斑馬魚中rmrp的表達模式。（A-C）Rmrp在單細胞期(A)在讶、雙細胞期(B)和芽期(C).廣泛表達（D煞抬，E）8體(D)期和18體期胚胎的側(cè)視圖(E)。（F-H）受精后24小時（hpf）胚胎(F)和腦區(qū)(G)和體區(qū)(H)的放大放大圖构哺。（I-K）48hpf胚胎的側(cè)視圖(I)和頭部區(qū)域背側(cè)視圖(J)和側(cè)視圖(K)革答。（L-O）60hpf胚胎的側(cè)視圖（-）和頭部區(qū)域側(cè)視圖(M)、腹側(cè)視圖(N)和背側(cè)視圖(O)曙强。（P-S）72hpf胚胎側(cè)視圖(P)残拐，頭部區(qū)域側(cè)視圖(Q)和腹側(cè)視圖(R)，體區(qū)放大圖(S)碟嘴。（T-W）受精后4天（dpf）胚胎側(cè)視圖(T)溪食，頭部區(qū)域側(cè)視圖(U)和腹側(cè)視圖(V)，體區(qū)高倍放大圖(W)娜扇。n = 30個胚胎為A-W错沃。巴=鰓弓；Br =腦雀瓢；H=舌骨弓枢析；IB =腸球；IBP =腸球原基刃麸；IT =腸管醒叁；M=下頜骨。

斑馬魚中rmrp敲除會破壞下頜發(fā)育

為了建立斑馬魚CHH模型并研究rmrp在發(fā)育中的作用嫌蚤，我們對KO rmrp基因采用了CRISPR/Cas9基因組編輯方法辐益。我們首先設計了兩個針對酶位點的目標序列，這是位于rmrp63-82bp的最保守的區(qū)域脱吱，在人類CHH中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)已知致病單核苷酸突變的位置智政。通過對F0代的KO突變體進行測序，我們發(fā)現(xiàn)靶位點2具有較高的靶向效率（圖3A）箱蝠。我們將這些F0突變體繁殖到F2代续捂，得到了一個穩(wěn)定的純合子突變系垦垂。該突變系在rmrp的一個高度保守的區(qū)域缺失了一個13bp的缺失，包括一些酶的位點序列（圖3B）牙瓢。既往研究表明劫拗，RMRP轉(zhuǎn)錄區(qū)突變導致RMRP結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，導致RMRP RNA水平降低矾克，這是CHH患者的一個關(guān)鍵分子特征页慷。我們進行了RT-qPCR，發(fā)現(xiàn)rmrp?/?斑馬魚中rmrp的表達水平顯著降低（圖3C）胁附。此外酒繁，整體原位雜交顯示，在rmrp?/?斑馬魚中控妻，rmrp的表達很少（圖3D）州袒。這些結(jié)果表明，斑馬魚rmrp保守區(qū)域的突變也可能導致rmrp的不穩(wěn)定弓候，從而導致表達降低郎哭。

我們分析了rmrp KO斑馬魚的大體表型。rmrp雜合子突變胚胎與WT同胞一樣正常菇存。純合子突變胚在72 hpf左右前均未出現(xiàn)明顯的形態(tài)缺陷夸研，此時頜骨逐漸形成。在3 dpf時的光學顯微鏡下依鸥，rmrp?/?幼蟲的下頜明顯縮小陈惰，很容易被識別出來，并且比野生型斑馬魚的眼睛稍小一些（圖3E）毕籽。到6 dpf時抬闯，rmrp?/?胚胎的下頜缺陷更明顯，眼睛也更小关筒。此外溶握，突變體不能形成魚鰾，頭部較小蒸播，并伴有心包水腫睡榆。突變體幼蟲的胃腸道也出現(xiàn)發(fā)育不全（無褶皺的小腸；圖3E)袍榆。在9 dpf時胀屿，上述表型變得更加嚴重，但突變體的體長略長于其WT同胞的體長（圖3E包雀，F(xiàn)）宿崭。由于其多重發(fā)育畸形，rmrp?/?突變體在12 dpf到14 dpf內(nèi)死亡才写。

圖3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建rmrp KO斑馬魚下頜發(fā)育破壞葡兑。(A)KOrmrp基因的Cas9靶位點2在GI F0生成中具有較高的靶向效率奖蔓。(B)顯示rmrp突變系缺失13 bp，用紅色虛線表示讹堤。GGG（紅色）為PAM序列吆鹤。(C) RT-qPCR結(jié)果顯示，rmrp?/?斑馬魚中rmrp的表達水平顯著降低洲守。取值為平均±標準差疑务。***p < 0.001，n = 3個獨立的樣本組梗醇。采用全貼裝原位雜交法檢測(D)rmrp?/?斑馬魚中(D) Rmrp的表達暑始。值得注意的是，很少有rmrp表達婴削，從18體細胞到受精后4天逐漸減少（dpf）。n = 30個胚胎牙肝。(E)光鏡檢測WT和rmrp KO斑馬魚在3dpf~9dpf之間的總表型唉俗。側(cè)視圖的放大倍數(shù)在右面板上。箭頭表示下頜骨的縮小配椭。(F)rmrp?/?的胚胎長度測量顯示虫溜，在9 dpf時，它們明顯長于WT的兄弟姐妹股缸。取值為平均±標準差衡楞。***p < 0.001, n = 10.比例尺=，D為200μm敦姻，E為400 μm瘾境。

rmrp調(diào)節(jié)咽弓的模式和塑造

由于軟骨缺損是CHH的一個典型特征，我們評估了斑馬魚顱面骨骼的軟骨模式镰惦。阿利新藍和茜素紅染色顯示迷守，rmrp?/?胚胎的下頜明顯縮小是由5 dpf時咽部弓軟骨的發(fā)育缺陷引起的（圖4A）。rmrp?/?胚胎表現(xiàn)出明顯的倒置或不完全發(fā)育的神經(jīng)鰓角旺入，且神經(jīng)鰓弓發(fā)育遲緩兑凿。在rmrp突變體中，頸鰓-5骨和附著的咽部牙齒均表現(xiàn)出缺陷形態(tài)發(fā)生和延遲礦化（圖4A）茵瘾。此外礼华，Meckel軟骨和腭軟骨有輕微的形態(tài)異常，可能是由于突變體舌骨角的變化引起的（圖4A）拗秘。

為了更密切地觀察下頜軟骨和軟骨發(fā)育不良的動態(tài)發(fā)育圣絮，我們在軟骨細胞報告細胞系Tg（col2a1a：EGFP）的背景下生成了rmrp突變體。在3 dpf時雕旨，軟骨細胞像硬幣一樣堆疊晨雳，橫跨WT軟骨中通常排列成單細胞寬的一排的軟骨鳖谈。然而，在rmrp突變體中诲侮，軟骨細胞呈圓形跑芳，有多層細胞紊亂，col2a1a標記的熒光信號擴散帮非，因此氧吐，很難辨別軟骨細胞的形態(tài)（圖4B）。在此階段末盔，與野生型斑馬魚相比筑舅，rmrp突變體的角軟骨扭曲，角軟骨角變鈍（圖4B）陨舱。然而翠拣，神經(jīng)顱內(nèi)的篩板沒有明顯變化（圖4B)。在6 dpf時游盲，可以觀察到軟骨細胞形態(tài)误墓，但rmrp突變體中Meckel和宮頸軟骨的軟骨細胞排列仍然紊亂。特別是神經(jīng)膜軟骨有明顯的凹陷益缎，基底膜軟骨有發(fā)育缺陷（圖4B）谜慌。與野生型斑馬魚相比，角骨軟骨角明顯增加莺奔，角骨長度減行婪丁（圖4C，D）令哟。

我們通過全體原位雜交技術(shù)檢測了軟骨形成相關(guān)基因的表達恼琼。在咽部軟骨的rmrp突變體中，軟骨細胞標記物sox9a和col2a1a在60 hpf時的表達延遲屏富，但它們在篩板中的表達沒有受到影響（圖4E）驳癌。在72 hpf時，sox9a和col2a1a的表達水平顯著升高役听，且宮頸軟骨角更鈍（圖4E）颓鲜。在4 dpf時，rmrp突變體的col2a1a水平仍然較高典予；與WT基底軟骨相比甜滨，咽部軟骨畸形更嚴重，基底軟骨仍然沒有col2a1a的表達（圖4E)瘤袖。以col2a1a和sox9a的Sense RNA探針作為陰性對照(補充圖 S2A)衣摩。總之，我們的數(shù)據(jù)表明艾扮，rmrp調(diào)控咽部弓的模式和塑造既琴，這表明，rmrp缺失的斑馬魚再現(xiàn)了CHH相關(guān)的軟骨表型泡嘴。

圖4 rmrp調(diào)節(jié)咽部弓的模式和成形甫恩。（A）WT斑馬魚和rmrp突變體的(A)阿利新藍和茜素紅骨架染色。(B)共聚焦圖像顯示W(wǎng)T斑馬魚和轉(zhuǎn)基因背景（col2a1a：EGFP）rmrp突變體從受精后3天（dpf）到6 dpf的下頜軟骨發(fā)育酌予。WT斑馬魚和rmrp突變體在6 dpf時的角軟骨角(C)和角軟骨長度(D)的定量分析磺箕。取值為平均±標準差。**p < 0.01, n = 5.(E)受精后60小時的sox9a（hpf）和72hpf（上）以及60 hpf抛虫、72 hpf和4dpf（下）的col2a1a的全安裝原位雜交松靡。WT斑馬魚，n = 30建椰；rmrp突變體雕欺，n = 10。=基底棉姐；Cb =頸鰓屠列；=頸；篩板谅海；=低辛；=Meckel軟骨蹦浦；Pq =腭扭吁。比例尺：A和E為200 μm；B為50 μm盲镶。

及時的骨化需要rmrp

據(jù)報道侥袜，部分CHH患者存在骨化異常。為了研究rmrp突變對斑馬魚骨形成的影響溉贿，我們采用茜素紅活染色法以及轉(zhuǎn)基因株系Tg（osterix：EGFP）枫吧，它標記成骨細胞以檢查頭骨的骨化。從6 dpf到9 dpf宇色，共聚焦顯微鏡顯示W(wǎng)T斑馬魚頭骨膜內(nèi)骨和軟骨內(nèi)骨均逐漸骨化九杂；然而在rmrp突變體中，膜內(nèi)骨的蓋宣蠕、鰓骨射線和消化道骨化延遲（圖5A)例隆。rmrp突變體在9 dpf時的膜內(nèi)骨骨化程度與WT斑馬魚在6 dpf時的程度大致相同，特別是鰓環(huán)的礦化區(qū)域抢蚀，但突變體的鰓骨射線仍然很卸撇恪（圖5A，B）皿曲。有趣的是唱逢，轉(zhuǎn)基因株系Tg（osterix：EGFP）的茜素紅染色顯示吴侦，在9 dpf時，WT和突變斑馬魚的神經(jīng)顱骨篩板成骨細胞分化和礦化沒有顯著差異(補充圖 S3)坞古。這些數(shù)據(jù)表明备韧，rmrp突變影響內(nèi)臟顱骨膜內(nèi)骨的礦化，而不影響神經(jīng)顱骨的礦化绸贡。在6 dpf時盯蝴，WT斑馬魚的軟骨、頦骨听怕、關(guān)節(jié)后軟骨捧挺、鰓下軟骨和頸鰓膜-5軟骨的軟骨內(nèi)骨發(fā)生骨化，但在rmrp突變體中尿瞭，頦骨闽烙、關(guān)節(jié)后軟骨和5軟骨的周骨化略有延遲，尤其是在頸骨軟骨声搁，而鰓下軟骨的面體骨化不受影響（圖5A）黑竞。

為了區(qū)分軟骨周圍成骨的差異是否由軟骨形成異常引起，我們使用茜素紅活染色（圖5D）和雙轉(zhuǎn)基因系Tg（osterix:EGFP）疏旨；Tg（col2a1a：mCherry）（圖5E）在6dpf很魂，我們發(fā)現(xiàn)軟骨源性發(fā)育不良的嚴重程度與軟骨周骨化缺陷的程度一致。角骨軟骨畸形和軟骨周圍骨化缺陷最為嚴重檐涝，而鰓下軟骨發(fā)育正常遏匆，軟骨周圍骨化正常甚至略有加速（圖5D，E）谁榜。在9 dpf時幅聘，與野生型斑馬魚相比，突變體的軟骨周骨化沒有明顯延遲（圖5C）窃植，相反帝蒿，鰓下軟骨軟骨周骨化增強，礦化骨環(huán)有更多的成骨細胞（圖5A）巷怜。同樣葛超，茜素紅染色也觀察到類似的結(jié)果(補充圖。S4A)延塑。以上結(jié)果表明巩掺，rmrp突變體的延遲軟骨內(nèi)成骨是繼發(fā)于軟骨發(fā)育不良，當軟骨形成正常發(fā)展時页畦，軟骨內(nèi)成骨可能會加速胖替。

此外，我們還使用茜素紅染色法檢測了椎體的礦化情況（圖5F）。從5 dpf到9 dpf独令，我們發(fā)現(xiàn)rmrp突變體中椎體的礦化速度加快端朵，礦化椎體的數(shù)量顯著增加（圖5F，G）燃箭。茜素紅染色也觀察到類似的結(jié)果(補充圖冲呢。S4B).這些結(jié)果表明，rmrp突變促進了椎體骨化招狸。

rmrp基因敲除會影響腸道和顱內(nèi)血管的發(fā)育

CHH患者的一個標志性表型是胃腸道缺乏癥敬拓。這一臨床特征與先天性巨結(jié)腸樣疾病相似，即腸內(nèi)神經(jīng)元的缺乏導致腸蠕動和消化不良裙戏。因此乘凸，我們研究了腸道的發(fā)育過程。通過使用茜素紅染色累榜，我們發(fā)現(xiàn)突變體的腸道變小营勤，褶皺減少（圖5F）。腸道H&E染色顯示壹罚，WT斑馬魚的腸上皮細胞形成指狀腸絨毛葛作；而rmrp突變體的腸上皮細胞數(shù)量減少，腸絨毛缺失(補充圖 S5)猖凛。我們還使用標記血管內(nèi)皮細胞的Tg（flk1：EGFP）魚系檢測了rmrp突變體的顱內(nèi)血管的發(fā)育赂蠢。有趣的是，從3 dpf到8 dpf辨泳，突變體在顱血管發(fā)育中表現(xiàn)出顯著的異常(補充圖S6A)虱岂。利用Tg（col2a1a：mCherry）和Tg（flk1：EGFP）雙轉(zhuǎn)基因株系，我們發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)血管附著在軟骨表面漠吻，表現(xiàn)出與咽部軟骨發(fā)育不良相同的畸形模式(補充圖 S6B).這些數(shù)據(jù)表明量瓜，軟骨和血管的異常發(fā)育可能會相互影響司恳。

圖5 rmrp可及時調(diào)節(jié)骨骨化途乃。(A)WT斑馬魚和rmrp突變體在Tg（EGFP：EGFP）背景下的共聚焦成像，受精后6天用茜素紅活染色（dpf扔傅；上）和9dpf（下）耍共。(B)WT斑馬魚和rmrp突變體在6 dpf和9dpp、WT斑馬魚和rmrp突變體的n = 8胚胎周期周期的相對礦化面積的定量猎塞。(C)WT斑馬魚和rmrp突變體在9 dpf试读，n = 10處的角膜相對面周骨化區(qū)域的定量。(D)WT斑馬魚和rmrp突變體在Tg（col2a1a：EGFP）背景下的共聚焦成像荠耽，在6 dpf時用茜素紅活染色钩骇。箭頭表示周面骨化。(E)WT斑馬魚和rmrp突變體與Tg（col2a1a：mCherry）雙轉(zhuǎn)基因株系中6 dpf的共聚焦成像。箭頭表示軟骨骨環(huán)中的成骨細胞倘屹。(F)茜素紅活體染色银亲，從5 dpf到9 dpf。(G)WT斑馬魚和rmrp突變體從5 dpf到9 dpf的礦化椎體數(shù)量纽匙。

rmrp突變可抑制受影響組織的增殖并促進細胞凋亡

為調(diào)查rmrp突變體細胞增殖是否受阻务蝠，我們進行Edu合并試驗，在3dpf和WT相比烛缔，發(fā)現(xiàn)rmrp突變體中Edu陽性細胞的數(shù)量在頭部的咽和眼睛區(qū)域顯著減少（圖6A馏段，B）〖桑考慮到之前的研究表明rmrp突變可能改變周期蛋白依賴的細胞周期調(diào)控院喜，我們檢測了幾個細胞周期相關(guān)基因的表達，發(fā)現(xiàn)ccng1当窗、ccnd1和cdkn2a/b在rmrp突變中大幅增加（補充圖 S7A）够坐。

我們接下來驗證了rmrp突變體中的細胞凋亡是否受到影響。使用TUNEL實驗崖面，與WT相比元咙，我們檢測到在3 dpf時的突變體有更多的頭部凋亡細胞，包括咽部區(qū)域和眼睛（圖6C巫员，D）庶香。我們通過RT-qPCR對一組凋亡相關(guān)基因的表達水平進行了定量分析，發(fā)現(xiàn)在3 dpf時简识，rmrp突變體中tp53赶掖、mdm2和caspase8的水平大幅增加（補充圖 S7B）。原位雜交證實七扰，rmrp突變體的咽部奢赂、眼睛和腸道中tp53和mdm2水平較高（圖6E），陰性對照未顯示雜交信號（補充圖 S2B）颈走。我們的數(shù)據(jù)表明膳灶，rmrp缺失可能在咽弓、眼睛和腸道中觸發(fā)外部和內(nèi)在的凋亡途徑立由。

圖6 rmrp突變可抑制細胞增殖轧钓，促進細胞凋亡。(A) Edu檢測和Col2a1a的免疫熒光染色（綠色）顯示锐膜，受精后WT斑馬魚和突變體頭部區(qū)域3天（dpf）的細胞增殖減少毕箍。(B)WT斑馬魚和rmrp突變體(A)、n = 8胚胎各顯微鏡下Edu陽性細胞數(shù)量的定量道盏，***p < 0.001而柑。(C) TUNEL檢測顯示文捶，在3 dpf時，rmrp突變體的頭部區(qū)域有更多的凋亡細胞媒咳。(D)WT斑馬魚和rmrp突變體(C)拄轻、n = 8胚胎各顯微鏡下TUNEL陽性細胞數(shù)量的定量，***p < 0.001伟葫。(E)在3 dpf時恨搓，通過原位雜交檢測tp53（左）和mdm2（右）的表達水平。箭頭表示咽部軟骨筏养，箭頭表示腸斧抱。（WT斑馬魚，n = 30渐溶；rmrp突變體辉浦，n = 10）。A和C的比例尺為= 100μm茎辐，E為200μm宪郊。

rmrp突變上調(diào)典型的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路

典型的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路在軟骨發(fā)育和骨形成中起著重要作用。一些研究表明拖陆，Wnt信號參與了斑馬魚的顱面發(fā)育弛槐。據(jù)報道，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路增強了結(jié)腸癌細胞中rmrp的表達依啰。因此乎串，我們檢測了rmrp突變體和WT斑馬魚中積累的β-連環(huán)蛋白的水平。對4 dpf時的整個胚胎提取物進行免疫印跡檢測速警，結(jié)果顯示叹誉，rmrp突變體中激活的-β-連環(huán)蛋白顯著上調(diào)，而磷酸化的-β-連環(huán)蛋白沒有顯著變化（圖7A）闷旧。此外长豁，RT-qPCR結(jié)果顯示，在4 dpf時rmrp突變體與野生型斑馬魚相比忙灼，一組已知的Wnt/β-連環(huán)蛋白靶基因匠襟，包括ccnd1、axin2缀棍、c-myc和chordin的水平也顯著升高（圖7C）宅此。免疫熒光檢測顯示机错，rmrp突變體的角骨軟骨中Axin2水平升高（圖7B）爬范。此外，原位雜交顯示弱匪，rmrp突變體咽部區(qū)ccnd1水平也升高（圖7E）青瀑，陰性對照沒有雜交信號(補充圖 S2C)璧亮。這些結(jié)果表明，在rmrp突變體中斥难，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路表達上調(diào)枝嘶。此外，我們發(fā)現(xiàn)在rmrp突變體中哑诊，wnt5b和wnt2bb的RNA水平顯著升高群扶，而dvl2水平略有升高。相比之下镀裤，apc和csnk1e（它們編碼的蛋白形成β-連環(huán)蛋白破壞復合物）的水平均略有下降（圖7F）竞阐，但ctnnb1的RNA水平?jīng)]有變化（圖7D）。

這些結(jié)果表明暑劝，rmrp突變可能抑制了β-連環(huán)蛋白的降解骆莹，從而促進了Wnt/β-連環(huán)蛋白的信號通路轉(zhuǎn)導。

圖7 rmrp突變上調(diào)典型的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路担猛。(A)WT和突變斑馬魚受精后4天（dpf）蛋白提取物（dpf）檢測非磷酸化β-連環(huán)蛋白（激活的β-連環(huán)蛋白）和磷酸化β-連環(huán)蛋白幕垦，β-actin作為加載對照。(B)WT斑馬魚和突變體在4 dpf時咽部軟骨的Axin2和Col2a1a的雙免疫熒光染色傅联。白色箭頭表示角舌骨軟骨先改。RT-qPCR分析Wnt/β-連環(huán)蛋白靶基因ccnd1、軸蛋白2蒸走、c-myc和弦蛋白(C)的表達水平升高盏道，但ctnnb1的(D).（ns）無明顯變化(E)在受精后3天，通過原位雜交檢測ccnd1的表達水平（dpf）载碌。黑色箭頭表示咽部軟骨猜嘱。（WT斑馬魚，n = 30嫁艇；rmrp突變體朗伶，n = 10）。(F) RT-qPCR分析wnt5b步咪、wnt2bb论皆、dvl2、apc和csnk1e的表達水平猾漫，n3組獨立樣本点晴，*p < 0.05、***p < 0.001悯周，無顯著性（ns）粒督。比例尺=為50μm，E為200μm禽翼。

Wnt抑制部分減輕了rmrp突變體的軟骨發(fā)育不良和增加椎骨礦化

然后屠橄，我們詢問了Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的藥理抑制是否可以挽救由rmrp突變引起的軟骨生成發(fā)育不良和礦化失調(diào)族跛。我們使用了一種β-連環(huán)蛋白抑制劑XAV939，它通過刺激β-連環(huán)蛋白的降解來抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路锐墙。在咽弓軟骨從60 hpf到96 hpf的發(fā)育過程中礁哄，我們使用了10μM的XAV939或DMSO對照。我們發(fā)現(xiàn)溪北，與DMSO處理的突變體相比桐绒，XAV939處理的突變體的下頜凹陷在4 dpf時得到了緩解（圖8A）。共聚焦顯微鏡顯示之拨，XAV939處理的突變體部分減輕了軟骨生成發(fā)育不良掏膏，特別是角骨軟骨發(fā)育不良（圖8B）。XAV939處理的突變體舌骨角的角度和長度與野生型斑馬魚更接近（圖8C）敦锌。

此外馒疹，我們對10μM XAV939或DMSO對照處理4-6dpf，以研究它們對7 dpf骨骨化的影響乙墙。我們發(fā)現(xiàn)颖变，與DMSO處理的突變體相比，XAV939處理的突變體的下鰓軟骨礦化骨環(huán)處的成骨細胞數(shù)量減少（圖8D）听想，表明促進軟骨膜骨化加速部分緩解腥刹。此外，與DMSO處理的突變體相比汉买，XAV939處理的突變體的礦化椎體數(shù)量明顯減少衔峰，與WT斑馬魚相似（圖8E，F(xiàn)）蛙粘。然而垫卤，在XAV939處理的突變體中，顱骨延遲的膜內(nèi)骨礦化并沒有得到挽救（圖8D）出牧。這些結(jié)果表明穴肘，rmrp突變體的軟骨發(fā)育不良和椎骨礦化增加與Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路上調(diào)有關(guān)，而抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路可部分緩解舔痕。

圖8 抑制Wnt可以部分緩解rmrp突變體的軟骨發(fā)育不良和增加椎骨礦化评抚。(A)在野生型斑馬魚和rmrp突變體中，用10μM XAV939（右）或DMSO（左）處理受精后60小時（hpf）到96 hpf后伯复，在受精后4天通過光鏡檢測到頭部區(qū)域的側(cè)視圖（dpf）慨代。箭頭表示，在xav939處理的突變體中啸如，凹陷的下頜部分獲救侍匙。(B)共聚焦圖像顯示，在10μM XAV939轉(zhuǎn)基因Tg（col2a1a：EGFP）背景（下）或DMSO（上）處理60 hpf到96 hpf后组底，WT斑馬魚和rmrp突變體的4 dpf丈积。Ch =角骨軟骨。(C)(B).中野生型斑馬魚和rmrp突變體的宮頸長度定量n = 5.(D)在10μM XAV939（右）或DMSO（左）處理4 dpf后债鸡，Tg（EGFP）轉(zhuǎn)基因背景下7 dpf的顱骨成骨細胞側(cè)視圖江滨。白色箭頭表示鰓下軟骨骨項圈中的成骨細胞。(E)從4 dpf到XAV939（下）或DMSO（上）處理7 dpf后厌均，茜素紅活染色7 dpf椎骨礦化側(cè)視圖唬滑。(F)量化(E)中礦化椎體的數(shù)量，n = 10棺弊。取值為平均±標準差晶密。**p < 0.05，***p < 0.001模她，無顯著性（ns）稻艰。A、D侈净、E的比例尺為= 200μm尊勿，B為50μm。

討論

在本研究中畜侦，我們使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)元扔，通過敲除斑馬魚中的RMRP同源物rmrp，生成了CHH的斑馬魚模型旋膳。我們發(fā)現(xiàn)rmrp突變體顯示軟骨生成破壞和骨骨化澎语，這在一定程度上與CHH患者的臨床表現(xiàn)相似。我們進一步發(fā)現(xiàn)验懊，其分子機制和細胞機制可能與細胞周期和凋亡相關(guān)基因表達失調(diào)所引起的抑制細胞增殖和促進細胞凋亡有關(guān)擅羞。此外，我們還發(fā)現(xiàn)rmrp突變上調(diào)典型的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號义图，抑制Wnt信號可以部分緩解rmrp突變體的軟骨發(fā)育不良和椎骨礦化增加祟滴。

侏儒癥和短而增厚的長骨伴扇形和中期增寬是CHH患者的標志。我們試圖通過檢測rmrp KO斑馬魚的軟骨形成來揭示CHH患者軟骨發(fā)育不良的機制歌溉。斑馬魚沒有四肢和長骨垄懂；然而，斑馬魚的顱面骨是通過軟骨內(nèi)成骨化和膜內(nèi)骨化形成的痛垛，就像人類一樣草慧。舌角骨是由類似于哺乳動物骨的軟骨內(nèi)成骨形成的，它們也具有相同的骨骺和骨骺生長板組成匙头。先前的研究表明漫谷，導致人類軟骨發(fā)育不良的基因突變可導致顱面骨的軟骨發(fā)育不良，如斑馬魚的角頜骨軟骨蹂析。因此舔示，我們研究了顱面發(fā)育碟婆，發(fā)現(xiàn)了rmrp突變體的咽弓軟骨發(fā)育缺陷。特別是角骨長度減少惕稻，頸骨弓凹陷和遲鈍竖共。此外，在角骨中俺祠，軟骨細胞以多層細胞分布公给，在rmrp突變體中分布，排列無序蜘渣，而WT軟骨細胞像硬幣一樣排列成一個細胞寬的行淌铐。這些結(jié)果與觀察到的CHH患者柱狀組織缺陷和中期增寬相一致。

通常蔫缸，CHH患者的骨骺骨化中心在影像學上表現(xiàn)正常腿准，骨密度基本正常。然而拾碌，一些CHH患者表現(xiàn)為長骨延遲骨化和小梁形成释涛，或隨著骨齡的增加股骨骨化或手骨化晚期。CHH患者的可變骨化確實令人困惑倦沧，目前尚不清楚它是否只存在于嚴重受影響的患者和繼發(fā)于軟骨發(fā)育不良唇撬。我們在斑馬魚中的研究表明，rmrp突變體的軟骨內(nèi)成骨可能因軟骨形成缺陷的程度而不同展融。rmrp突變體的宮頸軟骨顯示嚴重的軟骨發(fā)育不良和延遲軟骨內(nèi)骨化窖认，而鰓下軟骨相對正常，軟骨周骨化告希，礦化骨環(huán)處有更多的成骨細胞扑浸。此外，rmrp突變抑制了顱骨的膜內(nèi)骨化燕偶，同時顯著促進了椎骨的礦化喝噪。這些數(shù)據(jù)表明，rmrp調(diào)控斑馬魚早期發(fā)育階段的骨化或礦化指么，雖然我們需要在未來的工作中使用一種新的策略來評估rmrp突變后成年期的骨化和礦化變化酝惧。

先前來自酵母的研究表明，rmrp突變體在有絲分裂結(jié)束時通過降解細胞周期蛋白B2 mRNA來延緩細胞周期的進程伯诬。類似地晚唇，一項來自哺乳動物細胞的體外研究表明，RMRP突變通過損害核糖體組裝和改變細胞周期蛋白依賴的細胞周期調(diào)控盗似，導致細胞生長下降哩陕。因此，我們檢測了rmrp突變體在受影響組織中的增殖變化，發(fā)現(xiàn)Edu標記細胞減少悍及。此外闽瓢，我們發(fā)現(xiàn)在rmrp突變體中，ccng1心赶、ccnd1和cdkn2a/b的表達顯著增加扣讼。這些結(jié)果表明，斑馬魚中rmrp突變體的細胞增殖下降可能是這些周期相關(guān)基因表達變化的結(jié)果园担。由于酵母RNase MRP的RNA或蛋白質(zhì)成分的基因缺失已經(jīng)證明RNase MRP復合物對細胞生存能力是至關(guān)重要的届谈。我們發(fā)現(xiàn)rmrp突變體的細胞凋亡增加枯夜，并且一組凋亡相關(guān)基因如tp53弯汰、mdm2和caspase8的表達水平大幅增加。這些數(shù)據(jù)表明湖雹，rmrp缺失可能觸發(fā)咽弓咏闪、眼睛和腸道內(nèi)的內(nèi)在或外在的凋亡途徑。事實上摔吏，E3泛素連接酶MDM2是p53蛋白的負調(diào)控因子鸽嫂。Mdm2已被鑒定為p53相互作用蛋白，可抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性征讲，促進p53的快速降解据某。我們一致發(fā)現(xiàn)，在rmrp突變體中诗箍，少數(shù)tp53轉(zhuǎn)錄本顯著減少（數(shù)據(jù)未顯示）癣籽。有趣的是，之前的研究發(fā)現(xiàn)滤祖，細胞周期蛋白G1具有生長抑制活性筷狼，在體內(nèi)外均能與Mdm2和p53相互作用。這些結(jié)果表明匠童，rmrp可能通過調(diào)控細胞周期和凋亡相關(guān)分子的表達控制細胞的增殖和凋亡埂材，但rmrp如何調(diào)控這些基因的表達，以及這些基因如何協(xié)同調(diào)控細胞增殖和凋亡汤求，還需要更多的研究俏险。

為了探索rmrp調(diào)控骨軟骨形成的機制，我們檢測了參與骨骼發(fā)育的幾個信號通路扬绪，發(fā)現(xiàn)典型的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路上調(diào)寡喝。藥理抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白可部分挽救軟骨發(fā)育不良，減輕椎骨礦化程度的增加勒奇。典型的Wnt信號在骨生物學中得到了廣泛的研究预鬓，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號在骨骼形成過程中間充質(zhì)前體細胞分化為軟骨細胞或成骨細胞譜系具有重要作用。異常典型Wnt信號通路增強骨化并抑制軟骨細胞的形成，而在成骨細胞前體細胞中穩(wěn)定β-連環(huán)蛋白信號通路會導致分泌成骨細胞的骨基質(zhì)的過早分化格二，但β-連環(huán)蛋白在早期頭部間充質(zhì)中的穩(wěn)定會導致顱骨的丟失劈彪。同樣，我們發(fā)現(xiàn)rmrp突變抑制了顱骨的膜內(nèi)骨化顶猜，這可能是由于Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的增加影響了間充質(zhì)細胞向成骨細胞的分化而引起的沧奴。此外，rmrp KO促進鰓下軟骨的軟骨周礦化和軟骨周-成骨細胞分化长窄，并加速椎骨礦化滔吠，這與rmrp突變斑馬魚中Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的增加相一致。

先前的研究表明挠日，WNT-3A能夠通過激活β-連環(huán)蛋白來驅(qū)動腫瘤中的RMRP轉(zhuǎn)錄疮绷。最近，Mandy和同事還發(fā)現(xiàn)嚣潜，WNT-3A和WNT-5A可以使成軟骨細胞系中的Rmrp啟動子活性分別增加45%和26%冬骚。有趣的是，在rmrp突變體中懂算，我們發(fā)現(xiàn)wnt5b和wnt2bb的RNA水平隨著Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的上調(diào)而升高只冻。一種可能的解釋是，Wnt RNA水平的升高可能是由于rmrp的減少引起的反饋機制计技，而Wnt的增加將進一步上調(diào)Wnt信號通路喜德。我們還發(fā)現(xiàn)，形成β-連環(huán)蛋白破壞復合物的編碼蛋白apc和csnk1e的RNA水平略有下降垮媒，提示rmrp突變可能導致β-連環(huán)蛋白的降解受到抑制舍悯。然而，lncRNA rmrp如何穩(wěn)定β-連環(huán)蛋白并上調(diào)Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路仍不明確涣澡，需要進一步的研究贱呐。

CHH患者有一些骨骼外的表現(xiàn)，如胃腸道功能障礙入桂、免疫缺陷奄薇、貧血和惡性腫瘤的風險增加。我們發(fā)現(xiàn)抗愁，rmrp突變體的腸道上皮細胞數(shù)量和腸絨毛數(shù)量減少馁蒂，腸道變小，提示腸道發(fā)育缺陷或變性蜘腌。由于CHH的胃腸道缺乏可能與腸道內(nèi)腸道神經(jīng)元的缺乏有關(guān)沫屡，因此建議進一步研究腸道表型，包括檢測rmrp突變體中的腸道神經(jīng)元撮珠。

我們研究的一個局限性是沮脖，rmrp?/?突變體在12 dpf到14 dpf內(nèi)死亡，因此，我們只能分析早期發(fā)育階段的表型勺届。為了更好地模擬CHH患者的表型驶俊，進一步研究CHH的發(fā)病機制，我們可以建立具有相對較低的rmrp功能障礙水平的斑馬魚突變體免姿，或注射rmrp mRNA來挽救早期發(fā)育缺陷的表型饼酿，將突變體提高到成年∨卟玻總之故俐，我們建立了一個類似于CHH患者軟骨發(fā)育不良和其他表型的CHH斑馬魚模型，并研究了rmrp突變導致表型的潛在細胞和分子機制紊婉。我們提供的證據(jù)表明药版，rmrp突變體上調(diào)了典型的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路，而抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路可以部分緩解rmrp突變體的表型肩榕。我們的斑馬魚CHH模型將有助于更好地理解其潛在的發(fā)病機制刚陡，從而有助于探索CHH可能的治療途徑惩妇。此外株汉，它也可能有助于提供更廣泛的對其他表型重疊核糖體病的治療的見解。

基金：本研究由國家自然科學基金資助項目（No. 81830075,81772306）支持歌殃。

原文：Sun X, Zhang R, Liu M, Chen H, Chen L, Luo F, Zhang D, Huang J, Li F, Ni Z, Qi H, Su N, Jin M, Yang J, Tan Q, Du X, Chen B, Huang H, Chen S, Yin L, Xu X, Deng C, Luo L, Xie Y, Chen L. Rmrp Mutation Disrupts Chondrogenesis and Bone Ossification in Zebrafish Model of Cartilage-Hair Hypoplasia via Enhanced Wnt/β-Catenin Signaling. J Bone Miner Res. 2019 Nov;34(11):2101-2116. doi: 10.1002/jbmr.3820. Epub 2019 Sep 4. PMID: 31237961.

詳細網(wǎng)址：https://asbmr.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jbmr.3820