雜志：International Journal of Molecular Sciences
通訊作者單位：復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院兒童保健科县好，國家兒童醫(yī)學(xué)中心围橡，上海市萬源路 399號，中國缕贡，201102
摘要
對感覺輸入的過度反應(yīng)是自閉癥譜系障礙(ASD)的一種常見且使人衰弱的癥狀翁授，但潛在的神經(jīng)異常尚不清楚。在我們的臨床隊列篩查中晾咪，3例攜帶新發(fā)SHANK2突變的患者中有2例也表現(xiàn)出對視覺收擦、聽覺和觸覺刺激的高敏感性，因此我們通過生成穩(wěn)定的shank2b缺陷斑馬魚模型(shank2b?/?)來研究SHANK2缺陷是否會導(dǎo)致感覺異常和其他ASD樣表型谍倦。成年shank2b?/?斑馬魚表現(xiàn)出社會偏好和親屬偏好降低塞赂，行為刻板印象增強，而幼魚在黑暗到光明的過渡過程中表現(xiàn)出對聽覺噪音的超敏感和異常多動昼蛀。因此宴猾，該模型概括了以往許多遺傳ASD模型的核心發(fā)育和行為表型圆存。γ-氨基丁酸(GABA)受體亞基mRNA和蛋白的表達水平也在shank2b?/?斑馬魚中降低，這些動物對藥物誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作表現(xiàn)出更大的敏感性仇哆。我們的研究結(jié)果表明辽剧，GABAergic功能障礙是ASD感覺超反應(yīng)的主要原因，并強調(diào)了在早期神經(jīng)發(fā)育過程中針對感覺處理中斷進行干預(yù)的必要性税产，以防止疾病進展。關(guān)鍵詞：斑馬魚偷崩；自閉癥譜系障礙辟拷；shank2；行為阐斜；GABAR衫冻。
介紹
自閉癥譜系障礙(ASD)是神經(jīng)發(fā)育綜合征的總稱，其特征是社交互動和溝通缺陷谒出、刻板重復(fù)行為隅俘、興趣限制和各種感覺異常。ASD的非典型感覺處理可能表現(xiàn)為對環(huán)境的特定感官方面的超敏笤喳、低敏或異常興趣为居，這種異常在高達90%的自閉癥個體中都存在。此外杀狡，這些異常影響每一種感覺形態(tài)(視覺蒙畴、嗅覺、味覺呜象、聽覺膳凝、本體感覺、觸覺和平衡)恭陡。非典型的視覺處理已經(jīng)在人類嬰兒中被觀察到蹬音，這些嬰兒早在6個月大的時候就患上了自閉癥，這比核心自閉癥表型(如聯(lián)合注意力障礙)(14-18個月)要早得多休玩。此外著淆，先前的研究已經(jīng)報道了自閉癥兒童關(guān)節(jié)注意力較低與缺乏對社會和非社會感官刺激的定向之間的聯(lián)系。嬰兒的感覺癥狀不僅先于而且預(yù)示著兒童時期的社交缺陷哥捕、重復(fù)行為和最終的ASD診斷牧抽。因此，感知癥狀可以作為ASD的早期診斷生物標(biāo)志物遥赚，為潛在的病理生物學(xué)提供線索扬舒，并為治療干預(yù)提供新的靶點。許多基因都與自閉癥有關(guān)凫佛，包括那些調(diào)節(jié)突觸傳遞的基因讲坎。其中包括SHANK2孕惜，它在谷氨酸能突觸上編碼一種主要的支架蛋白(SHANK2/ProSAP1)，這對突觸后密度(PSD)的組裝和完整性至關(guān)重要晨炕。先前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了18例神經(jīng)發(fā)育障礙患者攜帶人類SHANK2基因的新生變異衫画，我們在臨床篩查隊列中發(fā)現(xiàn)了另外3名患者存在SHANK2基因的新變異體。此外瓮栗，其中2例患者表現(xiàn)出智力缺陷和對感官刺激的高度敏感性削罩，如對突然聲音的過度反射反應(yīng)和對外部視覺刺激的被動尋求。與臨床觀察一致费奸，Shank2基因敲除小鼠也表現(xiàn)出對疼痛刺激的低敏感性弥激。因此，我們推測自閉癥患者的SHANK2功能喪失可能與異常的感覺加工有關(guān)愿阐，特別是聽覺和視覺通路微服。然而，確切的分子機制仍有待闡明缨历。這些ASD相關(guān)的感覺缺陷和核心癥狀行為歸因于抑制性γ-氨基丁酸(GABA)信號缺乏導(dǎo)致興奮性和抑制性神經(jīng)傳遞不平衡以蕴。自閉癥患者GABAergic功能障礙的證據(jù)包括:自閉癥患者死后腦組織GABA受體亞單位表達不足，自閉癥與GABAergic基因等位變異之間的聯(lián)系辛孵，以及在許多其他不同的自閉癥動物模型中GABAergic傳播缺陷丛肮。此外，最近的一項人類研究發(fā)現(xiàn)觉吭，自閉癥患者缺乏雙眼競爭腾供，這依賴于皮質(zhì)GABAergic信號夭坪。也有證據(jù)表明自閉癥的觸覺和聽覺處理缺陷與GABAergic功能障礙有關(guān)恋追。總的來說锯梁，這些發(fā)現(xiàn)表明徙硅，GABAergic信號的改變可能導(dǎo)致自閉癥患者的異常感覺知覺榜聂。斑馬魚是研究包括ASD在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病在遺傳、發(fā)育和行為水平上的有力工具嗓蘑。在這里须肆，我們報道了一個shank2突變斑馬魚系的產(chǎn)生，這為shank2缺陷在ASD的感覺處理和行為異常中的作用提供了強有力的支持桩皿。此外豌汇，我們報道這些動物表現(xiàn)出GABA受體在大腦中的表達減少，對藥物引起的癲癇發(fā)作的敏感性增強泄隔，表明GABAergic信號傳導(dǎo)不足拒贱。
養(yǎng)魚及飼養(yǎng)
Tubingen(Tu)株斑馬魚飼養(yǎng)在中國上海復(fù)旦大學(xué)兒童醫(yī)院斑馬魚研究所。幼魚和成魚都在28.5℃的再循環(huán)系統(tǒng)中保持在14小時/10小時的晝夜節(jié)律周期下。所有動物實驗均按照《實驗動物護理與使用指導(dǎo)原則》進行逻澳，并獲得復(fù)旦大學(xué)兒童醫(yī)院機構(gòu)動物護理委員會的批準(zhǔn)闸天。
利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)培養(yǎng)shank2b缺陷斑馬魚
通過搜索NCBI數(shù)據(jù)庫(基因ID: shank2b NC_007136.7)確定斑馬魚shank2b基因和外顯子/內(nèi)含子邊界，并使用先前報道的CRISPR/Cas9編輯產(chǎn)生shank2b突變斜做。shank2b的位點特異性單導(dǎo)RNA (sgRNA)被設(shè)計為針對第10外顯子序列5'-GGATCGGAGCAGCACTCGCG-3'苞氮，并使用MAXIscript?T7試劑盒(AM1314M, Invitrogen, Waltham, MA, USA)通過體外轉(zhuǎn)錄合成。然后用微型注射器將150:600 pg的sgRNA: cas9核酸酶(En Gen?spy cas9 NLS #M0646, New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)注射到單細(xì)胞期受精的WT斑馬魚胚胎(F0)中瓤逼。注射后的胚胎培養(yǎng)72 h笼吟，然后制備基因組DNA，使用補充表S1和Sanger測序中列出的引物檢查誘變效率霸旗。然后分析鑒定出的突變赞厕，尋找可用于基因分型的獨特限制性內(nèi)切酶消化位點。通過與WT斑馬魚的一系列異交繁殖后代定硝，并對每一代進行基因分型。最終毫目，將這些動物進行雜交以獲得純合子缺陷shank2b?/?突變體蔬啡。
RT-qPCR
通過RT-qPCR分析胚胎在24hpf、48hpf镀虐、3dpf和5dpf時基因表達的變化箱蟆。所有的分析包括三個或四個獨立的胚胎池，每個胚胎池25個胚胎刮便。采集受精后3周的幼魚和受精后2個月的成魚腦(3個獨立腦池空猜，每池10尾)。采集成年雄性斑馬魚的大腦恨旱、心臟辈毯、肝-膽-脾、皮膚-肌肉和精索組織搜贤，以及成年雌性斑馬魚的卵巢組織(每種組織類型3個池谆沃，每個池5條魚)，并在干冰上速凍仪芒。使用MiniBEST通用RNA提取試劑盒(編號9767,Takara, Japan)按照制造商的方案從采集的組織和整個胚胎中提取總RNA唁影，并按照制造商的說明使用帶有g(shù)DNA橡皮(Perfect Real Time) (RR047A, Takara, Japan)的primer - script?RT試劑試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用Applied Biosystems?7500系統(tǒng)(Bio-Rad掂名，美國)和TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (RR820A, Takara据沈，日本)進行RT-qPCR，根據(jù)制造商的方案估計shank2b, shank2a和GABA受體亞基的mRNA表達水平饺蔑。采用delta CT法將表達水平歸一化為Rpl13α作為內(nèi)控锌介。RT-qPCR引物序列見補充表S1。所有的測量都是在至少三個獨立采集的組織池或整個胚胎上進行的膀钠。
WB
HUABIO利用兩種蛋白共享的肽抗原(CRSLSMPDTSEDIPP-amide掏湾，對應(yīng)shank2的860 ~ 873個氨基酸)生成了一種定制抗體識別斑馬魚shank2a和shank2b (RB1661)裹虫。對于Western blotting，從4.5 mpf WT和shank2b?/?斑馬魚的大腦中分離總蛋白融击，通過SDS-PAGE(每凝膠道50μg)分離筑公，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%牛血清白蛋白或7%脫脂奶粉在室溫下封閉膜2小時尊浪，用抗GABARα親和純化的一抗(Abcam, ab211131, 1:1000)在4℃下孵育過夜匣屡，用含有0.1% tbn -20 (TBST)的TBS洗滌，用辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗(1:5000)在室溫下孵育1小時拇涤。在TBST中洗滌三次后捣作，用ECL試劑(BeyoECL Plus, P0018M)孵育，并暴露于柯達x射線膠片(Tanon 5200)鹅士。通過ImageJ軟件(NIH, Bethesda, MD, USA)分析蛋白質(zhì)的灰度值券躁，并歸一化為GAPDH(1:5000)作為上膠對照。
幼魚對光和黑暗的反應(yīng)
使用Zebrabox系統(tǒng)(ViewPoint Life Sciences, Lyons,France)將7英尺高的斑馬魚幼魚單獨放置在24孔板的孔中掉盅，對活動進行視頻記錄也拜。采集視頻前，給每只幼魚45 min適應(yīng)光照環(huán)境趾痘。隨后慢哈，將幼蟲暴露在5分鐘的連續(xù)照明下，然后進行一個暗/光循環(huán)(5分鐘暗和5分鐘明永票，圖2K)卵贱。光照期光照強度為100%，暗期光照強度為0%侣集。使用視點跟蹤系統(tǒng)和定制軟件每30秒記錄一次行駛的時間和距離键俱。為了進行分析，我們在每口井的中心畫一個圓圈世分，將井劃分為等面積的內(nèi)方妖、外區(qū)域(圖2K)，并將其定義為：幼魚趨觸性=在中心區(qū)域移動的距離/在整個區(qū)域移動的距離在13 dpf時收集野生型和shank2b?/?幼魚罚攀，按照先前發(fā)表的方法評估ASR党觅。簡單地說，將幼蟲單獨放置在24孔板的孔中斋泄，并在配備紅外照明器的斑馬箱內(nèi)暴露于寬帶噪聲中杯瞻，以便在黑暗中成像。寬帶噪聲是由計算機產(chǎn)生的炫掐，并通過放置在室內(nèi)但沒有物理連接的兩個商用揚聲器播放魁莉。視頻片段以每秒25幀(fps)的速度拍攝，并分成1-s的時間窗來評估ASR。經(jīng)過60分鐘的適應(yīng)期后旗唁，斑馬魚在三個單獨的ASR實驗中進行監(jiān)測畦浓，其中包括5分鐘的環(huán)境聲音調(diào)節(jié)和15秒的突然大聲噪音刺激(圖3I)。將各組在每次突然聲音暴露前1分鐘和15秒內(nèi)的活動計數(shù)量化检疫，并根據(jù)以下公式計算ASR:ASR測試中的活動變化=15s噪音階段的平均活動(后)- 60s噪音前(前)的平均活動
視覺運動行為測驗
將13 dpf的幼魚單獨移栽到24孔板的孔中讶请，分析從光到暗和從暗到光的轉(zhuǎn)換過程中的視覺運動行為。簡而言之屎媳，視頻采集和跟蹤的規(guī)格與ASR試驗中的規(guī)格相同夺溢。為了分析明暗轉(zhuǎn)換期間的行為變化，將魚在連續(xù)最大白光照射下適應(yīng)觀察室1小時(適應(yīng)階段)烛谊。然后风响，進行3次熄燈周期(5分鐘照明，隨后是黑暗)(補充圖S3A)丹禀。為了分析暗光轉(zhuǎn)換過程中的行為變化状勤，我們將魚在黑暗的觀察室中馴化了1小時(適應(yīng)期)。然后双泪，進行3次光照循環(huán)(黑暗5分鐘荧降，光照15秒)(圖3A)。根據(jù)以下公式分析WT和shank2b突變體的活性變化:活性變化(從亮到暗的轉(zhuǎn)變)=暗后15 s檢測到的活性?光照前60 s檢測到的活性活動變化(暗轉(zhuǎn)亮)=光照后15 s檢測到的活動?光照前60 s檢測到的活動為了評估行為改變和癲癇易感性作為E/I失衡的指標(biāo)攒读，我們測量了9只dpf幼魚對GABAA受體拮抗劑PTZ的劑量反應(yīng)。野生型和shank2b?/?幼魚分別放置在24孔板的孔中辛友，其中含有標(biāo)準(zhǔn)胚水和不同濃度的PTZ (P6500, Sigma-Aldrich, Zwijndrecht薄扁，荷蘭)預(yù)溶解于蒸餾水中。簡單地說废累，建立了四個處理組:wt-標(biāo)準(zhǔn)水邓梅、WT-PTZ、shank2b-/-標(biāo)準(zhǔn)水和shank2b-/- PTZ邑滨。將PTZ先用蒸餾水溶解日缨，再用亞甲基藍稀釋體系水(0.15 mg/L亞甲基藍、8.01 mg/L NaCl掖看、5.04 mg/L KCl匣距、5.50 mg/L Na2HPO4、0.44 mg/L KH2PO4哎壳、1.30 mg/L CaCl2毅待、1.00 mg/L MgSO4和4.20 mg/L NaHCO3)溶解，得到工作溶液归榕。隨后尸红，將500μL PTZ工作溶液快速加入每孔500μL標(biāo)準(zhǔn)蛋水中，使最終體積達到1 mL/孔，含有1,2.5,5或7.5 mM PTZ外里。然后將盤子放在一個定制改造的斑馬魚箱中怎爵，以記錄斑馬魚幼魚活動的視頻。經(jīng)過5分鐘的光照適應(yīng)期后盅蝗，記錄45分鐘的自發(fā)活動鳖链。然后將動物暴露在一個10分鐘的光-暗循環(huán)中(5分鐘光照后5分鐘黑暗)，以檢查PTZ影響下對光照條件變化的反應(yīng)风科。通過比較從亮到暗轉(zhuǎn)換前后一分鐘內(nèi)所走的距離來分析反應(yīng)撒轮。包括馴化期在內(nèi)，每次試驗共60 min(補充圖S4A)贼穆。我們使用了一種新的行為測試來確定7.5 mM PTZ是否在WT和9 dpf突變魚中引起了最大的差異反應(yīng)题山，因為它在shank2b突變體中引起了異常活性故痊。簡而言之顶瞳，將9 dpf的shank2b?/?和WT幼魚分別移栽到含有1ml標(biāo)準(zhǔn)胚水的24孔板的孔中，并使用上述范例記錄活性愕秫。隨后慨菱，去除500μL蛋水，將500μL蛋水中的PTZ加入到孔中戴甩，得到最終的PTZ濃度為7.5 mM符喝。我們使用重復(fù)的光暗激發(fā)實驗來誘導(dǎo)PTZ誘導(dǎo)的反應(yīng)(圖4C)。通過將每個WT和shank2b突變魚的ptz后活性歸一化到基線來分析反應(yīng)甜孤。
曠場試驗
成年斑馬魚的運動活動在2-4 mpf下進行了適應(yīng)性開闊場范式測試(圖2H)协饲。視頻是在一個30 × 30 × 30厘米的不透明水箱中拍攝的，水箱中裝滿了系統(tǒng)水缴川。每只雄性斑馬魚在30分鐘的記錄期前在水箱中習(xí)慣5分鐘茉稠。每隔30秒使用Zebralab軟件(ViewPoint Life Sciences, Lissieu, Calvados, Lower Normandy Region, Lyons, France)分析一次運動時間和行進距離。對于刻板行為的分析把夸，不考慮基因型和治療史的實驗者每分鐘從魚軌跡的轉(zhuǎn)換視覺路線中對游泳模式進行評分而线，并統(tǒng)計小圈圈和繞墻兩種刻板游泳模式的頻率(圖2F)。成年斑馬魚的運動活動在2-4 mpf條件下在開放場模式下進行測試(圖2H)恋日。視頻是在一個30 × 30 × 30厘米的不透明水箱中拍攝的膀篮，水箱中裝滿了系統(tǒng)水，使用懸掛在上方的攝像機岂膳。在30分鐘的測試之前各拷，每只雄斑馬魚在水箱中習(xí)慣5分鐘。利用Zebralab軟件闷营，每隔30秒采集30分鐘錄像中的時間和距離進行分析烤黍。對于刻板行為知市，要求實驗者在雙盲控制下，對斑馬魚軌跡視覺路線每分鐘內(nèi)的游泳模式進行評分速蕊，并分別統(tǒng)計四種刻板游泳模式片段的次數(shù)嫂丙，即小圈圈和圍墻(圖2F)。趨近性(Thigmotaxis)是成年斑馬魚的一種經(jīng)過充分驗證的焦慮癥狀规哲，其評分為:趨近性=周邊區(qū)域移動的距離/整個區(qū)域移動的距離
三腔社會偏好測驗
社會偏好測試在一個透明的交配池(尺寸為21 × 11 × 7.5 cm)中進行跟啤，該交配池由兩個透明隔板分成三個腔室。將6只大小相似的雄性同種野鼠放入一個外室唉锌，而另一個外室不被占用(圖2A)隅肥。然后，受試者雄性斑馬魚(WT或突變體)在3.5 mpf下被放置在中間的腔室中袄简，并給予5分鐘自由進入整個裝置的時間腥放。錄制30分鐘的視頻。社會偏好行為被量化為與同類群體相鄰的距離或時間绿语。距離比為在與同形腔室相鄰的同形扇區(qū)內(nèi)走過的距離除以走過的總距離秃症，時間比為在與同形腔室相鄰的同形扇區(qū)內(nèi)度過的時間除以總試驗時間。為了進一步分析shank2b?/?斑馬魚的社會性吕粹，我們在同一水箱中進行了親緣偏好測試种柑。簡單地說，三只成年近親斑馬魚被放置在左外室匹耕，三只成年非近親斑馬魚被放置在右外室(圖2C)聚请。然后，將被試雄性斑馬魚(WT或突變體)置于3.5 mpf的中間室中稳其。社會偏好是通過社會偏好指數(shù)(SPI)來評估的驶赏，其中:SPI=在特定區(qū)域的距離或時間-在空區(qū)域或非親屬區(qū)域的距離或時間/兩段距離或時間
統(tǒng)計分析
所有數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism軟件(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)進行處理。采用單側(cè)t檢驗欢际、Mann-Whitney檢驗或配對t檢驗確定差異的顯著性。
結(jié)果
shank2缺陷斑馬魚的產(chǎn)生和形態(tài)計量學(xué)特征斑馬魚有兩個shank2類似物矾兜，在發(fā)育過程中表達损趋，并在成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中繼續(xù)豐富(補充圖S1A,B)。Shank2a和shank2b蛋白與人類蛋白的同源性分別為46.63%和60.58%(補充表S2)椅寺，并且包含相同的主要功能域(圖1A浑槽，補充表S3和S4)。此外返帕，來自多個物種的蛋白質(zhì)序列比較顯示桐玻，脊椎動物中SHANK2具有高度的進化保守性(補充圖S1C)。為了檢驗shank2的功能荆萤，我們使用CRISPR/Cas9靶向shank2b基因的第10個外顯子镊靴，產(chǎn)生了一個shank2b缺陷的斑馬魚品系铣卡，產(chǎn)生了一個14bp的缺失(圖1A，補充圖S1D)偏竟。由此產(chǎn)生的幀移位在外顯子13上產(chǎn)生一個過早的停止密碼子煮落，破壞下游PSD-95/Discs large/ZO-1 (PDZ)和無菌α基序(SAM)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(圖1A)。為了評估突變的shank2轉(zhuǎn)錄本是否受到無義介導(dǎo)的衰變的影響踊谋，我們檢測了斑馬魚大腦中shank2b mRNA的表達蝉仇。定量RT-PCR (RT-qPCR)顯示，與野生型(WT)相比殖蚕，純合突變體中shank2b mRNA的表達總體減少(圖1B)轿衔，而shank2a mRNA的表達在基因型之間沒有差異(圖1C)。與WTs相比睦疫，心臟害驹、肝-膽-脾、皮膚肌肉和性腺中shank2b mRNA的相對豐度也顯著降低笼痛，表明通過無義介導(dǎo)的衰變丟失了突變轉(zhuǎn)錄本(補充圖S1E)裙秋。我們觀察到WT和純合子shank2b?/?成魚的大體形態(tài)沒有差異(補充表S6和S7)。與WTs相比缨伊，受精后58 h (hpf)的shank2b?/?斑馬魚幼魚顯示出較小的頭部表型和較短的體長(補充圖S2A-D)摘刑，但幾個頭部測量參數(shù)與體長的比率是正常的(補充圖S2E,F)，并且成年突變魚的所有大腦區(qū)域都保存完好(補充圖S2G)刻坊。
圖1 利用CRISPR/Cas9技術(shù)生成斑馬魚shank2b突變體枷恕。(A)斑馬魚shank2b基因及蛋白結(jié)構(gòu)。蛋白結(jié)構(gòu)域(ANK谭胚，錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域;SH3, Src同源3域;PDZ徐块、PSD-95/光盤大/ZO-1域;SAM(無菌α基序結(jié)構(gòu)域)與相應(yīng)的外顯子對齊。CRISPR/Cas9基因編輯的斑馬魚shank2b基因組DNA第10外顯子靶位圖和14bp缺失突變斑馬魚野生型(WT)和shank2b突變蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測灾而。14 bp的缺失導(dǎo)致在第13外顯子上出現(xiàn)一個終止密碼子胡控，并在PDZ和SAM結(jié)構(gòu)域前過早終止。(B)與WT魚相比旁趟，在受精后4.5個月(mpf)昼激， shank2b?/?成年雄性斑馬魚大腦中shank2b mRNA的表達減少(WT n = 4, shank2b?/? n = 4， **** p < 0.0001锡搜，學(xué)生t檢驗)橙困。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。(C) WT和shank2b?/?成年(4.5 mpf)雄斑馬魚腦內(nèi)shank2a mRNA的表達不受影響(WT n = 3, shank2b?/? n = 4, ns, p = 0.1957, 學(xué)生t檢驗)耕餐。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示凡傅。
成年和幼體shank2b?/?斑馬魚的自閉癥樣行為
人類遺傳學(xué)研究表明SHANK2與自閉癥有關(guān)，之前的嚙齒動物實驗已經(jīng)報道了兩種不同的Shank2突變小鼠的自閉癥樣行為肠缔，以及Shank2?e24小鼠的社交和認(rèn)知行為受損夏跷。我們進行了一系列行為測試哼转，以評估shank2b?/?斑馬魚是否也表現(xiàn)出類似于人類SHANK2突變相關(guān)的ASD樣表型。我們首先使用三室測試來測試社會偏好行為拓春。如圖2B所示释簿，與WTs相比，中央室的成年shank2b?/?突變體在同一扇區(qū)中花費的時間更短硼莽，游的距離更短庶溶。此外，相對于另一個外腔的非親緣魚懂鸵，突變體對一個外腔中的親緣魚沒有表現(xiàn)出偏好(即偏螺，它們不會花更多的時間在毗鄰腔的區(qū)域游泳)，這與WTs的顯著親緣魚偏好形成鮮明對比(圖2D)匆光。此外套像，shank2b?/?斑馬魚比WT斑馬魚花更少的時間和更短的距離平行于同種魚(圖2E)。這些結(jié)果表明终息，shank2b缺乏導(dǎo)致斑馬魚的社會偏好低夺巩。同樣與ASD樣表型一致的是，成年shank2b?/?斑馬魚在開闊的環(huán)境中花更多的時間從事重復(fù)和刻板的游泳行為周崭，尤其是刻板的墻壁游泳(墻壁)(圖2G)柳譬。突變體也表現(xiàn)出更大的小圈游動頻率，盡管與WTs的差異沒有達到統(tǒng)計學(xué)意義(圖2G)续镇。成年shank2b?/?斑馬魚在開闊區(qū)域的整體運動活動也明顯大于WTs(圖2I)美澳。此外，成年shank2b?/?斑馬魚在新魚缸外圍區(qū)域行走的總距離比例(百分比)(thigmotaxis)顯著低于成年shank2b?/?斑馬魚(圖2J)摸航，表明它們有更高的特質(zhì)焦慮制跟。同樣，與年齡匹配的WTs相比酱虎，受精后7天(dpf)的斑馬魚幼蟲在水箱外圍相對于中心的游泳距離比例更大(圖2L,M)雨膨。與WT相比，shank2b?/?幼魚在暗光周期的第一個黑暗期(D1)的中心距離比顯著降低读串，在第一個光明期(L1)的中心距離比也顯著降低聊记。在連續(xù)光照下，7 dpf時爹土，shank2b?/?幼魚的趨動性也更強(L0)甥雕〔壬恚總的來說胀茵，這些發(fā)現(xiàn)表明shank2b缺陷會導(dǎo)致焦慮樣行為表型的增強。
圖2 shank2b?/?缺陷斑馬魚表現(xiàn)出自閉癥樣行為挟阻。(A)成年雄性斑馬魚社會偏好測試示意圖琼娘。(B)與WT相比峭弟，shank2b?/?斑馬魚對同種特異性的偏好顯著降低(時間比，** p = 0.0063;距離比脱拼，** p = 0.0057;WT, n = 12, shank2b?/?瞒瘸，n = 18，學(xué)生t檢驗)熄浓。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示情臭。(C)成年雄性斑馬魚親緣偏好測試示意圖。(D) shank2b?/?斑馬魚明顯傾向于花時間探索非親緣部分以與紅魚互動(n = 15赌蔑， * p = 0.0278俯在，配對t檢驗)，而WT斑馬魚更傾向于同種魚(n = 11娃惯， * p = 0.0498跷乐，配對t檢驗)。(E)此外趾浅，與WT斑馬魚相比愕提，突變體親緣偏好指數(shù)顯著降低(時間比，** p = 0.0018;距離比皿哨，*** p = 0.007;學(xué)生t檢驗)浅侨。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。(F)斑馬魚的刻板游泳模式表現(xiàn)為“小圈子”和“壁式”往史。(G)經(jīng)Mann-Whitney檢驗仗颈，4強條件下，shank2b?/?斑馬魚的“小圓”刻板行為頻次增加(p = 0.0941)椎例，“墻”刻板行為頻次顯著增加(* p = 0.0284)挨决。(H)露天試驗示意圖。(I)與WT斑馬魚相比订歪，shank2b突變體在2mpf下的速度(以本試驗30 min內(nèi)每秒移動的平均距離來量化)有所增加(WT n = 20, shank2b?/?= 22脖祈，**** p < 0.0001, Student’s t檢驗)。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示刷晋。(J)在thigmotaxis測試中盖高，個體WT和shank2b?/?斑馬魚在2 mpf下的代表性痕跡。shank2b?/?斑馬魚傾向于停留在中心區(qū)域眼虱，從而使thmomotaxis的距離比顯著降低(WT n = 18, shank2b?/?= 22喻奥，* p = 0.0104, Student’s t檢驗)。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示捏悬。(K)光暗實驗設(shè)置撞蚕，用于分析受精后7天(dpf)幼魚。(L)橫軸表示明暗交替的時間段过牙。縱軸表示在中心環(huán)中移動的距離的比率甥厦。(M)光照條件下纺铭，7 dpf下的shank2b?/?幼魚在L0期顯著減少，在L1期有減少的趨勢刀疙。結(jié)果表明舶赔，與WT幼魚相比，黑暗條件下(D1)也顯著降低谦秧。L0(左)竟纳，** p = 0.0036;D1(中)，** p = 0.0033;L1, p = 0.0663疚鲤。WT幼魚n = 36, shank2b?/?幼魚n = 34蚁袭。學(xué)生t檢驗。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示石咬。
shank2b?/?幼魚對視覺和聽覺刺激的異常反應(yīng)
據(jù)報道揩悄，SHANK2缺乏的人有不典型的感覺處理能力。為了確定shank2b幼魚是否表現(xiàn)出類似的感覺加工異常鬼悠，我們比較了突變體和WT幼魚對光-暗或暗-光轉(zhuǎn)換的視覺運動反應(yīng)(VMRs)和對高強度聲音刺激的驚嚇反應(yīng)删性。斑馬魚幼體通常在突然的光-暗過渡(黑暗刺激)下表現(xiàn)出顯著增強的活動(補充圖S3B-D)，而在突然的暗-光過渡(光刺激)下表現(xiàn)出短暫的活動減弱(圖3B-D)焕窝。然而蹬挺，當(dāng)暴露于突然的光刺激時，13dpf shank2b?/?幼魚的活性沒有顯著變化它掂，而不是預(yù)期的活性降低巴帮，一些動物在第二次或第三次黑暗到光明的轉(zhuǎn)變中表現(xiàn)出活性增加(圖3E-G)∨扒铮總體而言榕茧，WT和shank2b?/?突變體幼魚在從暗到光的轉(zhuǎn)變過程中存在顯著的活性差異(圖3H)。相比之下客给，兩種基因型都表現(xiàn)出對光-暗過渡的響應(yīng)活性增加(補充圖S3E-G)用押，并且在三個光-暗過渡周期中，基因型之間的這種變化幅度沒有顯著差異(補充圖S3H)靶剑。斑馬魚幼體通常會對突然的寬帶噪聲做出反應(yīng)蜻拨，其運動活動會急劇增加(圖3J,K)，這類似于在嚙齒動物和人類中觀察到的聲驚嚇反應(yīng)(ASR)桩引。此外缎讼，與其他動物的ASR一致，13 dpf的WT幼魚對重復(fù)的刺激表現(xiàn)出一定程度的習(xí)慣坑匠。然而血崭，與WTs相比，突變體在第一次刺激下表現(xiàn)出明顯增強的活性，表明基線ASR敏感性更高功氨，與WTs相比，突變體對第二次刺激的反應(yīng)更大(圖3M,N)手幢，表明習(xí)慣化程度降低捷凄。突變體對第三種刺激的ASR在數(shù)值上也大于WTs，但差異沒有達到統(tǒng)計學(xué)意義(圖3P)围来。
圖3 shank2b幼魚對視覺和聽覺刺激的異常反應(yīng)跺涤。(A) 13 dpf光刺激下斑馬魚幼體VMR運動活動跟蹤方案和行為設(shè)置。實驗包括連續(xù)黑暗條件下60 min的適應(yīng)期和20 min 45 s的三次VMR測試期监透。VMR實驗包括5分鐘的黑暗適應(yīng)和15秒的突然光刺激桶错。(B-D) 13 dpf時WT幼魚對突然光刺激的反應(yīng)正常下降(第一次光刺激，*** p = 0.0006;第二次光刺激胀蛮，**** p < 0.0001;第三光刺激院刁，**** p < 0.0001。n = 23，配對t檢驗)，(E-G)公壤，而shank2b?/?模型在暗-光過渡期間表現(xiàn)出完全不同的反應(yīng)感混，其特征是活動動態(tài)輕微增加，但無統(tǒng)計學(xué)意義(第一次光刺激脖镀，ns p = 0.3395;第二次光刺激，ns p = 0.7621;第三光刺激，ns p = 0.3446嗅蔬。N = 24，配對t檢驗)疾就。(H)柱狀圖比較WT和shank2b突變體在每次光刺激前1分鐘和后15秒檢測到的活性澜术。WT和shank2b幼魚從黑暗到光明的每一次轉(zhuǎn)變都誘導(dǎo)了活性變化的顯著差異(第一次光刺激，** p = 0.0029;第二次光刺激猬腰，**** p < 0.0001;第三光刺激瘪板，**** p < 0.0001。WT, n = 23, shank2b?/?n = 24, Student’s t檢驗)漆诽。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示侮攀。(1) 13 dpf條件下斑馬魚幼體AMR對大噪聲刺激的運動活動跟蹤方案和行為設(shè)置。試驗包括60 min的預(yù)試期和20 min 45 s的正試期厢拭，由3個AMR試驗組成兰英。AMR實驗包括5分鐘的環(huán)境聲調(diào)節(jié)和15秒的突然噪音刺激。(J-L) WT幼魚在13 dpf時供鸠，在兩次ASR試驗后畦贸，第三次噪聲刺激誘導(dǎo)的活性顯著增強(第一次噪聲刺激，ns p = 0.8148;第二噪聲刺激，ns p = 0.8905;第三噪聲刺激薄坏，** p = 0.0028趋厉。N = 20，配對t檢驗)胶坠。(M-O)第一次和第二次噪聲刺激誘導(dǎo)shank2b?/?幼魚活性顯著增加(第一次噪聲刺激君账，**** p < 0.0001;第二噪聲刺激，*** p = 0.0003;第三噪聲刺激沈善，ns, p = 0.1257乡数。N = 20，配對t檢驗)闻牡。(P)柱狀圖比較了WT和shank2b突變體每次大噪聲刺激前1分鐘和后15秒檢測到的活動净赴。同樣，在前兩次突然噪聲刺激下罩润，shank2b幼魚在13 dpf時的速度變化比WT幼魚更劇烈(第一次噪聲刺激玖翅，p = 0.0638;第二噪聲刺激，* p = 0.0369;第三個暗噪聲割以，ns p = 0.1645烧栋。WT n = 20, shank2b?/? n = 20, 學(xué)生t檢驗)。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示拳球。
shank2b?/?斑馬魚的GABAergic缺陷
ASD小鼠模型中的非典型感覺反應(yīng)與GABAergic中間神經(jīng)元發(fā)育的改變有關(guān)审姓。為了研究GABAergic神經(jīng)元發(fā)育或信號傳導(dǎo)的改變是否也發(fā)生在shank2b突變體中，我們比較了成年WT和shank2b?/?突變體之間GABA受體亞基的mRNA水平祝峻。事實上魔吐，RT-qPCR顯示，與WTs相比莱找，shank2b?/?斑馬魚中g(shù)abra1酬姆、gabra2a、gabra4奥溺、gabra5辞色、gabra6b、gabrb2a浮定、gabrg1和gabard的mRNA表達水平顯著降低(圖4A)相满。此外，突變體中GABAA受體α1蛋白的表達也顯著降低桦卒，提示GABAergic系統(tǒng)功能障礙立美，并伴隨興奮/抑制平衡的興奮性轉(zhuǎn)移(圖4B)。為了進一步證明這種轉(zhuǎn)變方灾，我們檢測了WT和突變體幼蟲對GABAA受體拮抗劑戊四唑(PTZ)誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作的易感性建蹄，PTZ廣泛用于嚙齒動物模型和斑馬魚的癲癇發(fā)作碌更。ptz誘發(fā)的癲癇發(fā)作表現(xiàn)為預(yù)期運動活動的抑制，隨著從亮到暗的突然轉(zhuǎn)變而增加洞慎。shank2b突變體對ptz誘導(dǎo)的行為改變表現(xiàn)出更大的敏感性痛单，這與GABA受體信號缺陷導(dǎo)致的興奮/抑制平衡的興奮性轉(zhuǎn)變相一致(補充圖S4B-D,H,I)。此外劲腿，與年齡匹配的WT幼魚相比旭绒，PTZ處理在9 dpf時誘導(dǎo)shank2b?/?幼蟲在明暗過渡期間的活性變化明顯更多(圖4D-G)∽焕猓總的來說，我們的研究結(jié)果提供了強有力的證據(jù)圆仔，表明神經(jīng)發(fā)育GABAergic信號缺陷是shank2b突變的ASD樣行為異常的基礎(chǔ)垃瞧。
圖4 shank2b突變體顯示GABAergic缺陷。(A) RT‐qPCR顯示GABAR亞基在成魚shank2b?/?腦組織中的表達水平發(fā)生改變坪郭。Gabra1个从， ** p = 0.003;Gabra2a， * p = 0.0394;Gabra3 ns p = 0.0993;Gabra3 ns p = 0.0660;Gabra4歪沃， * p = 0.0341;Gabra5嗦锐， * p = 0.0371;Gabrg2 ns p = 0.0730;Gabra6a ns p = 0.3488;Gabra6b， * p = 0.0138;Gabrb1 ns p = 0.1258;Gabrb2a沪曙， ** p = 0.0083;Gabrg1奕污， ** p = 0.005;gabard， * p = 0.0318;每組N = 3-4液走。學(xué)生t檢驗碳默。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。(B)成魚shank2b?/?腦組織中GABAA受體α1蛋白的Western blot分析缘眶。* p = 0.0313, WT n = 3,shank2b?/?n = 4, 學(xué)生t檢驗嘱根。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。(C)戊四唑(PTZ)處理行為實驗程序巷懈。(D)實驗由光暗轉(zhuǎn)換期間的基礎(chǔ)活性變化和7.5 mM ptz誘導(dǎo)的基礎(chǔ)活性變化組成该抒。(E) 9 dpf時WT幼魚在光暗轉(zhuǎn)換過程中表現(xiàn)出活力的動態(tài)增加(WT + v (vector) light vs. WT + v dark， ** p = 0.0022顶燕，;N = 17凑保，配對t檢驗)。值得注意的是涌攻，PTZ濃度為7.5 mM的WT幼魚在9 dpf時沒有導(dǎo)致活性下降(WT + PTZ光vs WT + PTZ暗愉适，ns, p = 0.3869, n = 17，配對t檢驗)癣漆。(F)然而维咸，7.5 mM PTZ誘導(dǎo)shank2b突變體活性下降(shank2b?/?+ V光vs. shank2b?/?+ V暗，*** p = 0.0005;shank2b?/?+ PTZ光vs. shank2b?/?+ PTZ暗，* p = 0.0157;N = 16癌蓖，配對t檢驗)瞬哼。(G)有趣的是,活動改變shank2b幼魚9 dpf 7.5毫米PTZ治療后多活動改變PTZ治療前(shank2b?/??基線與shank2b?/?+ PTZ, * * * p = 0.0006, n = 16,配對t檢驗),甚至大于WT幼蟲后的活動改變對待PTZ (WT + PTZ與shank2b?/?+ PTZ, * * p = 0.0096 WT + PTZ n = 17日shank2b?/?+ PTZ / n = 16 t測試)。值得注意的是租副，9 dpf的WT幼魚在7.5 mM PTZ處理前后明暗轉(zhuǎn)換期間的活性變化無顯著差異(WT-baseline vs. WT + PTZ, ns p = 0.0961, n = 17坐慰，配對t檢驗)。
人類遺傳學(xué)研究表明用僧，SHANK2與廣泛的神經(jīng)發(fā)育狀況有關(guān)结胀，包括自閉癥癥狀、智力殘疾责循、多動和焦慮糟港。在我們的臨床隊列篩選中，三分之二攜帶SHANK2突變的患者也表現(xiàn)出對視覺院仿、聽覺和觸覺刺激的超敏感性秸抚，但很少有SHANK2缺陷感覺表型的描述。異常的感覺反應(yīng)性現(xiàn)在被認(rèn)為是ASD的一個診斷特征歹垫，但在之前已知的18例攜帶從頭SHANK2變異的患者中剥汤，只有1例接受了非典型感覺處理的詳細(xì)檢查。目前的研究擴大了shank2缺陷動物模型所表現(xiàn)出的潛在行為表型的范圍排惨。此外吭敢，這種表型特征與人類SHANK2相關(guān)疾病的臨床特征譜大致一致。這些shank2b突變斑馬魚在野外過度活躍暮芭，在連續(xù)光照下表現(xiàn)出焦慮樣表型省有，社會偏好和親屬偏好降低，刻板印象增強谴麦。此外蠢沿，shank2b突變體顯示GABA受體亞基mrna和α1亞基蛋白的表達水平降低，對藥物性癲癇發(fā)作的敏感性增加匾效。有趣的是舷蟀，一些參與GABAergic信號的分子已經(jīng)被認(rèn)為與自閉癥的感覺癥狀有關(guān)。綜上所述面哼，我們的數(shù)據(jù)表明野宜，shank2b?/?斑馬魚是一個有價值的模型，用于解剖人類ASD的病理生理魔策，ASD的感覺異承僮樱可能至少部分源于GABA受體活性降低。研究表明闯袒，改變該蛋白不同區(qū)域的兩系Shank2敲除小鼠表現(xiàn)出相似的自閉癥行為表型虎敦，這與第三系Shank2?ex24敲除小鼠表現(xiàn)出的雙相相關(guān)躁狂樣行為不同游岳。一般來說，所有三種常規(guī)和其他條件Shank2缺陷小鼠模型都顯示出明顯的神經(jīng)精神樣表型其徙，除了對疼痛刺激不敏感外胚迫，沒有感覺異常。在這里唾那，我們在斑馬魚中創(chuàng)建了shank2b?/?模型來測試自閉癥和感覺處理問題的共同相關(guān)性访锻。通過兩個基于光刺激的任務(wù)和一個基于噪聲刺激的任務(wù)，詳細(xì)檢查了與shank2b缺陷相關(guān)的潛在感覺加工缺陷闹获，所有這些任務(wù)都表明期犬，與WT幼魚相比，突變幼蟲的刺激敏感性增強避诽。突變體表現(xiàn)出夸張的聲驚嚇反應(yīng)和減少的ASR習(xí)慣龟虎，以及對從黑暗到光明的突然轉(zhuǎn)變的相對過度活躍的反應(yīng)。我們目前的行為研究表明茎用，這種視覺反應(yīng)過度活躍有助于減少親屬偏好遣总。同樣睬罗，在ASD和相關(guān)神經(jīng)發(fā)育障礙的幾種小鼠模型中也觀察到視覺過敏轨功，包括Mecp2、Fmr1容达、Shank3古涧、Gabrb3和Cntnap2突變/缺陷的系。這些異常的感覺行為支持斑馬魚模型在研究人類SHANK2相關(guān)ASD中的面部有效性花盐。這些與ASD相關(guān)的感覺異常和其他癥狀行為可能是由于抑制性GABA神經(jīng)傳遞不足導(dǎo)致突觸興奮和抑制之間的不平衡羡滑。反過來，GABAergic功能障礙可能是突觸形成算芯、信號傳導(dǎo)和分子組織所必需的基因突變的下游后果柒昏，因為一些攜帶ASD突變的小鼠系顯示出抑制信號被破壞。例如熙揍，缺失自閉癥風(fēng)險基因接觸蛋白相關(guān)蛋白2 (Cntnap2)會減少小鼠皮質(zhì)中GABAergic中間神經(jīng)元的數(shù)量职祷，包括快速尖峰的小蛋白免疫陽性中間神經(jīng)元。斑馬魚cnnap2ab突變體也表現(xiàn)出GABAergic神經(jīng)元數(shù)量的減少届囚，特別是小白蛋白陽性(PV+)中間神經(jīng)元有梆。在缺乏Shank3的小鼠中，體感覺皮層(S1)和杏仁核基底外側(cè)(BLA)的PV+中間神經(jīng)元減少意系。雖然Shank家族蛋白在興奮性突觸后密度中富集泥耀，但大量研究也表明其廣泛表達于GABAergic神經(jīng)元，包括pv陽性中間神經(jīng)元蛔添。例如痰催，Shank1基因敲除小鼠的PV免疫反應(yīng)性也降低兜辞，Shank2基因敲除小鼠的GABAergic神經(jīng)傳遞受損。中間神經(jīng)元在感覺加工過程中起著至關(guān)重要的作用陨囊，上述shank基因缺失與中樞神經(jīng)系統(tǒng)GABAergic功能障礙之間的關(guān)聯(lián)表明弦疮，shank2和其他家族成員在多個感覺系統(tǒng)中作為調(diào)節(jié)GABAergic信號傳導(dǎo)的生物網(wǎng)絡(luò)的一部分，導(dǎo)致ASD中觀察到的感覺加工異常蜘醋。在我們的研究中胁塞，這些突變魚不僅表現(xiàn)出與人類一致的感覺表型，而且GABA受體的表達水平降低压语，對ptz誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作的敏感性增加啸罢。RT-qPCR分析顯示，gabra1胎食、gabra2a扰才、gabra4、gabra5厕怜、gabra6b衩匣、gabrb2a、gabrg1和gabard等亞基基因mRNA表達水平降低粥航，GABAA受體亞基包括gabrg1琅捏、GABRA2、gabra4和gabra5與自閉癥有關(guān)递雀。GABAA受體α1蛋白的表達水平在shank2b?/?斑馬魚中也顯著降低柄延，而GABAA受體α1蛋白在嚙齒動物視覺皮層發(fā)育的可塑性關(guān)鍵期起著關(guān)鍵作用。這些GABAA受體基因和蛋白質(zhì)缺陷與光照下的多動癥以及對ptz誘發(fā)的癲癇發(fā)作的敏感性增加有關(guān)缀程，表明突變斑馬魚大腦中抑制驅(qū)動的喪失搜吧。GABAA受體活性通過刺激神經(jīng)祖細(xì)胞增殖、遷移和分化杨凑、神經(jīng)突生長和突觸發(fā)生滤奈，對神經(jīng)發(fā)育至關(guān)重要。此外撩满，GABAergic中間神經(jīng)元幫助建立感覺皮層的感受野組織蜒程。此外，目前有強有力的證據(jù)表明鹦牛，GABAA受體基因和GABA中間神經(jīng)元中其他相對高水平表達的基因在特發(fā)性ASD中的異常表達模式搞糕。因此，我們認(rèn)為shank2有助于斑馬魚GABAergic網(wǎng)絡(luò)的發(fā)育曼追，而在發(fā)育過程中shank2表達的缺失會導(dǎo)致一生中感覺系統(tǒng)組織和感覺加工的異常窍仰，進而導(dǎo)致其他類似ASD的行為表型。重復(fù)和保守的shank2a和shank2b相似礼殊，在整個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上具有很高的序列同一性(補充表S5)驹吮，而shank2a的進化保守結(jié)構(gòu)域的缺失可以被檢測到(補充圖S5和S6)针史。相比之下，人類SHANK2的幾個重要蛋白——ANK碟狞、PDZ和SAMC末端區(qū)域在shank2b中比shank2a保守度更高(補充表S3和S4)啄枕。因此，shank2b更適合作為人類SHANK2的模型族沃。然而频祝，基于shank2a和shank2b轉(zhuǎn)錄本在斑馬魚大腦中的表達，我們也推測這兩個相似物可能對斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)的形成很重要脆淹。比較shank2a?/?常空、shank2b?/?和shank3&b雙純合模型的表型將是一件有趣的事情。本研究的另一個局限性是盖溺，我們沒有直接分析GABAergic的中間神經(jīng)元發(fā)育漓糙，也沒有檢查GABA激動劑是否減輕了shank2b突變體的行為異常。此外烘嘱，shank3&b缺陷斑馬魚模型更適合全面揭示shank2調(diào)控斑馬魚GABAergic網(wǎng)絡(luò)發(fā)育和行為的分子機制昆禽。總之，我們在一種新的shank2b缺陷斑馬魚模型中揭示了與GABAergic系統(tǒng)功能障礙相關(guān)的ASD樣行為和感覺缺陷(圖5)蝇庭。該模型是解剖人類SHANK2相關(guān)疾病的病理生理學(xué)的有價值的工具醉鳖，可能有助于開發(fā)新的治療伴有異常感覺加工的ASD的方法。
圖5 shank2缺失斑馬魚模型中GABAergic系統(tǒng)調(diào)控的潛在機制
基金：這項研究得到了國家自然科學(xué)基金(2021NSFC: 82171540 和 82101945)遗契、上海衛(wèi)健委重點學(xué)科建設(shè)項目(No.82171540 和 82101945)辐棒；shslczdzk02903)和國家自然科學(xué)基金(2017NSFC: 61733011)的支持病曾。
原文：Wang Y, Liu C, Deng J, et al. Behavioral and Sensory Deficits Associated with Dysfunction of GABAergic System in a Novel shank2-Deficient Zebrafish Model[J]. International journal of molecular sciences, 2023, 24(3): 2208.
原文地址：https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2208
注：因文章篇幅有限牍蜂，所有相關(guān)引用文獻，以及補充圖泰涂、表可以點擊至原文查閱鲫竞。
