雜志：Molecular Psychiatry  

影響因子：11（2022）

年份：2012

通訊作者：L Bally-Cuif博士或W Norton博士

摘要

背景：注意力缺陷/多動障礙(ADHD)是一種以注意力不集中寡具、多動秤茅、沖動增加和情緒失調(diào)為特征的神經(jīng)發(fā)育障礙。連鎖分析和精細定位確定了嗜乳蛋白3(LPHN3)基因編碼的變異童叠，這是一種假定的粘附-g蛋白偶聯(lián)受體框喳，是ADHD的危險因素。

方法：為了驗證LPHN3與ADHD之間的聯(lián)系厦坛，并了解LPHN3在該疾病的病因?qū)W中的功能五垮，我們在斑馬魚發(fā)育過程中檢測了其同源基因lphn3.1。

結(jié)果：lphn3.1功能的喪失會導(dǎo)致腹側(cè)間腦多巴胺陽性神經(jīng)元的減少和錯位杜秸，并導(dǎo)致過度活躍/沖動運動表型放仗。行為表型可以通過ADHD治療藥物哌甲酯和阿托西汀來挽救。

結(jié)論：綜上所述撬碟，我們的研究結(jié)果表明诞挨，Lphn3活性的降低與引發(fā)adhd樣行為有關(guān)莉撇，并證明了其對大腦多巴胺能回路發(fā)育的相關(guān)貢獻。

關(guān)鍵詞：ADHD;多巴胺;多動;沖動;Lphn3;斑馬魚

前言

注意缺陷/多動障礙(ADHD;人類沒有亭姥。143465)臨床異質(zhì)性神經(jīng)發(fā)育障礙是以注意力不集中稼钩、多動和沖動增加/情緒化為特征顾稀。多動癥代表了最常見的行為兒童和青少年障礙达罗，患病率為3-5%在不同的文化背景下。雖然實質(zhì)性ADHD的遺傳性在許多家庭静秆、雙胞胎和雙胞胎中都有記載收養(yǎng)研究粮揉，估計高達80%，都是全基因組的抚笔。到目前為止扶认，方法和候選基因研究都無法可靠地進行識別和描述adhd相關(guān)的風(fēng)險基因。

藥理學(xué)研究和動物模型的見解一致地暗示了ADHD的神經(jīng)生物學(xué)中神經(jīng)傳遞的改變殊橙。與多巴胺能(DA)和NA系統(tǒng)相互作用的興奮劑(例如辐宾，哌甲酯(MPH))和去甲腎上腺素(NA)再攝取抑制劑(例如，托莫西汀(ATO)治療ADHD的有效性膨蛮，以及抗抑郁藥(針對5-HT系統(tǒng))調(diào)節(jié)ADHD相關(guān)情緒失調(diào)的能力已將研究重點放在單胺能信號傳導(dǎo)上叠纹。遺傳關(guān)聯(lián)研究也支持DA在ADHD病因?qū)W中的關(guān)鍵作用。然而敞葛，神經(jīng)發(fā)育過程中導(dǎo)致ADHD癥狀的變化尚不清楚誉察。

最近，Arcos-Burgos等人通過對南美遺傳分離物的連鎖掃描和隨后在幾個北美和歐洲人群中對4q13.2位點的精細定位惹谐，報道了嗜乳蛋白3(LPHN3)基因編碼中存在風(fēng)險單倍型的證據(jù)持偏。在西班牙成人ADHD患者隊列中的重復(fù)研究表明，LPHN3在該疾病終生持續(xù)中發(fā)揮了作用氨肌。此外鸿秆，LPHN3也被確定為86個物質(zhì)使用障礙患者的風(fēng)險基因之一，物質(zhì)使用障礙是ADHD的常見合并癥怎囚。LPHN3是一種假定的粘附-g蛋白偶聯(lián)受體卿叽，但其生理作用尚不清楚，內(nèi)源性配體尚未確定桩了。近年來附帽，斑馬魚已被確立為一種有效的動物模型，用于探索行為的遺傳和發(fā)育基礎(chǔ)井誉。在這項研究中蕉扮，我們使用斑馬魚幼蟲來評估LPHN3的斑馬魚同源物之一Lphn3.1活性的發(fā)育和行為功能。我們發(fā)現(xiàn)颗圣，Lphn3.1活性的降低選擇性地影響DA系統(tǒng)的發(fā)育喳钟，并引發(fā)多動/沖動運動屁使。這種行為表型可以通過MPH和ATO這兩種有效治療ADHD的藥物來挽救。這些結(jié)果明確暗示LPHN3是ADHD運動表型的因素之一奔则，并強調(diào)了其在DA神經(jīng)元發(fā)育中的關(guān)鍵作用蛮寂。

I原位雜交和組織化學(xué)方法

根據(jù)標準程序?qū)θN裝(全胚胎或解剖腦)和成人腦切片進行原位雜交和抗體標記。

嗎啉代注射

Lphn3剪接形態(tài)學(xué)寡核苷酸(MO)購自GeneTools LLC易茬。Lphn3-MO1用于結(jié)合外顯子2的剪接給體位點酬蹋，而Lphn3-mo2則阻斷外顯子6/內(nèi)含子6邊界的剪接(Supplementary Figure S4H)。對照MO(Lphn3-CO)也有5 bp錯配抽莱。胚胎在單細胞期注射250 mM MO(5.9ng)范抓，并在281C的正常晝夜周期中恢復(fù)6天，然后分析行為(見下文)食铐。為了確認MO注射后的剪接缺陷匕垫，將20個胚胎快速冷凍在液氮中，并使用TRIzol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA虐呻，USA)提取RNA象泵。然后，我們使用RT-PCR(使用Superscriptase II試劑盒斟叼，Invitrogen)來觀察變形體中l(wèi)phn3.1剪接的異常偶惠，并使用實時PCR(見補充方法)來定量lphn3.1轉(zhuǎn)錄本。MOs和引物序列見補充方法犁柜。

Lphn3型幼蟲運動行為分析 

在受精后6天(dpf)洲鸠，通過記錄5分鐘內(nèi)游泳的總距離來檢查運動活動，使用斑馬實驗室軟件(Videotrack;生命科學(xué)馋缅，里昂扒腕，法國)。將注射后的幼蟲置于斑馬箱(ViewPoint生命科學(xué)公司)內(nèi)12孔板(BD)的不同孔中萤悴，讓其適應(yīng)5分鐘后進行記錄瘾腰。采用高速紅外攝像機，斑馬實驗室軟件設(shè)置檢測閾值為11覆履，不活動/小閾值為5蹋盆，小/大閾值為10，跟蹤幼蟲5 min硝全，計算游動距離栖雾。為了比較運動活動，計算對照和變形幼蟲的平均總游動距離伟众。對于夜間測量析藕，將白天已經(jīng)測量過的動物留在12孔板中，在斑馬箱關(guān)閉燈后記錄5分鐘3小時凳厢。將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)出到Excel(微軟)中進行分析账胧。為了比較野生型和變型幼蟲之間的游動距離竞慢，使用單因素方差分析計算p值，然后使用未合并SD的配對t檢驗和根據(jù)HOLM調(diào)整的p值治泥。所有數(shù)據(jù)采用Excel(微軟)和R Foundation統(tǒng)計軟件包進行分析筹煮。

藥物治療

所有藥物溶液于實驗當(dāng)天新鮮配制于胚胎培養(yǎng)基(含0.01%二甲亞砜)中。藥物治療前居夹，分別給幼蟲注射Lphn3-CO或Lphn3-MO1败潦，讓其恢復(fù)6 d。然后將變形幼蟲在藥物溶液(1吮播、5变屁、10眼俊、15或20 mM ATO(Sigma-Aldrich意狠，圣路易斯，MO疮胖，USA)或8环戈、10、12澎灸、15或20 mM MPH(Sigma-Aldrich)中孵育1小時院塞，或僅在0.01%二甲亞胺中孵育1小時。如上所述性昭，記錄不同處理組在5分鐘時間內(nèi)的游動距離拦止。為了實時PCR分析MPH和ATO處理對lphn3.1表達水平的影響，在制備RNA前糜颠，將幼蟲用10 mM MPH或1 mM ATO處理1小時汹族。為了觀察MPH或ATO處理對DA神經(jīng)元形成的影響，從第0天(受精后立即)其兴，第3天或第6天(1小時)分別用10 mM MPH或1 mM ATO處理幼蟲顶瞒，然后在6 dpf固定。

HPLC分析

為了進行HPLC分析元旬，100只斑馬魚幼蟲分別在250μl含有10μM EDTA榴徐、抗壞血酸和代謝亞硫酸鈉的0.1 M乙酸中均勻化。樣品在-20°C保存直至分析匀归。多巴胺(DA)及其代謝物3,4-二羥基苯基乙酸(DOPAC)在Agilent 1100HPLC系統(tǒng)(Agilent Technologies)上進行測量坑资，電化學(xué)檢測(型號1640;BioRad)按照之前描述的方法進行。色譜柱為EC 250/4.6 NUCLEOSIL 100-3 C-18HPLC柱(Macherey-Nagel)穆端，流動相為0.65 mM辛烷磺酸袱贮、0.5mM三乙胺、0.1M EDTA和10%甲醇(均購自西格瑪)徙赢，pH 4.12字柠，采用等壓洗脫(流量:0.8 ml/min)探越。柱溫設(shè)置為30℃，進樣量為50μl窑业。分析物的保留時間(min)為:DA 15.5, DOPAC 14.3钦幔。使用Chem Station for LC (Version: 2D, Rev. A.10.02;Agilent)使用峰值高度后手動集成。通過對每種分析物([20/40/80ng/ml])注射三種不同濃度的物質(zhì)混合物獲得校準曲線常柄，相關(guān)系數(shù)>0.999

實時聚合酶鏈反應(yīng)

從6日齡幼蟲中提取1μg RNA鲤氢，合成cDNA，進行qPCR定量PCR分析西潘。幼蟲在單細胞期注射對照或lphn3.1特異性morpholinos卷玉，或在提取RNA前1小時注射1μg ATO或10μg MPH。使用Lightcycler進行定量PCR喷市，采用SYBR綠色檢測方案(Roche)相种。PCR條件為40個循環(huán)，95℃品姓，15秒;60℃寝并，10秒;72℃，20秒腹备。在每種情況下衬潦，分析以三份重復(fù)進行，在morpholino實驗中植酥，每個基因型或治療使用2個生物重復(fù)镀岛，在藥物實驗中使用3個生物樣本。所有結(jié)果分別歸一化到管家基因gapdh的表達水平友驮。qPCR結(jié)果顯示為使用2方法計算的相對表達水平(7)漂羊。p <值-ΔΔCT使用t檢驗計算。

小鼠Lphn3感測RNA的制備

將小鼠Lphn3全長編碼區(qū)亞克隆到pCS2+的ECOR1位點上喊儡，利用mMessage mMachine SP6試劑盒(Ambion)制備sense capping RNA拨与。在幼蟲單細胞期，共注射90ng/μl傳感RNA和250μM (5.9ng)的morpholino艾猜。讓幼蟲恢復(fù)6天买喧，然后分析其行為。

原位雜交

使用兩個不同長度的原位探針檢測lphn3.1的表達:一個長探針對應(yīng)于斑馬魚lphn3.1基因的全長(4578bp)匆赃，一個短探針識別lphn3.1的3 '部分(堿基對2078 - 4578)淤毛，長度為2500bp。lphn3.2的表達使用500bp探針進行可視化算柳，該探針檢測到外顯子5至外顯子8的編碼序列低淡。對6月齡成年斑馬魚大腦100μm明膠/白蛋白包埋切片進行成體腦原位雜交。使用徠卡振動器對大腦進行切片，并在自由浮動切片上進行原位切片蔗蹋。幼蟲原位方案之后何荚，在搖晃的水浴中進行雜交步驟。

原位雜交和組織化學(xué)方法

斑馬魚:將整個幼蟲在4%多聚甲醛(Sigma Aldrich)中固定過夜猪杭，然后部分解剖餐塘。將幼蟲孵育在以下一種一抗中(小鼠抗th, Chemicon MAB318稀釋1:1000;大鼠抗5ht, Chemicon MAB 352稀釋1:100)，在4oC下放置48小時皂吮。洗凈幼蟲戒傻，用二抗(馬抗小鼠生物素，Vector稀釋1:20 00;山羊抗大鼠生https://fanyi.youdao.com/download物素蜂筹，Jackson稀釋1:500)在4℃下孵育過夜需纳。進一步?jīng)_洗后，在DAB溶液中顯影艺挪。所有照片均使用徠卡顯微鏡拍攝不翩，圖像在Photoshop (Adobe)中組裝。鼠標:如前所述闺属，對小鼠腦進行原位雜交慌盯。簡單地說，在0.1 M新鮮制備的4%多聚甲醛冷PBS中固定5分鐘后掂器，隨后在100%乙醇中儲存，16 μm小鼠腦低溫恒溫切片通過分級系列乙醇(100-70%)轉(zhuǎn)移到2xSSC(檸檬酸鈉鹽)中俱箱，并用0.02 N HCl處理5分鐘国瓮。用2xSSC洗滌后，用0.1 M三乙醇胺中0.25%的乙酸酐孵育20分鐘狞谱，再用2xSSC洗滌乃摹，并用雜交液(50%去離子化甲酰胺、4xSSC跟衅、1x Denhardt’s溶液孵睬、10%硫酸葡聚糖和250 μg/ml變性鮭魚精子DANN)覆蓋，60℃下孵育1小時伶跷。義和反義特異性地高辛(DIG)標記的Lphn3 cRNA探針(cDNA核苷酸133-809掰读，登錄號NM_198702;在pCRII雙啟動子載體上)生成并在1%瓊脂糖凝膠上純化。切片與雜交緩沖液和dig標記的反義(或正)Lphn3 cRNA(終濃度10-20 ng/μl)在60℃下孵育16-18 h叭莫。用2xSSC在室溫(RT)蹈集、50%甲酰胺在2xSSC中(60o℃)逐級洗滌，然后再用2xSSC (RT)洗滌雇初。為了去除未雜交的單鏈rna拢肆，切片用40μg/ml核糖核酸酶A (RNase A)在500 mM NaCl、10 mM Tris-HCl (pH 8.0)和1 mM EDTA溶液中處理，37℃下處理30分鐘郭怪。用不含RNase A的相同緩沖液在RT下多次洗滌后支示，在該緩沖液中60℃孵育30分鐘，并用TBS沖洗鄙才。cRNA探針采用羊抗dig堿性磷酸酶(aP)偶聯(lián)抗體(1.5 U/ml)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)和4-硝基藍-四氯化銨(NBT)作為aP底物(Roche, Mannheim, Germany)悼院。

吖啶橙染色

根據(jù)對活胚胎進行吖啶橙染色，測定細胞死亡水平咒循。簡單地說据途，將24hpf或48hpf的活胚胎在2μg/ml吖啶橙(西格瑪奧爾德里奇)中孵育30分鐘，然后在胚胎培養(yǎng)基中沖洗幾次叙甸。胚胎麻醉于0.016%的三卡因(MS-222;西格瑪奧爾德里奇)和拍攝使用微縮顯微鏡(徠卡)颖医。

魚類品系及處理

成年斑馬魚(Danio rerio)使用標準養(yǎng)魚方案并按照研究所動物福利準則進行飼養(yǎng)。用于實驗的胚胎來自AB/Ekwill品系的野生型魚的自然產(chǎn)卵裆蒸，維持在14小時的光照/10小時的黑暗周期熔萧。胚胎按照進行分期。

lphn3基因克隆及l(fā)phn3蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析

通過NCBI和Ensembl基因組數(shù)據(jù)庫(Suppl)的tblastn搜索(2)鑒定了親Latrophilin蛋白序列僚祷。表1)佛致。由于我們無法通過這種方法鑒定完整的預(yù)測蛋白，我們手動重建蛋白序列辙谜，然后進行RT-PCR驗證俺榆。使用ClustalX軟件對蛋白質(zhì)序列進行比對。在BioEdit (TomHall, Ibis Biosciences)中計算了斑馬魚Lphn3.1装哆、斑馬魚Lphn3.2和人類LPHN3蛋白序列的保守性和一致性百分比罐脊。Lphn3.1和LPHN3的第一個內(nèi)含子不包括在守恒百分比的計算中，因為相應(yīng)的Lphn3.2序列尚未在斑馬魚中被鑒定蜕琴。僅使用在所有物種中可以明確識別和對齊的殘基(對應(yīng)于人類LPHN3蛋白的殘基90-391)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹萍桌。使用PhyML構(gòu)建最大似然系統(tǒng)發(fā)育，設(shè)置如下:JTT替代模型;4個替代率類別;伽馬分布參數(shù)估計;不變位點比例的估計(3)凌简。分支支持度通過近似似然比檢驗(aLRT, SH-like;(4))估計上炎。

功能缺失分析，RT-PCR和qPCR驗證

本研究使用的morpholinos序列及RT-PCR和qPCR引物分別為：Lphn3-MO1ATGTGAGTGTATCTCTGTACCTGAA3;Lphn3-MO2 GGTGTCATGTTTTTACTCACTCTTT;Control MO包含5個堿基對錯配(小寫)ATcTGAcTGTATgTCTcTACCTcAA雏搂。

RT-PCR引物：MO1Forward:GTCGAGAGCTGTCGTGTGAG,MO1Reverse1 ATTCGGCCATTGTTCTGTTC,MO1Reverse2AACTTGTCCCTGGTGTGTCC,MO2Forward cccctctctccaccaccactacca,MO2ReverseTCTGTGCTCTCCTGTATGGTG藕施。

Lphn3.1 Exon1qPCRForwardGTGGTCCACACGCCTACTT,Lphn3.1 Exon 2qPCRReverse CAGCGAGTTCGATAGGATA,Lphn3.2Exon3qPCRForward CCCTGTCCTGGGACATACAA,Lphn3.2 Exon4qPCRReverseGGCCTGGAGAGGGTCTTTAC

I斑馬魚LPHN3同源物的分離與敲除 

為了闡明LPHN3的內(nèi)源性功能，我們在斑馬魚中克隆并檢測了相應(yīng)的基因畔派。我們對斑馬魚基因組進行BLAST分析铅碍，鑒定出兩個與人類LPHN3相似的部分轉(zhuǎn)錄本，并通過對來自多個物種的親Latrophilin家族成員的系統(tǒng)發(fā)育分析證實了它們的身份(Supplementary Figure S1)线椰。斑馬魚Lphn3.1與重復(fù)的Lphn3.2蛋白同源性為73.7%胞谈，相似度為86.2%。Lphn3.1與人類LPHN3的同源性為73.3%，相似度為85.7%烦绳；Lphn3.2與人類LPHN3的同源性為76.1%卿捎，相似度為89.3%。兩個LPHN3同源基因在發(fā)育過程中顯示出部分重疊的表達譜径密。在受精后24小時(hpf)午阵，lphn3.1以一種與分化神經(jīng)元相似的模式廣泛表達(補充圖S2A,D)，例如那些被elavl3表達標記的神經(jīng)元享扔。這種模式在48 mph時保持(補充圖S2B,E)底桂，而在受精后6天(dpf)，lphn3.1的表達變得更加受限惧眠，在端腦和間腦的腹側(cè)部分籽懦、后腦以及脊柱腹側(cè)區(qū)域有強表達(補充圖S2C,F)。在24 mph時氛魁，在間腦腹側(cè)可以看到lphn3.2的表達(補充圖S2J暮顺，M)，在48 hpf.時秀存，它擴展到也包括端腦和后腦(在表達條紋中捶码，似乎與lphn3.1的表達互補)，以及在視神經(jīng)頂葉和耳囊的邊緣(補充圖S2K,N)或链。到6 d.p.f.時惫恼，lphn3.2的表達與lphn3.1非常相似，并且在端腦株扛、間腦和后腦的腹側(cè)部分可見(補充圖S2L尤筐，O).在30 h.p.f.時，lphn3.1在后結(jié)核(PT)區(qū)域與酪氨酸羥化酶(DA神經(jīng)元的標記物)共表達(補充圖S2X)洞就。為了評估Lphn3在物種間表達的保守性，我們比較了斑馬魚lphn3.1和小鼠成年腦中的Lphn3掀淘。lphn3.1的表達沿著遠端腦中線旬蟋，以及在遠端腦實質(zhì)、丘腦前部革娄、水包導(dǎo)管周圍灰質(zhì)倾贰、中縫上核、下丘腦下腦室周圍核拦惋、小腦和內(nèi)側(cè)縱束核中的較低水平表達(補充圖S3A—E)匆浙。這種廣泛的表達譜與lphn3.1的小鼠同源基因Lphn3相同(補充圖S3F—I)。在成年小鼠大腦中厕妖，Lphn3在皮層的所有層以及中縫核的背核和中央核、海馬和小腦中表達。

這種廣泛的發(fā)育表達對Lphn3的功能知之甚少胶逢。因此，我們選擇破壞具有最強胚胎表達的LPHN3同源物lphn3.1的功能迎捺。lphn3.1由19個外顯子組成(補充圖S4B)，編碼一種與人類LPHN3預(yù)測結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)(補充圖S4A)查排。我們在發(fā)育過程中使用兩個剪接阻斷MO來敲低lphn3.1的活性凳枝。Lphn3-MO1靶向外顯子2/內(nèi)含子2邊界，Lphn3-MO2靶向外顯子6/內(nèi)含子6邊界跋核，lphn3.1和lphn3.2序列差異顯著的區(qū)域(補充圖S4B,H)岖瑰。注射這兩種MOs中的任何一種導(dǎo)致在2個d.p.f.胚胎中缺乏野生型lphn3.1轉(zhuǎn)錄本(補充圖S4D,E,G)。在后期(6 d.p.f.)砂代，lphn3.1的表達恢復(fù)(補充圖S4F,G)蹋订。這表明在發(fā)育過程中注射多酚會導(dǎo)致Lphn3.1活性的短暫下調(diào)。與對照動物相比泊藕，注射morpholino敲低lphn3.1并不會導(dǎo)致發(fā)育延遲（補充圖S4C)辅辩，也不會增加細胞凋亡(補充圖 S5A—D)。

圖S1 脊椎動物L(fēng)PHN家族蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)斑馬魚Lphn3.1和Lphn3.2與人類LPHN3同源娃圆。使用ClustalX和PhyML軟件對序列進行比對玫锋。序列的加入編號如表1所示。斑馬魚的Lphn3.1和Lphn3.2與梅塔卡魚和河豚魚的LPHN3同源物密切相關(guān)讼呢。丹尼奧·雷里奧博士 Fr, 紅鰭東方鲀; Gg, 紅鳥; Hs, 現(xiàn)代人; Md, 短尾負鼠; Mm, 小鼠; Oa, 鴨嘴獸; Ol, 青鳉; Xt, 熱帶爪蟾撩鹿。

表1 用于分子系統(tǒng)發(fā)育的序列列表。9個不同物種Latrophilin家族3個蛋白(LPHN1, LPHN2, LPHN3)的NCBI和/或Ensembl序列悦屏。

圖S2 斑馬魚lphn3.1和lphn3.2的胚胎和幼蟲表達节沦。(a - c) lphn3.1在整個發(fā)育過程中以一種與分化神經(jīng)元相似的模式表達。與lphn3.1反義原位探針雜交的全頭(24hpf, 48hpf和4dpf)和解剖腦(6dpf)的背側(cè)圖(sense;a - c)础爬。(D-F)全頭顱(24hpf, 48hpf和4dpf)和解剖腦(6dpf)與lphn3.1反義原位探針雜交的側(cè)面圖(sense;D-F)甫贯。(G-I)全頭顱(24hpf, 48hpf和4dpf)和解剖腦(6dpf)與lphn3.1感覺控制原位探針雜交的側(cè)位圖。感覺探針未見染色看蚜，說明lphn3.1標記的特異性叫搁。(J-L) lphn3.2在整個發(fā)育過程中均在端腦腹側(cè)和間腦、視頂葉邊緣供炎、耳囊和后腦表達渴逻。與lphn3.2反義原位探針雜交的全頭(24hpf, 48hpf和4dpf)和解剖腦(6dpf)的背側(cè)圖(sense;J-L)。(M-O)全頭顱(24hpf, 48hpf和4dpf)和解剖腦(6dpf)與lphn3.1反義原位探針雜交的側(cè)面圖(sense;M-O)音诫。(P-R)全頭顱(24hpf, 48hpf和4dpf)和解剖腦(6dpf)與lphn3.1傳感控制原位探針雜交的側(cè)面圖惨奕。感覺探針未見染色，說明lphn3.1標記的特異性竭钝。(S- u)使用短(2.5kb)原位反義探針顯示的lphn3.1在3dpf(全安裝頭)的側(cè)位(S)和背位(T)表達圖梨撞。(U)頂蓋水平3天幼蟲頭部切片雹洗，顯示lphn3.1廣泛的神經(jīng)表達。(V,W)下丘腦水平30dpf幼蟲腦切片聋袋，顯示lphn3.1在后結(jié)核中表達(V)队伟， (W)和抗酪氨酸羥化酶抗體在同一區(qū)域標記(W)。(X)圖V和圖W合并顯示lphn3.1和抗酪氨酸羥化酶抗體在PT中共表達幽勒∈任辏縮寫(圖A-C和V-X): e, eye;h,后腦;Hy,下丘腦;米,中腦;PT是后結(jié)節(jié)，t是端腦啥容。

S3 斑馬魚lphn3.1和小鼠Lphn3的成體表達锈颗。(A-E)成年斑馬魚全腦冠狀切片上lphn3.1的表達。表達見于丘腦前核(A)咪惠、小腦體(CCe)击吱、內(nèi)側(cè)縱束核(MLF)、腦端腦室層以上細胞(PC)遥昧、腦室周圍灰色區(qū)(PGZ)覆醇、前視前區(qū)(PPa)、腦室周圍核(PVN)和腦室上核(SR)炭臭。(F-I) Lphn3在成年小鼠腦中的表達永脓。高倍冠狀面顯示Nissl染色(F,H,G,I)和Lphn3在皮層(F-F”)、中縫背外側(cè)核(G-G”)鞋仍、海馬(H-H”)和小腦(I-I”)中的表達(F '常摧，F(xiàn) "，G '威创，G "落午，H '，H "肚豺，I '溃斋，I ")。鼠標部分的縮寫:溝槽區(qū)(Aq)吸申、海馬區(qū)1-3區(qū)(CA1-3)盐类、皮層層(CO)、中央核(CS)呛谜、齒狀回(DG)、中縫背側(cè)分裂(DRD)枪萄、中縫背下分裂(DRI)隐岛、小腦顆粒層(GL)、齒狀回顆粒層(gr)瓷翻、小腦分子層(ML)聚凹、齒狀回分子層(MO)割坠、浦肯野細胞層(PCL)、齒狀回多態(tài)層(PO)妒牙、白質(zhì)(WM)彼哼。

圖S4 Morpholino注射導(dǎo)致lphn3.1下調(diào)。(A) Lphn3.1和Lphn3.2粘附- g蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)構(gòu)(包括一個由自催化GPS位點連接到七個跨膜結(jié)構(gòu)域的大細胞外區(qū)域)湘今。使用SMART預(yù)測程序識別蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域敢朱，并與預(yù)測的人類蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相匹配。箭頭表示mo2產(chǎn)生的異常剪接lphn3.1及其對應(yīng)蛋白與野生型序列的偏離位置摩瞎∷┣縮寫:GPS, G蛋白偶聯(lián)蛋白水解位點;Horm R，激素結(jié)合域;LB旗们，凝集素結(jié)合域;Olfactomedin-like domain蚓哩。(B) lphn3.1的基因組組織。外顯子(E)以黑盒子表示上渴，內(nèi)含子以實線表示岸梨。我們使用計算機搜索和RT-PCR證實了在斑馬魚基因組的當(dāng)前版本(http://www.ensembl.org, Zv9)中沒有預(yù)測到的額外的lphn3.1 5 '外顯子(E1)的存在，并且包含ATG起始密碼子稠氮。morpholino 1 (MO1)和morpholino 2 (MO2)在外顯子/內(nèi)含子邊界的位置分別用紅色和綠色表示曹阔。藍色箭頭表示用于通過RT-PCR驗證morpholino功能缺失的引物的位置(對于MO1，使用了兩個嵌套的反向引物括袒，如圖B所示)次兆。(C) 6dpf時觀察到的野生型、注射Lphn3-CO-和lphn3 -MO1的魚的背側(cè)視圖锹锰。注射未引起死亡率增加芥炭，6dpf時幼蟲形態(tài)正常。在Lphn3-MO2突變體中也觀察到同樣的情況(未顯示)恃慧。(D-F)不同魚類種群(WT, Lphn3-CO-园蝠， Lphn3-MO1-和lphn3 - mo2注射)在2dpf (D,E)和6dpf (F)的RT-PCR分析。在Lphn3-MO1突變體中痢士，無法檢測到lphn3.1轉(zhuǎn)錄物彪薛，可能是由于2dpf (D)的畸變轉(zhuǎn)錄物的非義介導(dǎo)衰變。注射Lphn3-MO2導(dǎo)致lphn3.1剪接異常怠蹂，并出現(xiàn)3個異常PCR產(chǎn)物(E)善延。序列分析表明，這些PCR產(chǎn)物編碼的突變體lphn3.1蛋白在529位偏離野生型序列(圖s4a中箭頭所示城侧，與MO2的位置對應(yīng))易遣。黑色箭頭表示預(yù)測的正常lphn3.1波段。(G) Real-time PCR分析lphn3.1在注射Lphn3-CO-和lphn3 - mo1的斑馬魚中48hpf和6dpf的表達情況嫌佑。相對于gapdh的表達比采用2-ΔΔCT法計算豆茫，然后進行t檢驗侨歉。(H)描繪lphn3.1而非lphn3.2的MO1和MO2序列特異性的卡通。Morpholino序列用紅色表示揩魂，lphn3.2中匹配的堿基對用粗體突出顯示幽邓。

圖S5 lphn3.1特異性morpholino注射液不增加細胞凋亡。(A-D)吖啶橙染色顯示火脉，注射Lphn3-MO1在24h (A,B)和48h (C,D)均未引起細胞凋亡增加牵舵。

Lphn3功能下調(diào)可引發(fā)運動多動和游泳爆發(fā)

我們首先研究了Lphn3活性降低對斑馬魚幼蟲行為的影響。在adhd典型綜合征維度的標志中忘分，我們關(guān)注的是運動活動棋枕，這在該模型系統(tǒng)中最容易評估。我們將Lphn3-MO1或Lphn3-MO2注射到野生型卵中妒峦，6天后測量運動重斑。我們觀察到，與注射了錯配morpholino(Lphn3-CO)的對照胚胎相比肯骇，lphn3.1 morphants游的距離顯著增加(圖1a)窥浪。在多個獨立實驗中，注射MO1和MO2的幼蟲都表現(xiàn)出類似的運動增加(補充圖S6A笛丙，數(shù)據(jù)未顯示)漾脂，證實了表型的特異性。因此胚鸯，我們的分析僅限于Lphn3-MO1型幼蟲骨稿。

lphn3.1 morphants游動距離的增加(圖1a，補充圖S6A,B和補充視頻)可能是這是由于游泳比賽之間休息時間的減少或游泳速度的總體提高姜钳。在5分鐘的實驗中坦冠，我們發(fā)現(xiàn)注射Lphn3-CO和注射lphn3-mo1的幼蟲的休息時間沒有顯著差異(p=0.5補充圖S6C)。相反哥桥，在排除休息時間后辙浑，注射Lphn3-CO的幼蟲平均游泳速度為3.93 mm s-1，而注射lphn3-m01的幼蟲平均游泳速度為6.44 mm s-1(Lphn3-CO與Lphn3-MO1之比為0.04;圖1 b)拟糕。因此判呕，lphn3.1變形體的過度活躍反映了活動期間整體運動速度的增加。

ADHD患者表現(xiàn)出的多動癥狀可以隨著時間的推移而非常穩(wěn)定送滞，并且也可能在夜間保持侠草。為了確定lphn3.1變形體的活性是否顯示出類似的特性，我們首先繪制了在120s的實驗中每3秒單個魚游動的總距離(圖1c)犁嗅。我們用線性方程y=Sx表示得到的單曲線梦抢，Lphn3-CO-動物的斜率S為2.8 mm S-1，而Lphn3-MO1動物的斜率S為6.2 mm S-1愧哟。這些值彼此之間存在顯著差異(線性混合t檢驗p<0.025)奥吩，接近對照魚和變形魚的平均速度(圖1b)。綜上所述蕊梧，這些結(jié)果表明霞赫，Lphn3.1變異魚表現(xiàn)出規(guī)律且穩(wěn)定的多動。接下來肥矢，為了確定Lphn3-MO1變形體的過度活動是否延伸到睡眠期間端衰，我們記錄了夜間游泳的距離。不出所料甘改，Lphn3-CO和Lphn3-MO1種群在夜間明顯較少游動旅东。然而，與注射對照動物相比十艾，Lphn3-MO1變形幼蟲仍然表現(xiàn)出明顯的多動癥(圖1d)抵代。

adhd相關(guān)的沖動性增加，細分為運動和認知成分忘嫉，被視為在患者中觀察到的各種行為障礙背后的基本特征荤牍。在繪制90秒內(nèi)單個動物每3秒游的距離時，變形魚的曲線比Lphn3-CO幼蟲的曲線更陡(圖2a庆冕，灰色箭頭)康吵。Lphn3-MO1魚的個體曲線平均呈現(xiàn)6.2個峰，而Lphn3-CO魚的個體曲線平均呈現(xiàn)2.7個峰(Lphn3-CO vs Lphn3-MO1 p<0.001;圖2 b)访递。此外晦嵌，每個峰游的距離在變形體中增加(圖2c)，而游這個距離所花費的時間在兩個處理組之間沒有變化(Lphn3-CO vs Lphn3-MO1=0.2;圖2 d)拷姿。因此惭载，與對照相比，lphn3.1突變體表現(xiàn)出更多的活動爆發(fā)跌前，并且顯著加快(Lphn3-MO1為4.79 mm s—1,Lphn3-CO為2.14 mm s—1;圖2e)棕兼，表明其游泳行為的運動沖動性增加。 

圖1 下調(diào)lphn3.1誘導(dǎo)斑馬魚幼魚過度活躍抵乓。(a)注射Lphn3-CO伴挚、Lphn3-MO1或Lphn3-MO2的6只d.p.f.幼蟲在5 min時間間隔內(nèi)的平均游動距離。注射MO1-和mo2的幼蟲與注射co的幼蟲游得同樣快灾炭，且游得更遠茎芋。誤差條為±s.e.m。Lphn3-CO n=43,Lphn3-MO1 n=42,Lphn3-MO2 n=49蜈出。**po0.025,NS=無顯著性田弥。(b)5min實驗期間注射Lphn3-CO和lphn3-mo1的種群的平均游泳速度，不包括休息時間铡原。對于Lphn3-CO偷厦，分析了n47只動物;對于Lphn3-MO1,n=48商叹。Lphn3-CO的動物游泳的平均速度為3.93 mm s—1，而Lphn3-MO1變形體游泳的速度更快只泼，平均速度為6.44 mm s—1剖笙。誤差條為±s.e.m。*po0.05请唱。(c)注射Lphn3-CO和lphn3-mo1的幼蟲游動距離隨時間的總和(單位:毫米)弥咪。在120秒的實驗過程中，每3秒增加一次游動的總距離;每個處理組N=10條魚;灰線代表Lphn3-MO1十绑，黑線代表Lphn3-CO幼蟲聚至。Lphn3-MO1變形魚持續(xù)且穩(wěn)定地過度活躍。線性混合t檢驗po0.025本橙。(d)白天(*po0.05)和夜間(**po0.025)注射Lphn3-CO(n=12)和Lphn3-MO1(n=12)的幼蟲5 min平均游動距離扳躬。對于每個處理組，在兩個時間點對相同的動物進行分析勋功。與白天相比坦报，夜間Lphn3-MO1幼蟲的活動減少(***po0.001)，但夜間測量的Lphn3-MO1幼蟲仍顯著高于夜間測量的Lphn3-CO(**po0.025)狂鞋。

圖S6 Lphn3-MO1幼蟲運動行為的詳細分析片择。(A)注射CO-和mo1的種群中每只動物在5分鐘內(nèi)行走的總距離。五個獨立實驗的結(jié)果(每個實驗用一種顏色)組合成一個圖表骚揍，顯示每條魚的運動活動(用圓點表示;左邊是Lphn3-CO字管，右邊是Lphn3-MO1)。注射lphn3 - mo1的幼蟲活性顯著高于注射Lphn-CO信不。方差分析后進行t檢驗p < 0.0001嘲叔。(B)注射Lphn3-CO-和Lphn3-MO1的魚在5分鐘的時間間隔內(nèi)游動行為的視頻軌跡。紅色和綠色的痕跡對應(yīng)于幼蟲的游泳速度抽活。綠色跡線表示慢速游泳(小于10mm/秒)硫戈，紅色跡線表示速度大于10mm/秒。(C)注射Lphn3-CO- (n=47)和Lphn3-MO1 (n=48)的幼蟲在5分鐘實驗期間的總休息時間下硕。我們認為每一個非游泳/運動的插曲都是休息時間丁逝。兩個種群的休息時間沒有顯著變化。

圖2 注射了morpholino的個體幼蟲表現(xiàn)出運動沖動性梭姓。(a)Lphn3-MO1變形魚呈現(xiàn)運動高峰霜幼。5條魚的Lphn3-CO(左)和lphn3-mo1注射的幼蟲(右)游出的距離(毫米)，在90秒的實驗中每3秒繪制一次誉尖。在第一個變形圖上顯示了峰值參數(shù)(包括平均游泳距離(水平黑色條)罪既，加速時間和峰值高度(峰值頂部和底部之間的差值))。(b)120秒實驗期間，Lphn3-CO和lphn3-mo1注射種群的活性峰數(shù)琢感。每組N=10丢间。變異幼蟲平均發(fā)生峰值6.2次，對照魚平均發(fā)生峰值2.7次猩谊。***p<0.01千劈。(c)過度活躍的魚在每個峰中覆蓋的距離更大。峰的平均高度(毫米;圖a)中顯示的Lphn3-MO1幼蟲(平均12.86 mm)和Lphn3-CO幼蟲(平均6.58 mm)的距離值總結(jié)并報告在此圖中牌捷。ANOVA后進行t檢驗n=10 ***p<0.001。(d)為變形幼蟲和對照幼蟲繪制了峰值加速階段的持續(xù)時間(圖a中所示的時間值)涡驮。Lphn3-MO1注射期(平均持續(xù)時間3.53 s)與Lphn3-CO幼蟲期(平均持續(xù)時間3.90 s)無統(tǒng)計學(xué)差異暗甥。ANOVA后進行t檢驗。NS=無顯著性捉捅。(e)Lphn3-CO和Lphn3-MO1幼蟲在高峰期的加速值撤防。峰值加速度(mms -1))對應(yīng)于n=10只動物在不同峰值期間游泳距離與時間的比值。Lphn3-MO1-的平均峰值加速度為4.76 mms-1棒口，注射lphn3-co的平均峰值加速度為2.14 mms -1寄月。***p<0.01。

Lphn3變形體顯示DA系統(tǒng)發(fā)育受損

我們接下來的目標是確定神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)遞質(zhì)信號的任何變化是否與變形體的行為相關(guān)无牵。一些證據(jù)將DA(DAergic)信號與ADHD的病因聯(lián)系起來漾肮。我們首先用高效液相色譜法測定了整個幼蟲體內(nèi)DA及其代謝物3,4-二羥基苯乙酸的濃度(補充圖S7A)。與Lphn3-CO相比茎毁，Lphn3-MO1幼蟲的DA水平和周轉(zhuǎn)量都沒有顯著變化(補充圖S7)克懊，這表明DA信號在Lphn3-MO1中并未全局中斷。然而七蜘，由于這種分析不能檢測到一些DA核形成的細微變化谭溉，我們使用抗酪氨酸羥化酶免疫細胞化學(xué)檢測了3個d.p.f.和6個d.p.f.過度活躍的lphn3.1變異體大腦中DA神經(jīng)元的形成。我們集中分析了PT的DAergic橡卤，其中一些核向大腦皮層的下結(jié)構(gòu)發(fā)送投射扮念。盡管斑馬魚系統(tǒng)與人類基底神經(jīng)節(jié)回路的功能關(guān)系仍存在爭議，斑馬魚PT已被認為與運動控制有關(guān)碧库。PT由7個神經(jīng)元群組成(圖3k)柜与。在3d.p.f.，我們檢測到lphn3.1 嗎啡啉突變體的PT神經(jīng)元數(shù)量整體減少(圖3b和d谈为，補充圖S7B)旅挤。這包括種群1和種群2的減少以及種群3的完全缺失(圖3a-d)。到6 d.p.f伞鲫，過度活躍的Lphn3-MO1注射的幼蟲顯示出所有PT神經(jīng)元的嚴重紊亂(圖3e—j)粘茄，以及DA神經(jīng)元總數(shù)的減少(6 d.p.f Lphn3-CO vs 6 d.p.f Lphn3-MO1 po0.001，補充圖S7B)和投影。種群2柒瓣、3和7幾乎完全缺失儒搭，而且種群1和4/5嚴重減少(圖3f,h,j)。為了證實這些觀察結(jié)果芙贫，我們分析了第二個DA標記搂鲫，編碼DA轉(zhuǎn)運體的基因slc6a3/dat。與Lphn3-CO相比磺平，Lphn3-MO1 PT中slc6a3陽性神經(jīng)元的數(shù)量在3 d.p.f(補充圖S7C,D,G,H)和6 d.p.f(補充圖S7E,F,I,J)時均有所減少魂仍，證實了lphn3.1功能喪失后PT神經(jīng)元的修飾。

運動是一種數(shù)量性狀拣挪，Lphn3-CO和Lphn3-MO1幼蟲的活動水平在單個種群內(nèi)都是不同的(補充圖S8A)擦酌，盡管Lphn3-MO1動物的平均種群總是比Lphn3-CO活躍。為了直接研究多動癥與DA神經(jīng)元減少之間的相關(guān)性菠劝，我們比較了分布在運動水平譜上的個體Lphn3-CO和Lphn3-MO1幼蟲的PT赊舶。首先根據(jù)幼蟲的行為表型將其分為三組(補充圖S8A)。第1組注射Lphn3-MO1注射的幼蟲比任何對照幼蟲游得更遠赶诊。2組和3組幼蟲的游動距離分別大于或小于Lphn3-CO幼蟲的平均游動距離笼平，均在對照幼蟲的活動水平范圍內(nèi)。然后我們進行了抗酪氨酸羥化酶抗體標記舔痪，并觀察了PT DA神經(jīng)元修飾的梯度寓调。1組(嚴重亢進的Lphn3-MO1)幼蟲的PT DA神經(jīng)元有強烈的復(fù)位和錯位(補充圖S8C)。第2組Lphn3-MO1幼蟲與第2組Lphn3-CO幼蟲相比辙喂，PT神經(jīng)元輕度減少(補充圖S8D,E)捶牢，而第3組Lphn3-MO1動物的PT與第3組Lphn-CO動物基本相似(補充圖S8F,G)。第2組和第3組Lphn3-CO幼蟲之間沒有顯著差異(補充圖S8D,F)巍耗。通過計數(shù)細胞數(shù)進一步驗證了這些觀察結(jié)果(補充圖S8B)秋麸。最后，與對照組相比炬太，變形組的DAergic投影逐漸但持續(xù)地減少(補充圖S8C—G)灸蟆。我們得出結(jié)論，PT DA系統(tǒng)形成的嚴重損傷確實與多動癥有關(guān)亲族。然而炒考，第2組Lphn3-MO1幼蟲的DA細胞數(shù)量輕微但顯著減少，所有Lphn3-MO1組的DAergic投射持續(xù)減少霎迫，這表明PT DA神經(jīng)元和/或投射的數(shù)量可能存在一個閾值斋枢，需要減少才能觸發(fā)多動癥。

其他單胺能神經(jīng)遞質(zhì)知给，包括NA和5-羥色胺(5-HT)18,44與ADHD有關(guān)瓤帚，我們接下來分析了注射了多活性mo的幼蟲對這些系統(tǒng)的發(fā)育描姚。在注射Lphn3-CO和lphn3-mo1的幼蟲中，在第3 d.p.f.和第6 d.p.f.時戈次，我們發(fā)現(xiàn)NA神經(jīng)元在c?ruleus 45位點的數(shù)量(補充圖S9F)和位置(補充圖S9A—D)相似轩勘。我們對5-HT神經(jīng)元進行了類似的觀察。在斑馬魚中怯邪，5-HT神經(jīng)元存在于中縫核绊寻、下丘腦腹側(cè)和間腦前簇。我們統(tǒng)計了每個簇中這些神經(jīng)元的數(shù)量(補充圖S10M)悬秉，但與對照魚相比澄步，在數(shù)量或形態(tài)上沒有觀察到顯著變化(補充圖S10A—L)。因此和泌，在候選神經(jīng)遞質(zhì)通路中驮俗，只有DA神經(jīng)元在lphn3.1變異幼蟲中出現(xiàn)紊亂。

圖S7 Lphn3-MO1幼蟲的DA水平和營業(yè)額沒有顯著變化允跑，但后結(jié)核中slc6a3陽性多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量減少。(A)高效液相色譜測量顯示搪柑，與Lphn3-CO相比聋丝，Lphn3-MO1中的DA水平或營業(yè)額(由DA/DOPAC比值顯示)沒有差異。經(jīng)t檢驗工碾，DA的NS p < 0.58, DA/DOPAC的NS p < 0.65弱睦。誤差柱均為±SEM。(B) Lphn3-CO和Lphn3-MO1幼蟲后結(jié)核3dpf (n=4)和6dpf (n=5) th陽性細胞數(shù)量的定量渊额。t檢驗***p < 0.001况木。(C- j)與Lphn3-CO (A,C,E,G)相比，注射Lphn3-MO1 (B,D,F,H)幼蟲后結(jié)核中多巴胺能神經(jīng)元slc6a3原位標記的減少旬迹。下面板(E-H)顯示上面板(A-D)的高倍圖像火惊。在進行slc6a3染色之前，所有分析的變形體都被證實在6dpf處過度活躍奔垦。

圖S8 后結(jié)核th陽性多巴胺能神經(jīng)元減少與多動癥相關(guān)屹耐。(A)注射CO(黑色)和MO1(紅色)的種群在30分鐘內(nèi)單個動物的總行程(每條魚用一個點表示)。藍色虛線表示Lphn3-CO種群的平均運動水平和最大運動水平椿猎。根據(jù)其運動水平將幼蟲分為3組惶岭，2組和3組幼蟲的活動水平分別高于和低于Lphn3-CO動物的平均活動水平，1組幼蟲的游動水平高于最活躍的Lphn3-CO動物犯眠。(B)各組幼蟲后結(jié)核th陽性細胞數(shù)量定量按灶。將細胞分為吻側(cè)簇(1/2/3)、中間簇(4/5)和尾側(cè)簇(6/7/8)進行計數(shù)(見圖3k)筐咧。2組和3組Lphn3-CO幼蟲細胞計數(shù)無顯著差異鸯旁。2組CO vs 3組CO，種群1/2/3;NS p < 0.58;第2組CO vs第3組CO，種群4/5;NS p < 0.23;第二組CO vs第三組CO羡亩，種群6/7/8;NS p < 0.89摩疑。1組幼蟲在所有三個集群中th陽性DA神經(jīng)元都顯著減少(這里與2組Lphn3-CO動物相比)。2組Lphn3-MO1幼蟲的DA細胞在4/5群體中顯著減少畏铆，但在1/2/3和6/7/8群體中沒有顯著減少雷袋。與3組Lphn3-CO幼蟲相比，3組Lphn3-MO1幼蟲在任何種群中DA細胞均未顯著減少辞居。(C) 1組Lphn3-MO1幼蟲后結(jié)核th陽性DA神經(jīng)元減少楷怒。(D,E)第2組Lphn3-MO1幼蟲(E)與第2組Lphn3-CO幼蟲(D)相比，第2組Lphn3-MO1幼蟲(G)與第3組Lphn3-CO幼蟲(F)相比瓦灶，第3組Lphn3-MO1幼蟲(G)后結(jié)核中th陽性DA神經(jīng)元無顯著差異(盡管突起束的厚度似乎有所減少)鸠删。箭頭(C-G)表示DA神經(jīng)元th陽性投射。

圖S9 藍斑的去腎上腺素能神經(jīng)元在過度活躍的幼蟲中表現(xiàn)正常贼陶。(A- d)冠狀面刃泡，背向上顯示6天后腦抗酪氨酸羥化酶(TH)抗體染色(A,B)。腹內(nèi)側(cè)壁(C,D)放大以突出藍斑(LC)碉怔。(C,D)表示th陽性神經(jīng)元烘贴。我們觀察到注射Lphn3-CO-(左)和注射lphn3 - mo1的魚之間沒有明顯差異。在進行TH染色之前撮胧，所有分析的變形體都被證實是過度活躍的桨踪。(E) 6dpf斑馬魚大腦示意圖。箭頭表示方向;豎條表示A-D中各部分的位置芹啥。(F)過度活躍和對照注射幼蟲藍斑區(qū)NA神經(jīng)元數(shù)量的定量(n=5)锻离。圖示:H、下丘腦墓怀、LC汽纠、藍斑、MO捺疼、延髓疏虫、OB、嗅球啤呼、P卧秘、蒼白球、PT官扣、后結(jié)核翅敌、TeO、視頂蓋惕蹄。

圖S10 Lphn3-MO1動物5-HT神經(jīng)元正常蚯涮。(A-F)注射Lphn3-CO (A,C,E)和Lphn3-MO1- (B,D,F)的幼蟲在3dpf時抗5- ht抗體染色相似治专。(G-L) 6dpf時注射Lphn3-CO (G,I,K)和Lphn3-MO1- (H,J,L)的幼蟲抗5- ht抗體染色相似。在進行5-HT染色之前遭顶，所有分析的6dpf變形體都被證實是過度活躍的张峰。所有面板顯示背側(cè)視圖，前向左棒旗。(M) 3dpf時變形幼蟲和對照幼蟲(n=5)中間腦前簇(Ptd)喘批、下丘腦前腹側(cè)(ant.vH)、下丘腦后腹側(cè)(post.vH)和上葉(SR)中5- ht陽性神經(jīng)元的數(shù)量铣揉。圖示:vH饶深，下丘腦;Ptd，保護間腦簇;SR逛拱，上拉斐爾核敌厘。

圖3 Lphn3-MO1幼蟲PT中DA神經(jīng)元分布發(fā)生改變。(a—j)抗酪氨酸羥化酶(TH)的背側(cè)圖抗體染色在3個D.P.F.(a-d)和6 D.P.F.(e-j)朽合。尾部(g,h)和吻側(cè)(i,j)PT區(qū)域的高倍視圖俱两。DA神經(jīng)元根據(jù)Rink和Wulliman的說法，子群被標記為1-7,43和星號表示減少曹步，缺失或可能錯位的種群Lphn3-MO1-injected幼蟲锋华。(k,l)后結(jié)核th陽性細胞群的卡通背照。Lphn3-CO魚顯示7與野生型幼蟲相似的不同種群的中腦DA神經(jīng)元(k)箭窜。注射lphn3-mo1的幼蟲減少了(紅色星號)后結(jié)核TH陽性神經(jīng)元(l)。

用于治療ADHD最有效的藥物之一是精神興奮劑MPH衍腥，一種類似安非他明的化合物磺樱，作用于DA轉(zhuǎn)運體。MPH被認為可以改善注意力和認知婆咸，導(dǎo)致患者包括沖動行為在內(nèi)的心理運動活動的二次減少竹捉。為了探討MPH是否也能挽救lphn3.1型體的過度活躍，我們用藥物處理幼蟲并測量運動尚骄。在第一次劑量反應(yīng)研究中块差，我們發(fā)現(xiàn)MPH在變形體中產(chǎn)生最大行為改變的濃度為10 mM(補充圖S11A)。接下來倔丈，我們比較了同一斑馬魚幼蟲在相同濃度的藥物治療前后的運動活動憨闰。以10 mM MPH處理Lphn3-CO動物減少了它們的休息時間(補充圖S11C)(CO vs CO+MPH;p<0.01)，但沒有導(dǎo)致其活性的顯著變化需五，無論是以距離游泳測量(圖4a鹉动，黑色條)(CO vs CO+mph;p=0.19)或速度(圖4c)(CO vs CO+MPH:p=0.36)。與之形成鮮明對比的是宏邮，MPH將Lphn3-MO幼蟲的游泳距離縮短至與Lphn3-CO對照動物相似的水平(圖4a)(MO1 vs MO1 +MPH:p<0.001;CO vs MO1+mph:p=0.4)泽示。在不改變Lphn3-MO1幼蟲休息時間(補充圖S11C)的情況下缸血，通過降低其運動速度(圖4c;MO1 vs MO1;p<0.05,CO vs MO1+mph;p=0.3)⌒瞪福總之捎泻，MPH治療的變形動物通過將其平均運動速度恢復(fù)到未治療的對照魚的水平，顯示出運動能力的矛盾減少埋哟，這讓人想起MPH對ADHD患者的影響笆豁。

一些患者的ADHD癥狀也可以通過選擇性NA再攝取抑制劑ATO 51-54治療得到改善，該抑制劑也間接調(diào)節(jié)能神經(jīng)傳遞定欧。在劑量-反應(yīng)曲線中渔呵，我們觀察到ATO處理后，注射Lphn3-CO和Lphn3-MO1的幼蟲的運動能力普遍下降砍鸠。然而扩氢，ATO對變形魚的影響通常比對照更強(補充圖S11B;Lphn3-CO vs Lphn3 MO1;p<0.001)。與MPH相似爷辱，我們在單個實驗中重新分析了ATO處理的效果录豺。我們使用了1 mM ATO，這是影響變形動物的最小劑量(補充圖S11B)饭弓。我們觀察到双饥，該處理對對照注射的幼蟲沒有顯著影響(圖4d，補充圖S11D)弟断。然而咏花，它挽救了lphn3-mo1注射的幼蟲的過度活躍，將游動距離減少到與對照魚相當(dāng)?shù)乃?圖4b;Lphn3-CO vs MO1-mph:p=0.46)阀趴，類似于在人類患者中看到的效果昏翰。與未經(jīng)處理的Lphn3-CO和Lphn3-MO1動物相比，這種鎮(zhèn)靜作用與平均游泳速度降低到未處理或處理的對照魚的水平(圖4d)以及變形體的休息時間增加有關(guān)(CO vs MO-字形ato:p<0.025;MO1 vs MO1+ATO:p<0.05;補充圖S11D)刘急。我們下一個探討了MPH和ATO治療降低lphn3.1相關(guān)過動的可能機制棚菊。以10 mm MPH或1 mm ATO處理野生型幼蟲1 h，測定lphn3.1和lphn3.2的表達水平叔汁。MPH和ATO對lphn3.1的表達均無影響统求。相反，MPH輕度但顯著地增加了lphn3.2的表達据块，而ATO處理沒有(補充圖S12)码邻。我們還分析了adhd治療藥物應(yīng)用對發(fā)育過程中酪氨酸羥化酶陽性PT DA神經(jīng)元形成的影響。10mMMPH或1mMATO處理野生型幼蟲6天(從0 d.p.f;補充圖S13B,C,F)另假，3天(從3天開始;補充圖S13D,G)或1小時(第6天;補充圖S13E,H)對PT中DA神經(jīng)元的位置和數(shù)量沒有整體影響(補充圖S13I)冒滩。綜上所述，這些結(jié)果表明浪谴，MPH和ATO對lphn3.1過度活躍的拯救可能不會發(fā)生在基因表達水平上(盡管ATO應(yīng)用后lphn3.2表達增加)开睡，也不會通過整體修改PT中DA神經(jīng)元的數(shù)量來實現(xiàn)因苹。

圖S11 哌醋甲酯和托莫西汀處理Lphn3-CO和Lphn3-MO1幼蟲的量效曲線。(A)顯示哌醋甲酯(MPH)治療后運動的劑量反應(yīng)曲線篇恒。數(shù)值描述了在1小時MPH處理(8 μ M, 10 μ M, 12 μ M, 15 μ M或20 μ M)后游泳距離變化的百分比扶檐。Lphn3-CO n=12, Lphn3-MO1 n=12。(B)托莫西汀(ATO)治療后運動的劑量反應(yīng)曲線胁艰。數(shù)值描述了1小時ATO處理(1μM, 5μM, 10μM, 15μM或20μM)后游泳距離變化的百分比款筑。Lphn3-CO n=12, Lphn3-MO1 n=12。(C) Lphn3-CO和Lphn3-MO1 6dpf動物在10μM MPH處理前后的5分鐘實驗總休息時間(n=12)腾么。10μM MPH處理后奈梳，Lphn3-CO的靜息時間明顯縮短。(D)注射Lphn3-CO-和Lphn3-MO1的幼蟲在1μM ATO處理前后的5分鐘實驗總休息時間(n=12)解虱。Lphn3-MO1+ATO幼蟲的休息時間增加攘须。誤差條均為±SEM， **p < 0.025殴泰， **p < 0.001, NS =無統(tǒng)計學(xué)意義

圖S12 實時PCR分析ATO和MPH處理后lphn3.1和lphn3.2的表達水平于宙。用1μM ATO或10μM MPH急性處理6天野生型幼蟲1小時，可以挽救行為悍汛，但不影響lphn3.1或lphn3.2的表達水平捞魁。柱狀圖顯示了基因表達水平相對于控制基因gapdh的比率。誤差條均為±SEM, lphn3.1對照vs MPH, NS p < 0.7;lphn3.1對照與ATO, NS p < 0.2;lphn3.2對照與MPH离咐， * p < 0.04;lphn3.2對照與ATO NS對照p < 0.1谱俭。t檢驗。

圖S13 ATO和MPH處理不改變后結(jié)核發(fā)育過程中多巴胺能神經(jīng)元的形成宵蛀。(A)試驗設(shè)計方案旺上。胚胎在固定前第0天、第3天或第6天分別用1μM ATO或10μM MPH處理1小時糖埋。第6天對所有幼蟲進行抗酪氨酸羥化酶抗體染色。(B)未經(jīng)處理的幼蟲后結(jié)核中多巴胺能神經(jīng)元的th標記窃这。(C-E)無論給藥時間點如何瞳别，1μM ATO處理對多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育均無影響。(F-H)無論給藥時間點如何杭攻，10μM MPH處理對多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育均無影響祟敛。(I)從第0天開始，對對照組兆解、ato處理組和mph處理組6日齡幼蟲后結(jié)核th陽性細胞數(shù)量進行定量分析馆铁。細胞分為吻側(cè)簇(1/2/3)、中間簇(4/5)和尾側(cè)簇(6/7/8)(見圖3k)進行計數(shù)锅睛。各組間DA神經(jīng)元數(shù)量無顯著差異埠巨。t檢驗历谍，CO vs ATO 1/2/3 NS p < 0.54;CO vs MPH 1/2/3 NS p < 0.38;CO vs ATO 4/5 NS p < 0.73;CO vs MPH 4/5 NS p < 0.69;CO vs ATO 6/7/8 NS p < 0.86;CO vs MPH 6/7/8 NS p < 0.96。

討論

在這項研究中辣垒，我們分析了lphn3.1的發(fā)育和行為功能望侈，lphn3.1是一種斑馬魚同源基因，與人類LPHN3基因同源勋桶，通過連鎖和精細定位分析在ADHD患者中被發(fā)現(xiàn)脱衙。這里提出的結(jié)果為全基因組基因鑒定研究提供了必要的驗證，并最終暗示LPHN3與ADHD的病因?qū)W有關(guān)例驹。斑馬魚基因組包含兩個LPHN3同源基因捐韩，lphn3.1和lphn3.2，這是硬骨魚基因組中額外的全基因組復(fù)制的結(jié)果鹃锈。在發(fā)育過程中荤胁，這兩個基因的表達譜似乎部分重疊。因此仪召，在兩個基因共表達的大腦區(qū)域寨蹋，lphn3.1的morpholino敲低可能會導(dǎo)致Lphn3總蛋白的亞形態(tài)減少(而不是完全喪失功能)。然而扔茅，為了證實這一假設(shè)已旧，還需要進一步研究同時下調(diào)lphn3.1和lphn3.2的影響。通過全基因組方法鑒定的基因包含多態(tài)性召娜，這些多態(tài)性最有可能導(dǎo)致基因活性的調(diào)節(jié)运褪，而不是功能的完全喪失。我們的數(shù)據(jù)表明玖瘸，攜帶LPHN3風(fēng)險的ADHD患者的表型維度haplotype 可能部分是由基因活性的不完全降低引起的秸讹。然而，為了直接解決這一問題雅倒，未來的實驗需要分析ADHD患者中發(fā)現(xiàn)的與疾病相關(guān)的LPHN3變異璃诀。我們的結(jié)果有幾個重要的含義。首先蔑匣，他們強調(diào)了lphn3.1在發(fā)育過程中建立準確的能量信號傳導(dǎo)方面的主要和必不可少的作用劣欢。在lphn3基因廣泛表達的情況下，這種特異性效應(yīng)是如何實現(xiàn)的裁良，DA系統(tǒng)發(fā)育的哪一步主要受Lphn3的控制凿将，以及哪些信號通路依賴于Lphn3的作用，將是未來需要解決的重要問題价脾。在這項研究中牧抵，我們分析了lphn3.1的發(fā)育和行為功能，lphn3.1是一種斑馬魚同源基因侨把，與人類LPHN3基因同源犀变，通過連鎖和精細定位分析在ADHD患者中被發(fā)現(xiàn)妹孙。這里提出的結(jié)果為全基因組基因鑒定研究提供了必要的驗證，并最終暗示LPHN3與ADHD的病因?qū)W有關(guān)弛作。

我們的結(jié)果有幾個重要的含義涕蜂。首先，他們強調(diào)了lphn3.1在發(fā)育過程中建立準確的能量信號傳導(dǎo)方面的主要和必不可少的作用映琳。在lphn3基因廣泛表達的情況下机隙，這種特異性效應(yīng)是如何實現(xiàn)的，DA系統(tǒng)發(fā)育的哪一步主要受Lphn3的控制萨西，以及哪些信號通路依賴于Lphn3的作用有鹿，將是未來需要解決的重要問題。高效液相色譜分析顯示谎脯，Lphn3-MO1和Lphn3-CO幼蟲腦內(nèi)DA水平和周轉(zhuǎn)量無顯著差異葱跋。這可能是因為我們在Lphn3-MO1中看到的DA神經(jīng)元形成的改變僅限于一個離散的神經(jīng)元簇，其改變可能不足以全局改變DA水平源梭。因此娱俺，Lphn3功能與能量信號之間的聯(lián)系需要以更高的分辨率進行研究，重點關(guān)注特定的大腦區(qū)域和/或投射废麻。Lphn3的表達在小鼠中也廣泛分布荠卷，但目前還沒有研究Lphn3功能喪失的模型。在秀麗隱桿線蟲發(fā)育過程中烛愧，嗜乳蛋白基因在控制組織極性的建立中也起著重要作用油宜。因此，我們目前的數(shù)據(jù)提供了嗜乳蛋白家族粘附-g蛋白偶聯(lián)受體蛋白參與早期發(fā)育的進一步證據(jù)怜姿。此外慎冤，由于MO只提供了基因活性的短暫敲低，我們的研究也加強了ADHD主要是一種神經(jīng)發(fā)育障礙的結(jié)論沧卢。

我們的研究結(jié)果還表明蚁堤，Lphn3功能的降低會引起斑馬魚幼蟲的強烈行為改變，其特征與ADHD患者中觀察到的多動/沖動表型相似但狭。這些特征包括穩(wěn)定增加的運動行為披诗、夜間多動和運動沖動性的爆發(fā)。lphn3.1突變體對ADHD特異性藥物的獨特反應(yīng)也表現(xiàn)為典型的ADHD行為熟空，MPH和ATO都能使突變體恢復(fù)到控制活性水平。MPH和ATO拯救lphn3.1變形體運動行為的機制搞莺，如ADHD患者息罗，尚不清楚。盡管MPH導(dǎo)致急性治療后lphn3.2表達水平升高才沧，但ATO治療并未影響這兩種基因的表達(補充圖S12)迈喉。MPH和ATO處理對發(fā)育過程中PT DA神經(jīng)元的形成也沒有明顯影響绍刮，即使在慢性藥物治療后也是如此(補充圖S13)。因此挨摸，MPH和ATO不太可能通過全局改變lphn3基因表達水平或通過使DA神經(jīng)元的發(fā)育正澈⒏铮化來改變adhd相關(guān)行為。為了更好地了解MPH和ATO處理前后的機制得运，需要進一步的實驗膝蜈，包括高效液相色譜測量，以更好地了解MPH和ATO修復(fù)Lphn3-MO1行為表型的機制熔掺。

結(jié)論

ADHD患者可能主要表現(xiàn)為注意力缺陷和伴隨的認知控制失敗饱搏，結(jié)果是多動癥和沖動性增加。在動物模型中評估注意力不集中是很復(fù)雜的置逻，我們目前無法在斑馬魚幼蟲中進行測量推沸。然而，在大多數(shù)ADHD患者中券坞，多動癥和沖動性增加的表型表達和我們在這里提出的數(shù)據(jù)強烈表明鬓催，lphn3.1變異幼蟲至少是一些ADHD相關(guān)運動內(nèi)表型的有效模型。最后恨锚，lphn3.1突變體可能為篩選新的ADHD治療策略提供一個有用的平臺宇驾。

基金：Merlin Lange得到了法國教育部獎學(xué)金的支持。LBC實驗室的工作得到了巴黎神經(jīng)科學(xué)學(xué)院(ENP)眠冈、ANR(卓越主席ANR-08-cec-001-01)飞苇、FRM(項目DPR 20081214424)、PIME項目蜗顽、斯倫貝謝協(xié)會(資助DLS/GP/LB090305)和歐盟項目NeuroXsys(資助協(xié)議FP7 2007-2013,no 223262)和ZF-Health(資助協(xié)議health-f1-2010-242048)的支持布卡。克勞斯-彼得·萊施實驗室的工作得到了德國科學(xué)研究委員會(DFG KFO 125,SFB 581和SFB TRR 58)和德國聯(lián)邦建筑與研究委員會(BMBF 01GV0605)的支持雇盖。

本文章原文：分子精神病學(xué)(2012)忿等，1-9&2012 Macmillan Publishers Limited

詳細網(wǎng)址：http://www.nature.com/mp