雜志：Translational Psychiatry

影響因子：6.8（2022-2023）

年份：2020

通訊作者：Robert J. Bryson-Richardson

通訊作者單位：School of Biological Sciences, Faculty of Science, Monash University, Clayton,

Australia

摘要

前言

注意缺陷多動(dòng)障礙(ADHD)是一種非常普遍的神經(jīng)發(fā)育障礙拳芙，影響了約5%的學(xué)齡兒童察藐，并在30-60%的病例中持續(xù)到成年。腦容量的減少也常常與這種疾病有關(guān)舟扎。

據(jù)估計(jì)分飞，遺傳因素占ADHD病因的約80%《孟蓿基因組全關(guān)聯(lián)研究(GWAS)的薈萃分析發(fā)現(xiàn)了幾種可能與ADHD有關(guān)的DNA變異譬猫，包括rs2294123讯檐，它映射到帶電多泡體蛋白7 (CHMP7)。此外染服，最近的大規(guī)模GWAS表明别洪，rs2294123處于顯著LD狀態(tài)，其中幾個(gè)snp顯示與ADHD有名義上的關(guān)聯(lián)(補(bǔ)充圖1肌索，補(bǔ)充表1)蕉拢。然而，缺乏對(duì)這些相關(guān)基因?qū)DHD發(fā)展貢獻(xiàn)的功能驗(yàn)證诚亚。通過(guò)候選基因和GWAS方法檢測(cè)到的大多數(shù)變異都映射到基因組的非編碼區(qū)域晕换∷峦鳎考慮到非編碼區(qū)在基因表達(dá)中發(fā)揮的廣泛作用申尤，將中性ADHD相關(guān)變異與致病/致病變異分離仍然是一個(gè)主要挑戰(zhàn)臼婆。

為了解決這個(gè)問(wèn)題牢撼，Tong等人開發(fā)了一個(gè)芯片管道括眠，優(yōu)先考慮與ADHD相關(guān)的一組非編碼單核苷酸多態(tài)性(snp)取具，用于功能分析绒疗。他們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)SNP (rs2294123, G→T)帝美，映射到CHMP7的5個(gè)UTR敏释，這與ADHD顯著相關(guān)库快。風(fēng)險(xiǎn)等位基因(T)的純合子與ADHD個(gè)體較低的神經(jīng)認(rèn)知功能、較高的ADHD癥狀特征以及與純合子G個(gè)體相比钥顽，CHMP7轉(zhuǎn)錄水平降低33%顯著相關(guān)义屏。這些發(fā)現(xiàn)表明，CHMP7表達(dá)的減少有助于ADHD表型蜂大，值得進(jìn)一步研究闽铐。

CHMP7在內(nèi)體分選、核膜形成中起重要作用奶浦，最近被認(rèn)為與脊髓和球性肌萎縮有關(guān)兄墅。它與運(yùn)輸所需的內(nèi)體分選復(fù)合體(ESCRT)家族成員ESCRT-III相互作用。幾個(gè)CHMP家族成員是ESCRT-III的一部分澳叉，與神經(jīng)發(fā)育過(guò)程有關(guān)隙咸，并且已知有助于神經(jīng)精神疾病的發(fā)展。這支持了進(jìn)一步研究CHMP7在ADHD中的作用的必要性耳高。

為了研究CHMP7與ADHD的功能相關(guān)性扎瓶，我們使用CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)生成了一個(gè)chmp7斑馬魚突變系，并假設(shè)chmp7雜合(chmp7+/-)動(dòng)物會(huì)模仿與ADHD相關(guān)SNP (rs2294123)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本減少泌枪。我們證明chmp7+/-魚比野生型(chmp7+/+)更活躍概荷，并且總腦容量減少，類似于ADHD病例的報(bào)道碌燕。此外误证，我們還表明继薛，通過(guò)應(yīng)用通常用于治療多動(dòng)癥的哌醋甲酯，可以顯著降低chmp7+/-魚的多動(dòng)癥愈捅。總的來(lái)說(shuō)遏考，我們已經(jīng)提供了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CHMP7作為ADHD的危險(xiǎn)因素。

材料和方法

根據(jù)MARP/2015/004/BC繁殖群體許可證蓝谨，魚在莫納什大學(xué)魚核心設(shè)施中飼養(yǎng)灌具。創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因品系獲得生物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)(BSCI/2015/07)批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)以野生型(t<s:1> bingen, TU)胚為背景進(jìn)行譬巫。

chmp7突變系的產(chǎn)生及基因分型：

為了創(chuàng)建chmp7突變斑馬魚系咖楣，根據(jù)Gagnon等人的研究，生成了靶向chmp7 (ENSDARG00000041362)外顯子2的引導(dǎo)RNA芦昔。將單細(xì)胞期胚胎注射含有150 ng/μL引導(dǎo)RNA诱贿、5μg/μL Cas9蛋白(PNA Bio, Newbury Park, CA, USA)、20μM STOP cassette咕缎、0.25μL Phenol Red珠十、0.25μL Cascade Blue (Molecular Probes, Waltham, MA, USA)和超純H2O的混合物，最終體積為2.5μL凭豪。選擇胚胎進(jìn)行Cascade Blue焙蹭，表明注射成功，在24 hpf下飼養(yǎng)至成年嫂伞。通過(guò)與TU魚的異交鑒定F0個(gè)建立者壳嚎，收集15~20個(gè)后代的DNA，并將匯集的DNA作為靶位點(diǎn)周圍區(qū)域PCR擴(kuò)增的模板末早。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法對(duì)異二聚體進(jìn)行可視化分析。將創(chuàng)始人與野生型魚進(jìn)行異交说庭，并利用PCR和凝膠電泳技術(shù)篩選F1個(gè)體是否存在突變然磷。使用Sanger測(cè)序確定突變。實(shí)驗(yàn)采用F3及其后代刊驴。引導(dǎo)rna和引物序列見補(bǔ)充表2姿搜。采用等位基因特異性KASP熒光法(LGC Biosearch Technologies, Teddington, Middlesex, UK)進(jìn)行基因分型。

整胚原位雜交：

為了生成檢測(cè)chmp7表達(dá)的探針捆憎，使用引物從基因組DNA中擴(kuò)增出chmp7片段(補(bǔ)充表2)舅柜，并將其克隆到pGEM-T Easy (Promega,Madison,WI,USA)中。使用chmp7和M13引物組合通過(guò)PCR確定序列方向(補(bǔ)充表2)躲惰。使用chmp7原位模板反向和pGEM-T Easy M13正向引物從質(zhì)粒中擴(kuò)增探針模板致份，并使用前面描述的T7 RNA聚合酶生成雙氧合核糖探針。按照Ruparelia等人的方法進(jìn)行全載原位雜交础拨。

PT-PCR：

RT-PCR檢測(cè)chmp7何時(shí)表達(dá)氮块。cDNA合成是在野生型胚胎的8和16體期(1绍载、1.5、2滔蝉、3击儡、4和5 dpf)提取的RNA上進(jìn)行的。使用制造商(Sigma,St.Louis,MO,USA)描述的TRIzol?試劑分離總RNA蝠引，并用DNAse(Promega)處理以去除可能的DNA污染阳谍。使用Superscript III第一鏈合成試劑盒(Invitrogen, Waltham, MA, USA)逆轉(zhuǎn)錄1μg總RNA。RT-PCR引物見補(bǔ)充表2螃概。PCR周期為:96°C初始變性周期2 min, 96°C矫夯、57°C、72°C 30個(gè)周期谅年，各30 s;最后在72°C下延長(zhǎng)5分鐘茧痒。25μL PCR產(chǎn)物在1% Tris-acetate-EDTA瓊脂糖凝膠上進(jìn)行可視化。

qPT-PCR：

采用qRT-PCR比較不同基因型間chmp7 mRNA的表達(dá)水平融蹂。在6 dpf時(shí)從chmp7+/+旺订、chmp7+/-和chmp7?/?胚胎中提取RNA，并在每個(gè)生物重復(fù)中與每個(gè)基因型的固定數(shù)量的魚(20-25)混合超燃。cDNA的制備方法如上所述区拳。采用Lightcycler 480 (Roche, Basel, Switzerland)和SYBR Green混合試劑(Roche)進(jìn)行qRT-PCR。以肌動(dòng)蛋白(actin)意乓、β 1 (actb1)樱调、18s核糖體RNA (18SrRNA)和真核翻譯延伸因子1α1 (eef1α1)的平均表達(dá)值為參考。引物見補(bǔ)充表2届良。每個(gè)生物重復(fù)進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)笆凌。使用廣義混合線性模型來(lái)檢查mRNA水平的差異。基因型檢驗(yàn)為固定效應(yīng)士葫，生物復(fù)制檢驗(yàn)為隨機(jī)效應(yīng)乞而。使用Satterthwaite估計(jì)自由度進(jìn)行F檢驗(yàn)。

24小時(shí)運(yùn)動(dòng)試驗(yàn):6 dpf：

斑馬魚的活動(dòng)水平在6 dpf時(shí)使用運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)來(lái)檢查幼蟲階段表現(xiàn)出自主運(yùn)動(dòng)的活動(dòng)慢显，同時(shí)仍然使用高通量行為試驗(yàn)爪模。在09:00-10:00之間收集胚胎，在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)14小時(shí)(09:00-23:00,300勒克斯±20勒克斯)和10小時(shí)(23:00-09:00荚藻，全黑暗)循環(huán)屋灌，直到6 dpf。第5应狱、6天09:00 ~ 10:00飼喂?jié)饪s草履蟲0.5 ml, 14:00~16:00每日更換培養(yǎng)基共郭。第6天14:00-16:00，將幼蟲轉(zhuǎn)移到24孔板上，每孔含有1.5 ml E3胚培養(yǎng)基(5 mm NaCl,0.17 mm KCl,0.33 mm CaCl,0.33 mm MgSO4)落塑，以適應(yīng)環(huán)境纽疟。在第6天22:30至22:50之間，將板轉(zhuǎn)移到Zebraboxes (Viewpoint,Lyon,France)憾赁。22:50關(guān)閉斑馬箱污朽，讓魚適應(yīng)黑暗10分鐘，23:00開始錄像龙考。實(shí)驗(yàn)在全黑暗條件下進(jìn)行24小時(shí)30分鐘蟆肆，之后處死胚胎并進(jìn)行基因分型。

24小時(shí)運(yùn)動(dòng)試驗(yàn):6 dpf時(shí)給藥：

為了檢驗(yàn)哌醋甲酯的作用晦款，如上所述進(jìn)行了運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)炎功。然而，在第6天22:00時(shí)缓溅，將150μL的dH2O(對(duì)照)或100μM的鹽酸三甲基哌醋酯(Tocris Bioscience, Bristol蛇损，英國(guó))添加到含有1.35 ml E3培養(yǎng)基和魚的孔中，得到每個(gè)孔1.5 ml和10μM哌醋酯的最終體積坛怪，如Lange等人所述淤齐。升高的蓋子用于防止蒸發(fā)，任何顯示冷凝的孔都從分析中移除袜匿。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中更啄，哌醋甲酯和載體隨機(jī)分布在整個(gè)培養(yǎng)皿中，研究者對(duì)第三方治療不知情居灯。在初始混合模型試驗(yàn)后去除盲板祭务。

24小時(shí)運(yùn)動(dòng)試驗(yàn):受精后6周和12周：

運(yùn)動(dòng)測(cè)定法用于檢測(cè)幼魚和成魚的活動(dòng)水平。用50 mM NaOH和1 M Tris-HCl (pH 7.5)從魚鰭剪片中提取DNA怪嫌，在3 dpf處進(jìn)行基因分型义锥，然后進(jìn)行基因分型。飼養(yǎng)周期為白天12 h岩灭，夜間12 h(分別為08:00-20:00和20:00-08:00)缨该。在第41天和第83天的12:00-14:00之間，將魚轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的水箱中適應(yīng)環(huán)境川背。在第41天和第83天的19:00到19:50之間，坦克被轉(zhuǎn)移到Zebracubes (Viewpoint蛤袒，每個(gè)系統(tǒng)9輛坦克)熄云。19:50關(guān)閉斑馬燈，讓魚適應(yīng)黑暗10分鐘妙真，20:00開始跟蹤缴允。基因型的位置隨機(jī)化，研究者對(duì)基因型不知情练般。視頻跟蹤在完全黑暗的情況下運(yùn)行24小時(shí)30分鐘矗漾，之后將魚放回魚缸。

視頻分析：

使用Ethovision (Noldus, version 14, Wageningen, Netherlands)分析視頻薄料。閾值為:移動(dòng)敞贡，1毫米/秒;停止，0.75 mm/秒;檢測(cè)閾值摄职，動(dòng)態(tài)減法誊役，深色，9谷市。使用體素平滑去除6 dpf分析中的誤差蛔垢，排除了每幀<0.04 mm和> 12 mm的運(yùn)動(dòng)。

運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析：

使用Microsoft Excel 2013 (Microsoft, Redmond, WA, USA)處理數(shù)據(jù)迫悠，使用SPSS Statistics 26 (IBM, Armonk, NY, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析鹏漆。數(shù)據(jù)按時(shí)間順序按10分鐘的順序排列。不包括長(zhǎng)度小于300秒的視頻的結(jié)尾時(shí)間點(diǎn)创泄。每條魚的活動(dòng)數(shù)據(jù)按小時(shí)匯總艺玲。通過(guò)將每條魚每小時(shí)的活動(dòng)與來(lái)自各自重復(fù)的所有魚每小時(shí)的平均活動(dòng)值進(jìn)行比較，確定每條魚每小時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)化值验烧。然后將基因型分配給單個(gè)魚板驳，并將基因型不明確的魚從分析中刪除。排除最初24小時(shí)后30分鐘的數(shù)據(jù)點(diǎn)碍拆。使用GraphPad Prism Version 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)中的線形圖對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化若治。

為了檢查活動(dòng)的差異，使用了混合線性模型感混。在6端幼、42和84個(gè)dpf運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)中，使用了時(shí)間和基因型的主要效應(yīng)弧满，以及時(shí)間與基因型的交互效應(yīng)婆跑。時(shí)間(h)的重復(fù)測(cè)量使用一階自回歸方差結(jié)構(gòu)對(duì)6 dpf試驗(yàn)進(jìn)行建模，對(duì)42 dpf和84 dpf試驗(yàn)使用對(duì)角方差結(jié)構(gòu)庭呜。采用斑馬箱跟蹤系統(tǒng)的隨機(jī)效應(yīng)滑进，以及按基因型分組的個(gè)體動(dòng)物。對(duì)歸一化數(shù)據(jù)應(yīng)用自然對(duì)數(shù)變換募谎，以滿足通過(guò)殘差檢查來(lái)檢查的正態(tài)性假設(shè)扶关。使用最大似然模型進(jìn)行F檢驗(yàn)，使用Satterthwaite估計(jì)自由度数冬。藥物治療試驗(yàn)采用時(shí)間节槐、治療和基因型的主要效應(yīng)，以及時(shí)間、基因型和治療的相互作用效應(yīng)铜异。所有時(shí)間點(diǎn)的兩兩比較均為雙尾比較哥倔，采用Bonferroni校正進(jìn)行多重比較。

共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)成像：

將chmp7+/-魚與綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的HuC報(bào)告基因(HuC:eGFP)轉(zhuǎn)基因(Tg)系雜交揍庄，飼養(yǎng)至成年咆蒿。Tg (HuC: eGFP);將chmp7+/-魚與chmp7+/-魚雜交，胚胎在含有200μM N-苯硫脲(PTU, Sigma)的E3中培養(yǎng)6 h以抑制黑素細(xì)胞的形成币绩，每48 h更換一次培養(yǎng)基蜡秽。胚胎在2 dpf下進(jìn)行熒光分選。在3 dpf時(shí)缆镣，用0.0016%的三卡因甲磺酸(Sigma)在E3中麻醉魚芽突，剪斷魚尾，提取DNA董瞻，按基因型對(duì)魚進(jìn)行分類寞蚌。為了檢查幼蟲期的腦容量，與運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)一致钠糊，在6 dpf時(shí)挟秤，胚胎再次麻醉，并將其置于含三卡因的E3中1%低熔點(diǎn)瓊脂糖中抄伍，置于0.8 mm氟化乙丙烯(FEP)管中(Bola, gr<s:1>斯菲爾德艘刚，德國(guó))〗卣洌基因型隨機(jī)化攀甚，研究者對(duì)基因型不知情。使用Thorlabs共聚焦顯微鏡(Newton, NJ, USA)岗喉， Olympus 20倍水浸1.0 NA物鏡(Tokyo, Japan)秋度，針孔25μm, 2.005μm/pixel，步長(zhǎng)= 1μm钱床，平均16幀荚斯。

大腦圖像配準(zhǔn)和分析：

使用Advanced Normalization Tools (ANTs)配準(zhǔn)軟件(3.0.0.0)實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)共聚焦堆棧的圖像配準(zhǔn)，該軟件運(yùn)行在莫納什大學(xué)的MASSIVE計(jì)算集群上查牌。使用Gupta等人描述的cobraZ腦容量分析軟件分析配準(zhǔn)圖像事期。除了總體積外，還使用廣義混合線性模型檢查了與已知ADHD個(gè)體中具有體積差異的人類大腦區(qū)域(端腦(pallium, pallium下纸颜，前連合)刑赶，丘腦和丘腦腹側(cè))相似的腦區(qū)域《茫基因型檢測(cè)為固定效應(yīng)，生物復(fù)制檢測(cè)為隨機(jī)效應(yīng)。采用Satterthwaite估計(jì)自由度進(jìn)行F檢驗(yàn)浊洞。多次比較的Bonferroni校正應(yīng)用于每個(gè)測(cè)試牵敷。

chmp7在整個(gè)發(fā)育早期都有表達(dá)

斑馬魚擁有人類CHMP家族基因所有成員的同源基因(補(bǔ)充圖2，補(bǔ)充表3)法希。更重要的是枷餐，斑馬魚的Chmp7蛋白與人類的序列同源性為51%，相似性為70%苫亦。為了確定chmp7在斑馬魚中的表達(dá)位置和時(shí)間毛肋，對(duì)野生型胚胎進(jìn)行了原位雜交和RT-PCR。我們觀察到屋剑，chmp7在受精后1天(dpf)在胚胎中普遍表達(dá)润匙，在大腦中表達(dá)水平較高，到2 dpf時(shí)更局限于頭部唉匾。在6 dpf時(shí)孕讳，僅在頭部和腎臟可見(圖1A)。RT-PCR顯示巍膘，chmp7在8-somite階段表達(dá)到至少5dpf(圖1B)厂财。

chmp7雜合子mRNA水平降低

在確認(rèn)在斑馬魚早期發(fā)育過(guò)程中可以檢測(cè)到chmp7表達(dá)后，使用CRISPR-Cas9基因組編輯對(duì)該基因進(jìn)行突變齐唆，導(dǎo)致外顯子2缺失7bp (補(bǔ)充圖3A)嗤栓。這導(dǎo)致增加了20個(gè)氨基酸，并在第142個(gè)氨基酸后面添加了一個(gè)終止密碼子(補(bǔ)充圖3B)箍邮。預(yù)計(jì)這將去除蔗糖非發(fā)酵蛋白7 (Snf7)結(jié)構(gòu)域茉帅，該結(jié)構(gòu)域是CHMP7的主要催化結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)與CHMP4B和ESCRT-III相互作用锭弊。

據(jù)預(yù)測(cè)堪澎，這種突變會(huì)觸發(fā)無(wú)義介導(dǎo)的衰變和蛋白質(zhì)的損失，而不是產(chǎn)生截?cái)嗟漠悩?gòu)體味滞。為了確定chmp7+/-魚是否減少了chmp7 mRNA樱蛤，從而模仿ADHD相關(guān)SNP的ADHD風(fēng)險(xiǎn)等位基因(T)純合個(gè)體的減少钮呀，對(duì)來(lái)自chmp7+/+， chmp7+/-和chmp7?/? 6dpf魚的cDNA進(jìn)行了定量實(shí)時(shí)PCR (qRT-PCR)昨凡∷祝混合線性模型顯示mRNA水平顯著降低(F=71.41 (2,4)， p=0.001便脊，圖2)蚂四，與chmp7+/+相比，chmp7+/-魚的chmp7 mRNA總量為53% (t=-5.13 (4)哪痰， p=0.007)遂赠，支持使用chmp7+/-魚作為與rs2294123純合子ADHD風(fēng)險(xiǎn)等位基因相關(guān)的CHMP7 mRNA水平降低模型(T)。

圖2 chmp7+/+晌杰、chmp7+/-和chmp7?/?胚胎的qRT-PCR跷睦。混合線性模型顯示基因型之間存在顯著差異(p = 0.001)乎莉。數(shù)據(jù)來(lái)自三個(gè)生物重復(fù)送讲，并歸一化為chmp7+/+值。中線=平均值惋啃，誤差柱=平均值的±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)哼鬓。

chmp7雜合幼蟲表現(xiàn)出多動(dòng)表型

鑒于chmp7+/-魚具有與CHMP7 ADHD風(fēng)險(xiǎn)等位基因純合的個(gè)體相似的chmp7 mRNA水平降低，我們研究了chmp7 mRNA水平降低是否會(huì)導(dǎo)致胚胎(6 dpf)边灭、幼年(42 dpf)和成年(84 dpf)階段的多動(dòng)表型异希。

chmp7+/+ (n=153)和chmp7+/-(n=131)在6 dpf時(shí)的斑馬魚活性被跟蹤了24小時(shí)，從受精后14小時(shí)(hpf)的第6天開始(圖3)绒瘦〕撇荆混合線性建模分析顯示了基因型的顯著主要影響(F=4.70 (1,287.06)， p=0.031)惰帽『┙担基因型與時(shí)間無(wú)交互作用(F=0.77 (23, 3543.20)， p=0.78)该酗。這表明授药，在24小時(shí)內(nèi)，chmp7+/-魚始終比chmp7+/+魚更活躍呜魄。

為了確定過(guò)度活躍的表型是否持續(xù)到幼魚和成魚階段悔叽，研究人員在24小時(shí)內(nèi)跟蹤了chmp7+/+和chmp7+/-魚的活性，從幼魚41天11hpf開始爵嗅，到成魚83天11hpf開始娇澎。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，幼魚(chmp7+/+睹晒， n = 41, chmp7+/-趟庄，n=50, F=0.29 (1,61.52)括细， p=0.59，補(bǔ)充圖4A)或成魚(chmp7+/+戚啥，n=30, chmp7+/-勒极，n=36, F=0.008 (1,60.55)，p=0.93虑鼎，補(bǔ)充圖4B)的基因型之間沒(méi)有顯著差異，這表明過(guò)度活躍的表型不會(huì)持續(xù)到幼蟲期键痛。

圖3 chmp7+/+ (n=153)和chmp7+/-(n=131)斑馬魚6 dpf胚胎24小時(shí)內(nèi)的活性分析炫彩。y軸顯示的是每個(gè)基因型每小時(shí)移動(dòng)的平均時(shí)間，單位是秒絮短。數(shù)據(jù)來(lái)自三個(gè)生物復(fù)制江兢。誤差條=±SEM。

chmp7雜合子的腦容量明顯更小

鑒于一貫報(bào)道的ADHD個(gè)體腦容量減少丁频，在泛神經(jīng)元熒光Tg(HuC:eGFP)背景下杉允，使用共聚焦顯微鏡在6 dpf下對(duì)chmp7+/+ (n=12)和chmp7+/-(n=12)斑馬魚頭部進(jìn)行活體成像(圖4A)。我們觀察到席里，與chmp7+/+魚相比叔磷，chmp7+/-魚的總腦容量減少了9.2% (F=11.49 (1,20)，p=0.018奖磁，單尾改基，圖4B)。然而咖为，我們沒(méi)有觀察到在特定選定的大腦區(qū)域有顯著差異(補(bǔ)充表4)秕狰。

圖4 chmp7雜合子在6 dpf時(shí)總腦容量減小。(A)Tg(HuC:eGFP)躁染、chmp7+/+ (n=12)和Tg(HuC:eGFP)鸣哀、chmp7+/-(n=12) 6 dpf魚的全腦最大強(qiáng)度投影。(B)與chmp7+/+魚相比吞彤，chmp7+/+魚的總腦容量顯著減少我衬。數(shù)據(jù)來(lái)自三個(gè)生物復(fù)制。中線=平均值备畦，誤差柱=±SEM低飒。

哌醋甲酯可顯著降低chmp7雜合子的過(guò)動(dòng)性

為了確定哌醋甲酯是否可以改善chmp7+/-魚的過(guò)度活躍，我們對(duì)chmp7+/++ dH2O (n=179)懂盐、chmp7+/-+ dH2O (n=160)褥赊、chmp7+/++10μM哌醋甲酯(n=171)、chmp7+/-+10μM哌醋甲酯(n=166)斑馬魚進(jìn)行了為期24小時(shí)的追蹤莉恼，從第6天開始拌喉，14 hpf速那。與chmp7+/-+dH2O魚相比，chmp7+/++dH2O魚在10小時(shí)夜間表現(xiàn)出過(guò)度活躍(圖5)尿背。然而端仰，chmp7+/-+哌醋甲酯魚的這種影響減弱。混合線性模型顯示基因型田藐、藥物治療和時(shí)間之間存在顯著的相互作用(F=1.60 (69, 8038.37)荔烧，p=0.001)。鑒于基因型和治療隨時(shí)間的顯著相互作用汽久，我們調(diào)查了不同時(shí)間組間的差異鹤竭。

與chmp7+/++ dH2O的魚相比，chmp7+/++ dH2O的魚在夜間大部分時(shí)間表現(xiàn)出顯著的多動(dòng)癥(第3小時(shí)景醇，p=0.002;第4小時(shí)臀稚，p=0.007;第5小時(shí)，p=0.013;第6小時(shí)三痰，p=0.020;第7小時(shí)吧寺，p=0.025;第8小時(shí)，p=0.014)散劫。施用哌甲酯逐漸降低chmp7+/-+哌甲酯魚的活性稚机，直至顯著低于chmp7+/-+ dH2O魚(第8小時(shí)，p=0.045)舷丹。此外抒钱，chmp7+/-+哌甲酯魚與chmp7+/++ dH2O魚在夜間大部分時(shí)間無(wú)顯著差異。這表明颜凯，施用哌甲酯足以顯著減少chmp7+/-魚的過(guò)度活躍谋币，其水平與野生型相當(dāng)。

圖5 chmp7+/+和chmp7+/-斑馬魚6 dpf胚胎在10μM鹽酸甲酯(MpH)或dH2O處理下24小時(shí)的活性分析症概。Y軸顯示的是每個(gè)基因型每小時(shí)移動(dòng)的平均時(shí)間蕾额，單位是秒。數(shù)據(jù)來(lái)自六個(gè)生物復(fù)制彼城。誤差條=±SEM诅蝶。

討論

斑馬魚正在成為一種有前途的神經(jīng)精神疾病模型。我們?cè)谶@里首次展示了斑馬魚模型的實(shí)用性和多功能性募壕，通過(guò)分析游泳活動(dòng)和腦容量作為ADHD的表型來(lái)驗(yàn)證ADHD遺傳關(guān)聯(lián)调炬。在6條dpf chmp7+/-魚中觀察到的多動(dòng)癥并沒(méi)有持續(xù)到成年，這證明了斑馬魚用于測(cè)試ADHD表型的時(shí)間進(jìn)展舱馅。斑馬魚也可以用來(lái)檢查ADHD患者通常觀察到的腦容量變化缰泡，為ADHD相關(guān)性提供解剖學(xué)證據(jù)。最后代嗤，對(duì)哌醋甲酯的反應(yīng)表明多巴胺(或去甲腎上腺素)信號(hào)的失調(diào)可能導(dǎo)致觀察到的多動(dòng)癥棘钞。此外缠借，考慮到哌甲酯的有效性在ADHD個(gè)體之間存在差異，使用斑馬魚來(lái)測(cè)試ADHD相關(guān)基因模型對(duì)藥物的反應(yīng)可能有助于了解藥物反應(yīng)的變異性宜猜。

chmp7+/-魚過(guò)度活躍的分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究泼返。考慮到chmp7+/-魚對(duì)哌甲酯治療的陽(yáng)性反應(yīng)姨拥，這提示多巴胺或去甲腎上腺素信號(hào)異常绅喉。雖然我們?cè)?span style=";padding: 0px;outline: 0px;max-width: 100%;letter-spacing: 0.578px;box-sizing: border-box !important;overflow-wrap: break-word !important">chmp7+/-魚中看到的表型可能與其他神經(jīng)遞質(zhì)途徑有關(guān)，但異常的多巴胺能信號(hào)傳導(dǎo)叫乌，尤其是多巴胺能信號(hào)傳導(dǎo)霹疫，一再與多動(dòng)癥相關(guān)。因此综芥，研究CHMP7在多巴胺信號(hào)傳導(dǎo)中的作用需要進(jìn)一步的研究。此外猎拨，在ESCRT-III蛋白的敲低膀藐、功能喪失和顯性負(fù)突變中可以看到神經(jīng)元修剪缺陷。鑒于CHMP7與ESCRT-III蛋白已知的相互作用红省，當(dāng)CHMP7 mRNA水平降低時(shí)额各，神經(jīng)元修剪也可能被破壞。因此吧恃，chmp7+/-魚的過(guò)度活躍表型可能是由于缺乏有效的神經(jīng)修剪虾啦，導(dǎo)致神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)成熟延遲，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)沖動(dòng)控制或運(yùn)動(dòng)控制/協(xié)調(diào)至關(guān)重要痕寓。這與多動(dòng)癥患者的神經(jīng)發(fā)育遲緩是一致的傲醉。

圖3和圖5所示的實(shí)驗(yàn)表明，與chmp7+/+相比呻率，chmp7+/-的魚明顯過(guò)度活躍硬毕。然而，在哌甲酯實(shí)驗(yàn)中礼仗，chmp7+/-+ dH2O對(duì)照組基本上重復(fù)了之前的活性實(shí)驗(yàn)吐咳，多動(dòng)癥僅限于夜間。這可能表明chmp7 mRNA的減少對(duì)睡眠模式而不是清醒時(shí)的認(rèn)知有更強(qiáng)元践、更一致的影響韭脊。這與多動(dòng)癥患者經(jīng)常出現(xiàn)的睡眠障礙，以及受試者之間和體內(nèi)晝夜節(jié)律的可變性是一致的单旁。此外沪羔，在果蠅中，多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或嗜乳蛋白的泛神經(jīng)元敲低中觀察到夜間過(guò)度活躍慎恒，這被認(rèn)為是多巴胺信號(hào)失調(diào)的特征任内。這強(qiáng)調(diào)了多巴胺失衡可能導(dǎo)致了chmp7+/-魚中觀察到的多動(dòng)表型撵渡。這與應(yīng)用甲基苯乙烯對(duì)表型的改善是一致的(圖5)。

結(jié)語(yǔ)

這項(xiàng)研究是同類研究中首次使用動(dòng)物模型對(duì)CHMP7作為ADHD風(fēng)險(xiǎn)基因進(jìn)行功能檢測(cè)死嗦。這也是通過(guò)GWAS鑒定的ADHD相關(guān)基因首次在斑馬魚中進(jìn)行功能驗(yàn)證趋距。我們?cè)谶@里證明了chmp7+/-魚是CHMP7 ADHD相關(guān)等位基因的合適模型，并且chmp7 mRNA水平的降低與多動(dòng)癥表型和腦容量減少有關(guān)越除。此外节腐，這種多動(dòng)癥可以通過(guò)哌甲酯治療得到緩解，這有助于我們了解藥物反應(yīng)性變異的特定ADHD危險(xiǎn)因素摘盆。更廣泛地說(shuō)翼雀，我們提倡使用斑馬魚來(lái)模擬最近從大規(guī)模GWAS中出現(xiàn)的大量ADHD候選基因。