雜志：Frontiers in?Cell and Developmental Biology

影響因子：5.5（2022-2023）

年份：2023

原文：Ma M, Brunal A A, Clark K C, et al. Deficiency in the cell-adhesion molecule dscaml1 impairs hypothalamic CRH neuron development and perturbs normal neuroendocrine stress axis function[J]. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 2023, 11: 1113675.

通訊作者：Y. Albert Pan

摘要

下丘腦中表達(dá)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)的神經(jīng)元是神經(jīng)內(nèi)分泌應(yīng)激反應(yīng)途徑(即下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。由于CRH神經(jīng)元的發(fā)育脆弱性會(huì)導(dǎo)致應(yīng)激相關(guān)的神經(jīng)和行為功能障礙梧宫，因此確定CRH神經(jīng)元正常和異常發(fā)育的機(jī)制至關(guān)重要接谨。在斑馬魚中，我們發(fā)現(xiàn)唐氏綜合征細(xì)胞粘附分子like-1 (dscaml1)是CRH神經(jīng)元發(fā)育的完整介質(zhì)塘匣，也是建立正常應(yīng)激軸功能所必需的脓豪。在dscaml1突變動(dòng)物中，與野生型對(duì)照相比忌卤，下丘腦CRH神經(jīng)元具有更高的crhb(斑馬魚中的CRH同源物)表達(dá)扫夜，細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞死亡減少埠巨。生理上历谍，dscaml1突變動(dòng)物具有較高的基線應(yīng)激激素(皮質(zhì)醇)水平和對(duì)急性應(yīng)激源的反應(yīng)減弱±崩荩總之，這些發(fā)現(xiàn)確定dscaml1是應(yīng)激軸發(fā)育的重要因素印蔬，并表明HPA軸失調(diào)可能有助于人類DSCAML1相關(guān)神經(jīng)精神疾病的病因?qū)W勋桶。

關(guān)鍵詞：下丘腦-垂體-腎上腺軸，斑馬魚，CRH神經(jīng)元例驹，下丘腦捐韩，發(fā)育

前言

下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)表達(dá)神經(jīng)元是神經(jīng)內(nèi)分泌應(yīng)激反應(yīng)通路的中樞調(diào)節(jié)器，在哺乳動(dòng)物中被稱為下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸或在魚類中被稱為下丘腦-垂體-腎間(HPI)軸鹃锈。當(dāng)暴露于環(huán)境干擾(即壓力源)時(shí)荤胁，與壓力相關(guān)的神經(jīng)輸入?yún)R聚到下丘腦CRH神經(jīng)元上，激活激素級(jí)聯(lián)屎债，最終導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素的釋放仅政，從而廣泛影響認(rèn)知、情感盆驹、代謝和免疫功能圆丹。

CRH神經(jīng)元的發(fā)育對(duì)HPA和HPI軸(統(tǒng)稱為應(yīng)激軸)的功能有深遠(yuǎn)的影響。CRH神經(jīng)元的發(fā)育擾動(dòng)躯喇，特別是在生命早期辫封，會(huì)導(dǎo)致CRH神經(jīng)元功能的長期變化。此外廉丽，嚙齒動(dòng)物模型表明倦微，CRH神經(jīng)元的失調(diào)會(huì)增加焦慮和抑郁樣表型。這些研究強(qiáng)調(diào)需要識(shí)別介導(dǎo)CRH神經(jīng)元發(fā)育的基因和分子正压，并確定發(fā)育擾動(dòng)如何影響應(yīng)激軸功能璃诀。

在發(fā)育早期，下丘腦CRH神經(jīng)元由腹側(cè)間腦的祖細(xì)胞產(chǎn)生蔑匣。分泌因子包括FGF10劣欢、SHH、bmp和Nodal首先定義下丘腦前背區(qū)域;在這個(gè)區(qū)域內(nèi)裁良，CRH神經(jīng)元逐漸由一系列關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子組合指定凿将，包括Fezf2、Otp价脾、Sim1牧抵、Arnt2和Brn2。一旦被指定侨把，CRH神經(jīng)元將經(jīng)歷進(jìn)一步的分化犀变，如神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生、突觸發(fā)生秋柄、表觀遺傳編程和細(xì)胞死亡获枝，以建立一個(gè)功能性的應(yīng)激反應(yīng)神經(jīng)回路。這些神經(jīng)元分化的后期階段是由膜定位的細(xì)胞粘附分子介導(dǎo)的細(xì)胞間相互作用形成的骇笔。然而省店，介導(dǎo)CRH神經(jīng)元發(fā)育信號(hào)的特定細(xì)胞粘附分子尚不清楚嚣崭。

為了解決這一知識(shí)缺口，我們使用斑馬魚作為模型懦傍。哺乳動(dòng)物HPA軸和硬骨動(dòng)物HPI軸的結(jié)構(gòu)和功能高度保守雹舀。在哺乳動(dòng)物中，主要參與hpa軸激活的CRH神經(jīng)元位于下丘腦室旁核(PVN)中粗俱。在硬骨魚(鰩魚)中说榆，神經(jīng)內(nèi)分泌視前區(qū)(NPO)與PVN具有同源性，NPO內(nèi)的CRH神經(jīng)元與其哺乳動(dòng)物的對(duì)應(yīng)區(qū)域具有相似的作用寸认。斑馬魚其他下丘腦區(qū)域(如中間下丘腦)的CRH神經(jīng)元也可能調(diào)節(jié)HPI軸签财。斑馬魚的一個(gè)獨(dú)特優(yōu)勢是其快速的外部發(fā)育。HPI軸的發(fā)育開始于受精后1-2天(dpf)废麻，應(yīng)激誘導(dǎo)的皮質(zhì)醇信號(hào)和行為可以在4-5 dpf觀察到荠卷。斑馬魚的快速發(fā)育和半透明使得在完整的、發(fā)育中的動(dòng)物中直接觀察CRH神經(jīng)元的發(fā)育成為可能烛愧。

在這項(xiàng)研究中油宜，我們研究了一個(gè)保守的神經(jīng)元信號(hào)分子-唐氏綜合征細(xì)胞粘附分子樣1(斑馬魚基因:dscaml1;小鼠基因:Dscaml1;人基因:DSCAML1;蛋白質(zhì):DSCAML1)。DSCAML1是脊椎動(dòng)物中兩個(gè)DSCAM家族成員之一怜姿，另一個(gè)是DSCAM慎冤。與無脊椎動(dòng)物的DSCAMs不同，脊椎動(dòng)物的DSCAMs沒有明顯的選擇性拼接沧卢。在哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜中蚁堤，DSCAML1阻止細(xì)胞之間的過度聚集并促進(jìn)發(fā)育中的細(xì)胞死亡。DSCAML1還可以改善突觸特異性和突觸數(shù)量但狭。在人類中披诗，DSCAML1的罕見變異與幾種神經(jīng)發(fā)育障礙有關(guān)，包括自閉癥譜系障礙立磁、皮質(zhì)異常和癲癇呈队。遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)研究也表明DSCAML1與暴力經(jīng)歷的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。然而唱歧，DSCAML1與應(yīng)力軸之間的關(guān)系尚不清楚宪摧。

我們之前利用斑馬魚研究了DSCAML1如何影響神經(jīng)通路和系統(tǒng)功能。我們發(fā)現(xiàn)dscaml1缺乏會(huì)導(dǎo)致各種生理和行為缺陷颅崩，包括色素沉著變深几于、光適應(yīng)變慢和眼球運(yùn)動(dòng)(掃視)變慢。有趣的是沿后，正如斑馬魚糖皮質(zhì)激素受體(gr)突變體所見沿彭，色素沉著變深和光適應(yīng)變慢也可能是由異常的糖皮質(zhì)激素受體信號(hào)引起的，這表明應(yīng)激軸可能在dscaml1突變體中功能失調(diào)得运。

在這里膝蜈，我們報(bào)道了斑馬魚的dscaml1缺乏會(huì)擾亂下丘腦CRH神經(jīng)元的發(fā)育并損害HPI軸的正常功能锅移。這些發(fā)現(xiàn)表明DSCAML1是應(yīng)激軸發(fā)育所必需的熔掺，并提高了應(yīng)激功能障礙導(dǎo)致人類DSCAML1相關(guān)疾病的可能性饱搏。

斑馬魚飼養(yǎng)：

所有年齡的斑馬魚在28.5°C的14/10光照/黑暗周期下飼養(yǎng)。胚胎和幼蟲在E3緩沖液(5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)中飼養(yǎng)置逻。本研究使用的斑馬魚均為AB和TL野生型混合背景(斑馬魚國際資源中心)推沸。在本研究中使用的階段(0-6 dpf)，性別不是一個(gè)相關(guān)變量券坞，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室斑馬魚在2周齡之前性別未分化鬓催。

轉(zhuǎn)基因和突變斑馬魚系：

dscaml1vt1功能缺失等位基因包含7個(gè)堿基對(duì)缺失，導(dǎo)致幀移位和過早停止密碼子恨锚。用于活體成像的動(dòng)物是純合子珠層(mitfa)突變背景宇驾，以防止色素的形成。小膠質(zhì)細(xì)胞RFP細(xì)胞系[Tg(mpeg1:Gal4;UAS:NTR-mCherry)]由杜克大學(xué)John Rawls博士提供猴伶。crhb:LoxP-RFP-LoxP-GFP系使用CRISPR介導(dǎo)的敲入產(chǎn)生课舍，如Kimura等人所述。crhb敲入位點(diǎn)的sgRNA序列為AGCTCGCGTCTGCGCAGAG他挎。所有組間比較(突變體與對(duì)照組)均在兄弟姐妹之間進(jìn)行筝尾。

RNA-seq和差異基因表達(dá)分析：

雜合dscaml1突變親本的后代在3.5-4 dpf時(shí)麻醉并收獲。使用RNA Miniprep Kit(Zymo)對(duì)動(dòng)物前半部分進(jìn)行RNA制備办桨。后半部分用于基因分型筹淫。每組分析3個(gè)生物重復(fù)，每個(gè)重復(fù)含有6-11只動(dòng)物的RNA呢撞。所有樣品的RIN≥8.0损姜，使用Illumina的TruSeq mRNA HT樣品準(zhǔn)備試劑盒(rs -122 - 2103;Illumina的NextSeq 75測序儀進(jìn)行后續(xù)的聚類生成和測序。序列數(shù)據(jù)處理殊霞、比對(duì)摧阅、讀取計(jì)數(shù)、映射和質(zhì)量控制如前所述進(jìn)行脓鹃。使用R-package DESeq2中的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR) (Benjamini-Hochberg)校正似然比檢驗(yàn)(LRT)檢驗(yàn)差異表達(dá)的顯著性逸尖。在FDR<0.01和0.001時(shí)，238個(gè)和116個(gè)基因的reads計(jì)數(shù)差異顯著瘸右。原始序列數(shù)據(jù)已存儲(chǔ)在NCBI的基因表達(dá)Omnibus中娇跟，可通過GEO系列登錄號(hào)GSE213858訪問。

熒光原位雜交和免疫組織化學(xué)：

采用前面描述的方法進(jìn)行了單次和雙次全載熒光原位雜交(FISH)太颤。探針使用DIG和熒光素RNA標(biāo)記混合物(Roche)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成苞俘。DIG和熒光素標(biāo)記探針采用抗DIG或抗熒光素pod共軛Fab片段(Roche)和Cy3或熒光素TSA-plus試劑(Akoya Biosciences)進(jìn)行檢測。crhb的質(zhì)粒模板由加州理工學(xué)院的David Prober博士提供龄章。dscaml1探針是按照前面的描述生成的吃谣。

如前所述進(jìn)行免疫組化乞封。小鼠抗ERK1/2(4696S;細(xì)胞信號(hào)技術(shù))「诒铮活化的caspase 3用兔抗裂解caspase 3 (559565;BD生物科學(xué))肃晚。細(xì)胞核用TOTO-3碘染色(ThermoFisher)。RFP用雞抗RFP (600-901-379S, Rockland)或兔抗RFP (PM005, MBL Life Science)染色仔戈。用rabbit anti-GFP (598, MBL Life Science)染色关串。CRH采用Salk研究所P. Sawchenko和J. Vaughan提供的兔抗CRH (PBL rC68)染色。所有FISH和免疫組化樣品均在1.5%低熔瓊脂糖溶液中置于玻璃底培養(yǎng)皿中(P50G-1.5-14-F;MatTek)监徘，并使用尼康A(chǔ)1直立共聚焦顯微鏡成像晋修。

皮質(zhì)醇提取及ELISA：

皮質(zhì)醇提取和ELISA的詳細(xì)方案在線提供(補(bǔ)充數(shù)據(jù)表S4)。在4.5 dpf時(shí)凰盔，根據(jù)dscaml1-/-動(dòng)物較深的色素沉著墓卦，將dscaml1?/?和對(duì)照動(dòng)物分開。每個(gè)培養(yǎng)皿中放置30-35只動(dòng)物進(jìn)行皮質(zhì)醇提取户敬。上午基線(無應(yīng)激)樣本采集時(shí)間為光照后15-30分鐘(08:15-08:45)落剪，下午樣本采集時(shí)間為14:30-16:00。高滲應(yīng)力和攪拌應(yīng)力實(shí)驗(yàn)時(shí)間為14:30-15:30山叮。針對(duì)每種基因型(dscaml1-/-和對(duì)照)和應(yīng)激條件(上午基線著榴、下午基線、攪拌應(yīng)激屁倔、滲透應(yīng)激)脑又，收集了6個(gè)生物重復(fù)，每個(gè)重復(fù)包含30只動(dòng)物锐借。每次實(shí)驗(yàn)都對(duì)突變體和對(duì)照動(dòng)物進(jìn)行并排測試问麸。

用自旋磁攪拌棒制造渦流水流，產(chǎn)生攪拌應(yīng)力钞翔。將一個(gè)小磁性攪拌棒放入100 mm培養(yǎng)皿中严卖，培養(yǎng)皿中含有35只動(dòng)物和20 mL E3培養(yǎng)基。攪拌棒在微孔板上以300轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)5分鐘布轿。通過增加培養(yǎng)基中的鹽濃度誘導(dǎo)高滲應(yīng)激哮笆。30只動(dòng)物置于8ml E3培養(yǎng)基中。然后汰扭，在培養(yǎng)基中加入2 mL預(yù)熱好的1.25 M NaCl稠肘，使終濃度為250 mM，靜置20 min萝毛。

按照Yeh等人的描述進(jìn)行樣品均質(zhì)和皮質(zhì)醇提取项阴。簡單地說，用冰冷的E3培養(yǎng)基快速固定5只dpf幼蟲笆包，然后在?80°C下快速冷凍环揽。收集完所有樣品后略荡，用乙酸乙酯(33211-1L-R;Sigma-Aldrich)。使用商用ELISA試劑盒測量皮質(zhì)醇濃度歉胶，遵循制造商的說明(500360;開曼群島化學(xué))汛兜。用微孔板閱讀器(FilterMax F3;MicroDevices)初始開發(fā)后90-120分鐘。

CRH神經(jīng)元的實(shí)時(shí)成像：

通過在胚胎1細(xì)胞期注射Cre mRNA誘導(dǎo)crhb:LRLG轉(zhuǎn)基因重組跨扮。為了實(shí)現(xiàn)CreER介導(dǎo)的部分重組序无，在1細(xì)胞期注射~30pg CreER mRNA验毡，在6 hpf (10 μM)的胚胎培養(yǎng)基中加入4-羥基他莫昔芬(4-OHT)衡创，然后在24 hpf的E3培養(yǎng)基中沖洗。為了實(shí)現(xiàn)Cre介導(dǎo)的完全重組晶通，約50pg體外轉(zhuǎn)錄Cre璃氢。將zf1 mRNA (#61391, Addgene)注射到胚胎中。

為了進(jìn)行共聚焦實(shí)時(shí)成像狮辽，3只dpf動(dòng)物用0.01%三卡因甲磺酸鈉(MS-222, Sigma)麻醉一也，包埋在1%低熔點(diǎn)瓊脂糖中，背側(cè)放在玻璃底培養(yǎng)皿內(nèi)的玻璃表面(P50G-1.5-14-F;MatTek)喉脖。然后用含有0.01%三卡因甲磺酸鹽(MS-222, Sigma)的E3培養(yǎng)基填充培養(yǎng)皿椰苟。在尼康A(chǔ)1共聚焦顯微鏡上每隔15或30分鐘采集共聚焦z堆棧，持續(xù)12小時(shí)树叽。

雙光子實(shí)時(shí)成像是在定制的布魯克雙通道雙光子顯微鏡上完成的舆蝴。可調(diào)諧鈦藍(lán)寶石激光器(變色龍視覺II;調(diào)到980 nm题诵，同時(shí)激發(fā)RFP和GFP洁仗。78只HPF動(dòng)物被麻醉并以與共聚焦活體成像相同的方式植入，但背部遠(yuǎn)離覆蓋玻璃性锭。分別在78赠潦、84、96草冈、108和120 hpf下成像(圖6A)她奥。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)后，將成像的幼蟲輕輕從瓊脂糖中取出怎棱，在正常晝夜循環(huán)下哩俭，在28.5°C的E3培養(yǎng)基中恢復(fù)。在最后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)之后蹄殃，為所有成像動(dòng)物制備基因組DNA并進(jìn)行基因分型携茂。

圖像處理和統(tǒng)計(jì)分析：

使用開源圖像處理軟件fiji對(duì)圖像進(jìn)行處理。對(duì)于FISH圖像诅岩，對(duì)圖像進(jìn)行卷積(kernel = 12)以增強(qiáng)細(xì)胞邊界讳苦，并使用ROI manager工具手動(dòng)標(biāo)記每個(gè)細(xì)胞的中心带膜。細(xì)胞數(shù)量等于每只動(dòng)物的roi數(shù)量。每個(gè)細(xì)胞的信號(hào)強(qiáng)度定義為給定動(dòng)物中所有roi信號(hào)強(qiáng)度的中位數(shù)鸳谜。使用ROI manager工具對(duì)crhb:LRLG動(dòng)物的RFP+細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)膝藕，不進(jìn)行卷積。對(duì)于共聚焦實(shí)時(shí)成像咐扭，使用降噪對(duì)圖像進(jìn)行預(yù)處理芭挽。尼康元素軟件中的AI功能。對(duì)于雙光子成像蝗肪，使用“正確3D漂移”功能對(duì)來自不同時(shí)間點(diǎn)的z堆棧進(jìn)行對(duì)齊袜爪。RFP和GFP通道之間的光譜重疊線性未混合。在斐濟(jì)薛闪，使用MTrackJ插件跟蹤單個(gè)細(xì)胞辛馆。

所有統(tǒng)計(jì)分析均在GraphPad Prism (Version 9)軟件中進(jìn)行。對(duì)于正態(tài)分布的數(shù)據(jù)豁延，采用參數(shù)檢驗(yàn)(t檢驗(yàn)或方差分析)昙篙。對(duì)于非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)(Mann-Whitney)诱咏。采用Holm-Sidak后驗(yàn)法對(duì)多重比較進(jìn)行校正苔可，并顯示調(diào)整后的p值。除非另有說明袋狞，所有數(shù)值均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示焚辅。當(dāng)p < 0.05時(shí)，認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)顯著硕并。

凋亡細(xì)胞(AC3+)的定量采用MAP-map定量和Z-Brain注釋法法焰，但使用Anti-AC3代替抗磷酸化的ERK1/2。所有MAP-map處理程序(如CMTK倔毙、MATLAB腳本)均按照Randlett等人的描述執(zhí)行埃仪。NPO在Z-Brain中沒有這樣的注釋，但“間腦- Otpb集群2”ROI符合NPO的定義陕赃，因?yàn)樗枥L了表達(dá)Otpb的視前區(qū)背側(cè)區(qū)域卵蛉。

dscaml1缺乏導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)分泌因子過度表達(dá)

為了獲得dscaml1缺失導(dǎo)致的分子變化的公正觀點(diǎn)，我們使用RNA測序(RNA-seq)比較了dscaml1純合突變(dscaml1?/?)和對(duì)照(野生型)組之間的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征么库。利用Illumina下一代測序儀對(duì)受精后3.5-4天(dpf) dscaml1?/?和對(duì)照幼蟲的cDNA進(jìn)行測序傻丝。使用至少兩倍變化的閾值和小于0.01的調(diào)整p值，我們確定了25個(gè)上調(diào)基因和79個(gè)下調(diào)基因(圖1A, 補(bǔ)充數(shù)據(jù)表S1)诉儒。

在dscaml1?/?動(dòng)物中上調(diào)的25個(gè)基因中葡缰，有7個(gè)是下丘腦或垂體中表達(dá)的分泌神經(jīng)肽/激素:促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素b(crhb)、甲狀旁腺激素2 (pth2)、生長肌動(dòng)素β (smtlb)泛释、可卡因和安非他明調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄物3 (cart3)滤愕、黑素原皮質(zhì)激素a (pomca)、精氨酸加壓素(avp)和spexin激素(spx)怜校。其中三個(gè)(crhb, avp, pomca)是HPI軸的核心調(diào)節(jié)因子间影。crhb編碼斑馬魚的CRH;avp編碼控制滲透壓、血壓的神經(jīng)肽AVP茄茁，并與CRH協(xié)同促進(jìn)皮質(zhì)醇釋放;pomca編碼促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)魂贬，這是觸發(fā)糖皮質(zhì)激素釋放的主要垂體激素。此外裙顽，兩個(gè)參與細(xì)胞凋亡的基因:BCL2凋亡調(diào)節(jié)因子b (bcl2b)和phorbol-12-肉豆蔻酸-13-乙酸鹽誘導(dǎo)蛋白1(pmaip1/noxa)上調(diào)付燥。用PANTHER進(jìn)行蛋白質(zhì)類分類分析，發(fā)現(xiàn)“細(xì)胞間信號(hào)分子”是最大的一類(4個(gè)基因锦庸，16%)(圖1B)机蔗。

與上調(diào)基因相比，dscaml1?/?動(dòng)物中下調(diào)的79個(gè)基因在功能上更加多樣化甘萧。用PANTHER進(jìn)行蛋白質(zhì)分類分析，發(fā)現(xiàn)最大的蛋白質(zhì)類別是代謝物相互轉(zhuǎn)換酶(12個(gè)基因梆掸，15.19%)扬卷、蛋白質(zhì)結(jié)合活性調(diào)節(jié)劑(9個(gè)基因，11.39%)酸钦、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(8個(gè)基因怪得，10.13%)和防御/免疫蛋白(6個(gè)基因，7.59%)(圖1C)卑硫。我們注意到79個(gè)下調(diào)基因中有30個(gè)(38%)在肝臟中高表達(dá)徒恋，其中10個(gè)基因參與先天免疫和補(bǔ)體級(jí)聯(lián)(圖1A, 補(bǔ)充數(shù)據(jù)表S2)。這些結(jié)果表明欢伏，dscaml1突變體可能會(huì)抑制肝功能和先天免疫入挣。

為了確定受dscaml1缺失影響的信號(hào)通路，我們使用統(tǒng)計(jì)富集檢驗(yàn)(PANTHER Classification System, version 17.0)分析了所有差異表達(dá)基因(p <0.01, 210個(gè)定位基因)硝拧。所有顯著富集(FDR < 0.05)的基因個(gè)體發(fā)生(GO)分子功能項(xiàng)都與親本GO項(xiàng)激素活性相關(guān)(圖1D)径筏。PANTHER通路分析還發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)顯著的應(yīng)激調(diào)節(jié)神經(jīng)肽，腺苷酸環(huán)化酶激活多肽1b (adcyap1b障陶，也稱為PACAP)顯著上調(diào)(0.66倍變化滋恬，調(diào)整后p < 0.0001)。

總之抱究，我們的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明恢氯，dscaml1缺乏導(dǎo)致神經(jīng)肽/激素信號(hào)的上調(diào)以及肝臟和先天免疫功能的下調(diào)。肝臟和免疫功能的抑制是應(yīng)激軸激活的標(biāo)志，這與參與應(yīng)激軸的主要神經(jīng)肽(crhb勋拟、avp遏暴、pomca和adcyap1b)的過度表達(dá)一致。

圖1 dscaml1缺陷斑馬魚的差異基因表達(dá)分析指黎。(A)與對(duì)照動(dòng)物相比朋凉，dscaml1?/?相對(duì)基因表達(dá)的火山圖。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)單獨(dú)的基因醋安，彩色點(diǎn)代表圖表上顯示的基因組步清。虛線表示顯著性水平(調(diào)整p < 0.01)和倍數(shù)變化(增加或減少2倍或更多)閾值(B, C)说敏。上調(diào)(B)和下調(diào)(C)基因的蛋白類分類分析。(D)分子功能顯著富集(p < 0.05)氧化石墨烯項(xiàng)表。

dscaml1缺失改變了NPO中CRH神經(jīng)元的發(fā)育

為了進(jìn)一步研究dscaml1突變體的應(yīng)激軸是否受到干擾纤虽，我們首先檢測了NPO中CRH神經(jīng)元的發(fā)育(CRHNPO神經(jīng)元)(圖2A)，這些神經(jīng)元位于背視前區(qū)渴邦，以crhb的表達(dá)為特征走触。我們重點(diǎn)研究了三個(gè)發(fā)育階段(2、3和5 dpf)叭首，它們跨越了NPO中crhb+神經(jīng)元首次出現(xiàn)(2 dpf)和應(yīng)激軸反應(yīng)(4-5 dpf)之間的時(shí)期习勤。所有比較均采用同胞對(duì)照。

使用熒光原位雜交(FISH)焙格，我們發(fā)現(xiàn)在2 dpf時(shí)图毕，dscaml1?/?和野生型(WT)動(dòng)物之間的crhb表達(dá)模式最初相似(圖2B, B ')。在3 dpf時(shí)眷唉，我們開始在dscaml1?/?動(dòng)物的NPO中看到較高的crhb表達(dá)(圖2C, C′)予颤，并且在5 dpf時(shí)，dscaml1?/?動(dòng)物的NPO中crhb表達(dá)仍然較高(圖2D, D′)冬阳。CRHNPO神經(jīng)元中crhb FISH信號(hào)強(qiáng)度的量化顯示蛤虐，與WT動(dòng)物相比，dscaml1?/?動(dòng)物中的crhb表達(dá)更高(圖2E)肝陪。每個(gè)細(xì)胞的信號(hào)強(qiáng)度因發(fā)育階段和基因型而有顯著差異驳庭，并且發(fā)育階段和基因型之間存在顯著的交互作用(雙向方差分析，補(bǔ)充表SI)见坑。配對(duì)與Holm-Sidak校正比較發(fā)現(xiàn)嚷掠，在3和5 dpf處顯著增加，但在2 dpf處沒有增加(圖2E)荞驴。

除了crhb表達(dá)水平的變化不皆，dscaml1缺失也增加了表達(dá)crhb的CRHNPO神經(jīng)元的數(shù)量。在WT動(dòng)物中熊楼，CRHNPO神經(jīng)元的數(shù)量隨著時(shí)間的推移而增加霹娄，從14.78個(gè)細(xì)胞(2 dpf)到18.85個(gè)細(xì)胞(3 dpf)到26.60個(gè)細(xì)胞(5 dpf)(圖2B-D, F)能犯。在dscaml1?/?動(dòng)物中，CRHNPO神經(jīng)元的數(shù)量以更高的速度增加犬耻，從12.67個(gè)細(xì)胞(2 dpf)到19.46個(gè)細(xì)胞(3 dpf)到36.39個(gè)細(xì)胞(5 dpf)(圖2B '踩晶，C '，D '枕磁，F(xiàn))渡蜻。分期和基因型之間存在顯著的交互作用(雙向方差分析，補(bǔ)充表SI)计济。采用Holm-Sidak校正的兩兩比較發(fā)現(xiàn)茸苇，dscaml1?/?和WT動(dòng)物在5 dpf時(shí)細(xì)胞數(shù)量顯著增加，但在2和3 dpf時(shí)沒有增加(圖2F沦寂，調(diào)整后的p值如圖所示)学密。

總的來說，我們發(fā)現(xiàn)與WT相比传藏，dscaml1?/?突變體中crhb表達(dá)和CRHNPO神經(jīng)元中細(xì)胞數(shù)量顯著增加腻暮。這些表型不是由于dscaml1?/?動(dòng)物的視覺缺陷，因?yàn)樵诤诎抵酗曫B(yǎng)的動(dòng)物中也觀察到類似的表型(補(bǔ)充數(shù)據(jù)表S1)毯侦】蘧福總之，這些發(fā)現(xiàn)表明dscaml1對(duì)CRHNPO神經(jīng)元的正常發(fā)育軌跡至關(guān)重要叫惊。

圖2 dscaml1缺失改變了CRHNPO神經(jīng)元的發(fā)育款青。(A)斑馬魚幼體大腦示意圖(側(cè)視圖)，吻側(cè)向左霍狰。NPO用藍(lán)色突出顯示。用于CRHNPO神經(jīng)元分析的成像平面顯示(淺藍(lán)色平面)(B-D’)CRHNPO神經(jīng)元的發(fā)育軌跡饰及，用crhb FISH(綠色)標(biāo)記蔗坯，并與抗erk1/2(洋紅色)共染色。在每個(gè)發(fā)育階段燎含，顯示了包含NPO的代表性共聚焦子堆棧宾濒，NPO(框狀區(qū)域)擴(kuò)大，顯示在右圖中屏箍，沒有ERK1/2共染色绘梦。野生型(WT)動(dòng)物如圖B、C和(D)所示赴魁。dscaml1?/?動(dòng)物如圖B’卸奉、C’和D’所示(E-F)每個(gè)細(xì)胞的信號(hào)強(qiáng)度(E)和細(xì)胞數(shù)量(F)的量化。多重比較校正后的p值如圖所示颖御。WT: n = 9 (2 dpf)榄棵， 13 (3 dpf)， 15 (5 dpf)。dscaml1?/?:n = 9 (2 dpf)疹鳄， 13 (3 dpf)拧略， 18 (5 dpf)。標(biāo)尺尺寸為20μm瘪弓。顯示了平均值垫蛆、標(biāo)準(zhǔn)誤差和校正后的p值。

dscaml1缺乏會(huì)損害下丘腦中部和吻側(cè)CRH神經(jīng)元的發(fā)育

為了測試其他下丘腦CRH神經(jīng)元是否受到與CRHNPO神經(jīng)元相似的影響腺怯，我們檢查了另外兩個(gè)表達(dá)CRH的下丘腦區(qū)域袱饭。在斑馬魚中，中間下丘腦(IH) CRH神經(jīng)元(CRHIH神經(jīng)元)調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)和對(duì)光的情緒效價(jià)的感知(圖3A)瓢喉。在5 dpf的IH中宁赤，我們沒有觀察到dscaml1?/?和WT動(dòng)物之間的crhb表達(dá)水平(FISH強(qiáng)度)有任何顯著差異(圖3B-D)。然而栓票，dscaml1?/?動(dòng)物的CRHIH神經(jīng)元數(shù)量明顯更高(未配對(duì)t檢驗(yàn)决左，圖3E)。

除了IH走贪，我們還在下丘腦吻側(cè)(RH)發(fā)現(xiàn)了一致的crhb表達(dá)(圖3F)佛猛。CRH神經(jīng)元在RH (CRHRH神經(jīng)元)中的作用尚不清楚，但它們可能參與了吻側(cè)下丘腦-視頂蓋通路坠狡。在5 dpf的RH中继找，與WT相比，dscaml1?/?動(dòng)物的CRHRH表達(dá)水平和CRHRH細(xì)胞數(shù)量都更高(未配對(duì)t檢驗(yàn)逃沿，圖3G-J)婴渡。因此，dscaml1在調(diào)節(jié)發(fā)育中的下丘腦CRH神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量方面是廣泛需要的凯亮，但dscaml1缺乏僅影響RH和NPO中crhb的表達(dá)边臼。

圖3 dscaml1缺失改變了下丘腦中部和吻側(cè)CRH神經(jīng)元的發(fā)育。(A)幼蟲大腦示意圖假消，IH以橙色突出顯示柠并。用于CRHIH神經(jīng)元分析的成像平面(淺藍(lán)色平面)所示。(B, C)用crhb FISH(綠色)標(biāo)記CRHIH神經(jīng)元富拗，并與抗ERK1/2(洋紅色)共染色臼予。顯示含有IH的代表性共聚焦亞層，IH(框狀區(qū)域)擴(kuò)大啃沪，顯示在沒有ERK1/2共染色的右圖中粘拾。圖B顯示W(wǎng)T腦，圖c顯示dscaml1?/?腦谅阿。(D - E)每個(gè)細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度(D)和細(xì)胞數(shù)量(E)的量化半哟。(F)幼蟲腦示意圖酬滤，RH以粉紅色突出顯示。用于CRHRH神經(jīng)元分析的成像平面為(淺藍(lán)色平面)寓涨。(G-H)用crhb FISH(綠色)標(biāo)記CRHRH神經(jīng)元盯串，并與抗ERK1/2(洋紅色)共染色。顯示含有RH的代表性共聚焦亞層戒良，RH(框狀區(qū)域)放大体捏，顯示在沒有ERK1/2共染色的右圖中。圖G顯示的是WT腦糯崎，圖h顯示的是dscaml1?/?腦几缭。(I-J)每個(gè)細(xì)胞的信號(hào)強(qiáng)度(I)和細(xì)胞數(shù)量(J)的量化。Dscaml1?/?:n = 18沃呢。標(biāo)尺尺寸為20μm年栓。顯示了平均值、標(biāo)準(zhǔn)誤差和p值薄霜。

dscaml1突變體減少了下丘腦的程序性細(xì)胞死亡

已知DSCAM家族蛋白通過促進(jìn)哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜PCD減少神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量某抓。此外，我們的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示惰瓜，dscaml1突變體表達(dá)更高水平的凋亡調(diào)節(jié)基因bcl2b和pmaip1(圖1A)否副。因此，我們假設(shè)dscaml1缺失可能損害發(fā)育中的下丘腦的PCD崎坊。

為了驗(yàn)證這一點(diǎn)备禀，我們使用抗活化的caspase 3 (AC3)抗體來標(biāo)記凋亡細(xì)胞。在野生型動(dòng)物中奈揍，我們看到神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在細(xì)胞凋亡曲尸，在3 dpf處達(dá)到峰值(圖4A-A”)，與先前使用TUNEL的結(jié)果一致男翰。我們發(fā)現(xiàn)队腐，與野生型同胞對(duì)照相比，dscaml1?/?動(dòng)物在3和5 dpf時(shí)ac3陽性細(xì)胞減少(圖4B-B”)奏篙。為了量化特定下丘腦區(qū)域的細(xì)胞死亡數(shù)量，我們使用Map-map計(jì)算和Z-Brain解剖圖譜迫淹。在這種方法中秘通，單個(gè)共聚焦圖像堆棧被注冊到Z-Brain參考大腦;然后按基因型分組，使用Mann-Whitney u統(tǒng)計(jì)量(WT n = 14;dscaml1?/?n = 21)敛熬。具有顯著z分?jǐn)?shù)的體素肺稀，要么在WT中較高(WT over dscaml1)，要么在dscaml1?/?中較高(dscaml1 over WT)应民，被映射到感興趣的區(qū)域(ROI)话原，每個(gè)ROI中的平均體素值被計(jì)算并使用綠-品紅色標(biāo)度顯示(綠色:在WT中較高;品紅色:dscaml1?/?較高(圖4C)夕吻。

總的來說，與dscaml1?/?(即許多綠色區(qū)域和很少的品紅roi)相比繁仁，整個(gè)大腦的WT中AC3信號(hào)更高涉馅。在Z-Brain中注釋的293個(gè)roi中，178個(gè)具有顯著的dscaml1信號(hào)WT(平均信號(hào)=1,384.90)的體素(WT over dscaml1 sheet黄虱，補(bǔ)充數(shù)據(jù)表S3)稚矿。相比之下，只有65個(gè)roi的體素在WT信號(hào)上具有顯著的dscaml1(平均信號(hào)= 84.23)(dscaml1 over WT sheet, 補(bǔ)充數(shù)據(jù)表S3)捻浦。

在下丘腦crhb表達(dá)區(qū)對(duì)應(yīng)的ROI中晤揣，NPO (Z-Brain ROI:間腦- otpb Cluster 2) (dscaml1信號(hào)上的WT = 5688.06;dscaml1 over WT信號(hào)= 0)，IH(間腦-中間下丘腦)(WT over dscaml1 signal = 673.56;dscaml1信號(hào)比WT = 36.40)朱灿， RH(間腦-下丘腦吻側(cè))(dscaml1信號(hào)比WT = 916.95;dscaml1 / WT信號(hào)= 0.70)與dscaml1?/?相比昧识，在WT中都有更高的AC3信號(hào)(圖4D-F)〉涟牵總之跪楞，這些結(jié)果表明，dscaml1-/-動(dòng)物的PCD降低可能導(dǎo)致下丘腦中CRH神經(jīng)元數(shù)量增加环疼。

dscaml1對(duì)正常的CRHNPO神經(jīng)元細(xì)胞死亡至關(guān)重要

為了進(jìn)一步確定dscaml1是否會(huì)影響下丘腦CRH神經(jīng)元的存活左胞，當(dāng)dscaml1?/?和WT動(dòng)物之間的細(xì)胞數(shù)量開始分化時(shí)寇仓，我們使用體內(nèi)延時(shí)成像技術(shù)在3至5 dpf時(shí)追蹤了單個(gè)CRHNPO神經(jīng)元的命運(yùn)。為了可視化活斑馬魚中的CRHNPO神經(jīng)元烤宙，我們使用crispr介導(dǎo)的基因組插入生成了CRHNPO敲入熒光報(bào)告系(圖5A)遍烦。在crhb的第一個(gè)外顯子上游35個(gè)堿基對(duì)處插入一個(gè)可切換的hsp-LoxP-RFP-LoxP-GFP盒，以RFP(默認(rèn))或GFP(直接重組)的表達(dá)來標(biāo)記內(nèi)源性表達(dá)crhb的細(xì)胞(圖5B)门烂。由此獲得的轉(zhuǎn)基因品系crhb:LoxP-RFP-LoxP-GFP (crhb:LRLG)的RFP和GFP表達(dá)模式與其他報(bào)道的內(nèi)源性crhb轉(zhuǎn)錄物表達(dá)模式相匹配(圖5C, D)乳愉。為了驗(yàn)證熒光報(bào)告基因表達(dá)的保真度，我們檢測了NPO中crhb:LRLG標(biāo)記的細(xì)胞是否表達(dá)CRH蛋白屯远。在未暴露于Cre(默認(rèn)RFP表達(dá))的動(dòng)物中蔓姚，我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)RFP+神經(jīng)元呈CRH免疫陽性(84.71%±2.19%，補(bǔ)充圖2a - b)慨丐∑缕辏總之，這些結(jié)果表明房揭，crhb:LRLG系可靠地標(biāo)記了CRHNPO神經(jīng)元备闲。

在crhb:LRLG動(dòng)物中，dscaml1缺失增加了RFP標(biāo)記的CRHNPO神經(jīng)元的數(shù)量(圖5E-F’)捅暴。發(fā)育階段和基因型之間存在顯著差異恬砂，無顯著相互作用(雙向方差分析，補(bǔ)充表SI)蓬痒。dscaml1突變體在5 dpf時(shí)RFP陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增加泻骤，而在3 dpf時(shí)則沒有(圖5G，采用Holm-Sidak校正的多重比較檢驗(yàn))梧奢。這一結(jié)果證實(shí)了我們的crhb FISH結(jié)果狱掂，即dscaml1突變體中CRHNPO神經(jīng)元數(shù)量增加(圖2F)。

利用crhb:LRLG線亲轨，我們首次對(duì)麻醉動(dòng)物進(jìn)行了延時(shí)成像趋惨。我們在1細(xì)胞期將CreER mRNA注射到crhb: LRLG動(dòng)物中，并加入4-羥基他莫昔芬(4-OHT)在6-24 hpf下激活CreER惦蚊，從而誘導(dǎo)CreER部分介導(dǎo)重組(圖5B)器虾。在3-4 dpf處，共聚焦成像可以在NPO中看到混雜的GFP+和RFP+細(xì)胞(圖5H-H”和補(bǔ)充視頻S1)蹦锋。隨著時(shí)間的推移曾撤，一些被標(biāo)記的細(xì)胞離開了CRHNPO神經(jīng)元簇。正如之前在斑馬魚研究中看到的那樣晕粪，這些細(xì)胞很可能是被小膠質(zhì)細(xì)胞帶走的垂死細(xì)胞。為了證實(shí)這一點(diǎn)渐裸，我們在所有crhb: LRLG標(biāo)記的細(xì)胞中誘導(dǎo)GFP表達(dá)(通過注射密碼子優(yōu)化的Cre mRNA)巫湘，并用mpeg1:mCherry轉(zhuǎn)基因標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞(圖5-i-i”和補(bǔ)充視頻S2)装悲。事實(shí)上，mCherry+小膠質(zhì)細(xì)胞向GFP+細(xì)胞簇遷移尚氛，吞噬GFP+CRHNPO神經(jīng)元诀诊，并帶走被吞噬的細(xì)胞。在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)大液泡內(nèi)可以看到被吞噬細(xì)胞的殘余(圖5J, J′)阅嘶。這種類型的吞噬事件發(fā)生在3.5-4 dpf之間的5只動(dòng)物中有3只属瓣。這些結(jié)果表明，CRHNPO神經(jīng)元經(jīng)歷了PCD讯柔，死亡細(xì)胞被小膠質(zhì)細(xì)胞迅速移除抡蛙。

圖5 CRHNPO神經(jīng)元的熒光標(biāo)記和實(shí)時(shí)成像。(A) CRISPR介導(dǎo)的hsp-Lox-RFP-Lox-GFP盒在位于crhb外顯子1上游35bp的sgRNA靶點(diǎn)上的敲入示意圖魂迄。插入的方向和連接結(jié)構(gòu)尚未確定粗截。(B) crhb:LRLG表達(dá)示意圖。每個(gè)圓圈代表一個(gè)熒光細(xì)胞捣炬。沒有Cre(默認(rèn))熊昌，RFP在所有細(xì)胞中表達(dá)。完全重組后湿酸，所有細(xì)胞均表達(dá)GFP婿屹。部分重組導(dǎo)致了馬賽克RFP和GFP標(biāo)記。(C)部分重組的固定5 dpf crhb:LRLG幼蟲的背視圖推溃，用抗rfp(品紅色)和抗gfp(綠色)染色昂利。框內(nèi)區(qū)域標(biāo)記NPO美莫。(D) NPO的高倍圖像页眯。RFP和gfp陽性神經(jīng)元均可見。(E-F’)未重組的抗rfp染色crh:LRLG動(dòng)物圖像厢呵。圖中顯示了代表性的WT (E-E ')和dscaml1?/?(F-F ') NPO神經(jīng)元窝撵。(G) rfp陽性細(xì)胞在3和5 dpf時(shí)的定量。WT: n = 5 (3 dpf)襟铭， 16 (5 dpf)碌奉。dscaml1?/?:n = 11 (3 dpf)， 17 (5 dpf)寒砖。顯示了平均值赐劣、標(biāo)準(zhǔn)誤差和校正后的p值。(H-H”)部分重組的crhb:LRLG活幼蟲在72 ~ 84 hp成象哩都。這里顯示了三個(gè)時(shí)間點(diǎn)魁兼。兩個(gè)細(xì)胞(箭頭，一個(gè)綠色漠嵌，一個(gè)洋紅色)隨著時(shí)間的推移而消失咐汞。(I-I ")活體crhb:LRLG;mpeg1:Gal4;UAS:NTR-mCherry幼蟲盖呼，帶有GFP(綠色)標(biāo)記的CRH神經(jīng)元和mCherry(品紅)標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞。在這個(gè)圖像系列中化撕，一個(gè)CRH神經(jīng)元(箭頭)被小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬(I ')几晤，然后被移除(I ')。圖像是共聚焦光學(xué)切片植阴。(J, J ')顯示(I ')中框框區(qū)域的放大視圖的面板蟹瘾，有(J)或沒有(J ') mCherry通道。小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)仍能看到CRH神經(jīng)元的殘余(箭頭)掠手。比例尺尺寸為100 μm (C圖)或20μm(其他圖)憾朴。

接下來，為了追蹤單個(gè)CRHNPO神經(jīng)元的命運(yùn)惨撇，我們對(duì)部分cre介導(dǎo)重組的crhb:LRLG動(dòng)物進(jìn)行了3至5 dpf的雙光子成像(圖6A)伊脓。為了盡量減少應(yīng)激對(duì)PCD的潛在影響，我們在成像期間對(duì)動(dòng)物進(jìn)行麻醉和固定魁衙。在成像期間报腔，允許每只動(dòng)物在正常的光暗循環(huán)下，在12孔板的單個(gè)孔中恢復(fù)剖淀。在第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)(78 hpf)出現(xiàn)的細(xì)胞在隨后的四個(gè)時(shí)間點(diǎn)(84纯蛾、96、108和120 hpf)被跟蹤纵隔，并被分類為持續(xù)(在最后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn))或丟失(在以下任何時(shí)間點(diǎn)丟失)(圖6B-B“)翻诉。總體而言捌刮，我們觀察到dscaml1+/?和dscaml1?/?動(dòng)物中細(xì)胞損失減少的趨勢(卡方檢驗(yàn)趨勢碰煌，p = 0.0398)(圖6C，所示的跟蹤細(xì)胞總數(shù))绅作。在WT動(dòng)物中芦圾，16.41%的細(xì)胞丟失，而dscaml1+/-和dscaml1-/-分別為10.91%和7.53%俄认。

最后个少，考慮到細(xì)胞丟失的時(shí)間，我們繪制了每種基因型CRHNPO神經(jīng)元的存活曲線眯杏。同樣夜焦，在細(xì)胞丟失的趨勢上存在顯著差異(Logrank檢驗(yàn)趨勢，p=0.0098)岂贩， dscaml1?/?動(dòng)物一致顯示出更高的存活率(圖6D)茫经。綜上所述，這些結(jié)果表明dscaml1缺失降低了CRHNPO神經(jīng)元的PCD。

圖6 CRHNPO神經(jīng)元細(xì)胞命運(yùn)的實(shí)時(shí)跟蹤科平。(A)延時(shí)雙光子(2P)成像實(shí)驗(yàn)時(shí)間軸褥紫。4-OHT在6-24 hpf下誘導(dǎo)crhb:LRLG部分重組，并在78瞪慧、84、96部念、108和120 hpf下進(jìn)行成像弃酌。動(dòng)物在成像期間被短暫麻醉，并在成像期間恢復(fù)儡炼。(B-B”)單個(gè)CRHNPO神經(jīng)元的跟蹤妓湘。下面給出了三個(gè)時(shí)間框架示例。單個(gè)熒光細(xì)胞可以隨時(shí)間跟蹤乌询，并分為兩類:持續(xù)(白色箭頭)或丟失(粉紅色箭頭)榜贴。標(biāo)尺尺寸為20μm。(C)保留和丟失的CRHNPO神經(jīng)元百分比的量化妹田。每種基因型的樣本量(細(xì)胞數(shù))唬党。(D)各基因型組CRHNPO神經(jīng)元個(gè)體存活曲線。

應(yīng)激軸功能在dscaml1突變動(dòng)物中受到干擾

考慮到下丘腦CRH神經(jīng)元的發(fā)育擾動(dòng)以及與應(yīng)激軸激活相關(guān)的基因表達(dá)的全局變化鬼佣，我們接下來確定應(yīng)激軸的激素輸出-皮質(zhì)醇-是否被改變驶拱。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)對(duì)5只dpf動(dòng)物(每個(gè)樣本30只動(dòng)物，每種條件6個(gè)樣本)的勻漿進(jìn)行皮質(zhì)醇水平測定晶衷。所有動(dòng)物均在標(biāo)準(zhǔn)化條件下蓝纲，以相同的密度飼養(yǎng)，并具有正常的晝夜周期(14 h晝/10 h夜)晌纫。在這種晝夜節(jié)律周期下税迷，dscaml1突變動(dòng)物表現(xiàn)出與野生型動(dòng)物相似的晝夜運(yùn)動(dòng)節(jié)律。

在5 dpf時(shí)锹漱，對(duì)基線和應(yīng)激條件進(jìn)行測試箭养，以評(píng)估對(duì)照組(WT和dscaml1+/?)和dscaml1?/?組中皮質(zhì)醇的潛在變化。為了測量基線皮質(zhì)醇凌蔬，我們在光照后30分鐘(授時(shí)時(shí)間0,ZT0)和下午(ZT6-8)收集了未受干擾的動(dòng)物露懒。為了測量應(yīng)激誘導(dǎo)的皮質(zhì)醇，將動(dòng)物暴露在ZT6-8的攪拌應(yīng)激(旋轉(zhuǎn)水砂心，5分鐘)或高滲應(yīng)激(250 mM NaCl, 20分鐘)中懈词。這些急性應(yīng)激源具有良好的特征，可與斑馬魚幼蟲在自然棲息地中經(jīng)歷的水流和鹽度變化相媲美辩诞。

在基線時(shí)坎弯，dscaml1?/?動(dòng)物的皮質(zhì)醇水平明顯高于對(duì)照動(dòng)物(多重曼-惠特尼檢驗(yàn)，霍爾姆-西達(dá)克校正)。調(diào)整后的p值如圖7A所示抠忘。在ZT0時(shí)撩炊，dscaml1突變體的基線皮質(zhì)醇水平比對(duì)照組高2.7倍(中位數(shù)為350.06 pg/mL對(duì)129.80 pg/mL)。在ZT6-8時(shí)崎脉，皮質(zhì)醇的差異不太明顯拧咳，但dscaml1突變體在基線時(shí)的皮質(zhì)醇水平仍比對(duì)照組高2倍(中位數(shù)為238.51 pg/mL對(duì)118.52 pg/mL)。

在急性暴露于應(yīng)激源后囚灼，我們發(fā)現(xiàn)dscaml1突變動(dòng)物表現(xiàn)出減弱的皮質(zhì)醇誘導(dǎo)骆膝。我們通過將皮質(zhì)醇水平正常化到相同基因型在相同晝夜時(shí)間(ZT6-8)的基線皮質(zhì)醇水平來評(píng)估應(yīng)激誘導(dǎo)皮質(zhì)醇產(chǎn)生的程度灶体。在對(duì)照組中阅签，攪拌應(yīng)激和高滲應(yīng)激分別使皮質(zhì)醇比對(duì)照基線增加1.88倍和1.95倍(灰色條形圖，圖7B)(未歸一化的皮質(zhì)醇數(shù)據(jù)見補(bǔ)充圖S3)蝎抽。對(duì)高滲脅迫的響應(yīng)(p = 0.0113, Multiple Mann-Whitney test with Holm-Sidak correction)比攪拌脅迫產(chǎn)生的響應(yīng)更強(qiáng)(p = 0.0546)政钟。在dscaml1?/?組中，攪拌應(yīng)激和高滲應(yīng)激分別僅使皮質(zhì)醇比dscaml1?/?基線增加1.29倍和1.4倍(紅條樟结，圖7B)养交。這些增加無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(攪拌脅迫p >0.9999，高滲脅迫p = 0.9768)狭吼。

總之层坠，這些結(jié)果表明，dscaml1缺乏會(huì)提高皮質(zhì)醇的基線水平刁笙，損害對(duì)急性應(yīng)激源的反應(yīng)破花。這些發(fā)現(xiàn)表明dscaml1對(duì)于建立應(yīng)力軸的正常功能至關(guān)重要。

圖7皮質(zhì)醇水平和對(duì)外源性糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)疲吸。(A-B) 5只dpf幼蟲的皮質(zhì)醇譜座每。對(duì)于每個(gè)樣本(點(diǎn))，皮質(zhì)醇是從30只動(dòng)物的池中提取的摘悴。各組N=6峭梳。顯示了中位數(shù)、四分位數(shù)范圍和校正后的p值蹂喻。(A)對(duì)照組(黑色)和dscaml1?/?(紅色)動(dòng)物的基線皮質(zhì)醇葱椭。(B)對(duì)照(黑色)和dscaml1?/?(紅色)動(dòng)物基線標(biāo)準(zhǔn)化皮質(zhì)醇折疊變化。(C)定量CRHNPO神經(jīng)元中每個(gè)細(xì)胞的crhb信號(hào)強(qiáng)度口四。載體:n=10 (WT)孵运， 11 (dscaml1?/?)。Dex: n=7 (WT)蔓彩，11 (dscaml1?/?)治笨。顯示了平均值驳概、標(biāo)準(zhǔn)誤差和校正后的p值。

dscaml1突變體對(duì)糖皮質(zhì)激素有反應(yīng)

dscaml1突變體中應(yīng)激軸相關(guān)表型的某些方面類似于斑馬魚糖皮質(zhì)激素受體(gr)突變體旷赖。特別是顺又，gr和dscaml1突變體都表現(xiàn)出升高的基線皮質(zhì)醇和crhb。這種相似性提出了一種可能性等孵，即dscaml1突變表型可能是由于糖皮質(zhì)激素受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)不足造成的稚照。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們研究了dscaml1突變體是否能對(duì)外源性糖皮質(zhì)激素產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄反應(yīng)俯萌。我們檢查了crhb在NPO中的表達(dá)锐锣，因?yàn)樗艿教瞧べ|(zhì)激素-糖皮質(zhì)激素受體信號(hào)的反饋控制。野生型組作為對(duì)照绳瘟。

將合成的糖皮質(zhì)激素受體激動(dòng)劑地塞米松(dexamethasone, Dex)以2 μM的終濃度添加到胚胎培養(yǎng)基中，從4到5 dpf (24 h)姿骏。用載體(0.02%乙醇)處理的兄弟姐妹進(jìn)行比較糖声。對(duì)于CRHNPO神經(jīng)元中crhb轉(zhuǎn)錄水平，我們發(fā)現(xiàn)Dex處理和基因型導(dǎo)致了顯著差異分瘦，兩者之間存在顯著的相互作用(雙向方差分析蘸泻，補(bǔ)充表SI)。多次比較試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)嘲玫，Dex顯著降低了dscaml1?/?動(dòng)物的crhb轉(zhuǎn)錄物水平悦施，但在野生型動(dòng)物中沒有(Holm-Sidak校正，圖7C, p值如所示)去团。這些結(jié)果表明抡诞，dscaml1缺乏不會(huì)導(dǎo)致CRHNPO神經(jīng)元糖皮質(zhì)激素反應(yīng)性的喪失。相反土陪，dscaml1缺乏可能使動(dòng)物對(duì)糖皮質(zhì)激素的抑制作用更敏感昼汗。

討論

本研究證明dscaml1調(diào)節(jié)下丘腦CRH神經(jīng)元的發(fā)育，是正常應(yīng)激軸功能所必需的鬼雀。在轉(zhuǎn)錄組水平上顷窒，斑馬魚的dscaml1缺乏導(dǎo)致基因表達(dá)變化，表明應(yīng)激軸過度激活源哩。在細(xì)胞水平上鞋吉，我們發(fā)現(xiàn)dscaml1?/?下丘腦CRH神經(jīng)元增加應(yīng)激軸相關(guān)神經(jīng)肽(crhb)表達(dá)，增加細(xì)胞數(shù)量励烦，減少細(xì)胞死亡谓着。在生理上，dscaml1缺乏會(huì)損害正常的神經(jīng)內(nèi)分泌應(yīng)激軸功能崩侠，這可能是由下丘腦CRH神經(jīng)元發(fā)育缺陷以及激素/神經(jīng)肽信號(hào)的全身性改變引起的漆魔】篱荩總之，這些發(fā)現(xiàn)將DSCAML1與壓力軸的發(fā)展聯(lián)系起來改抡，并為人類DSCAML1相關(guān)精神健康狀況的潛在病因?qū)W提供了新的線索矢炼。

DSCAML1是一種新的CRH神經(jīng)元發(fā)育的細(xì)胞間信號(hào)分子

本研究的一個(gè)主要發(fā)現(xiàn)是DSCAML1是下丘腦CRH神經(jīng)元發(fā)育所必需的。據(jù)我們所知阿纤，DSCAML1是第一個(gè)與CRH神經(jīng)元發(fā)育有關(guān)的細(xì)胞間信號(hào)分子句灌。我們的發(fā)現(xiàn)也提供了DSCAML1和下丘腦發(fā)育之間的第一個(gè)聯(lián)系。我們發(fā)現(xiàn)欠拾，與視網(wǎng)膜神經(jīng)元類似胰锌，PCD對(duì)下丘腦CRH神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量的調(diào)節(jié)是一個(gè)dscaml1介導(dǎo)的過程。需要進(jìn)一步的研究來確定DSCAML1功能的其他方面藐窄，如細(xì)胞間距和突觸發(fā)生的調(diào)節(jié)资昧，是否參與CRH神經(jīng)元的發(fā)育。此外荆忍，考慮到dscaml1在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)格带，包括CRH神經(jīng)元和非CRH神經(jīng)元(補(bǔ)充圖S4)，解決DSCAML1是否在CRHNPO神經(jīng)元中細(xì)胞自主作用將是重要的刹枉。

DSCAML1對(duì)CRH神經(jīng)元細(xì)胞死亡的調(diào)控

在發(fā)育過程中叽唱，PCD對(duì)于消除瞬態(tài)細(xì)胞類型、匹配輸入和輸出細(xì)胞種群以及保持細(xì)胞間距至關(guān)重要微宝。據(jù)推測棺亭，下丘腦的PCD可能指定神經(jīng)回路組裝和形狀輸出活動(dòng)。與這一觀點(diǎn)一致的是蟋软，早期生活壓力導(dǎo)致的下丘腦PCD降低與成年后對(duì)急性壓力源的敏感性增加有關(guān)镶摘。

作為細(xì)胞間信號(hào)分子，DSCAML1可能轉(zhuǎn)導(dǎo)PCD的細(xì)胞外信號(hào)钟鸵。一個(gè)潛在的線索是突觸活動(dòng)钉稍，這對(duì)神經(jīng)元在發(fā)育過程中的存活至關(guān)重要。在培養(yǎng)中棺耍，DSCAML1定位于興奮性突觸贡未，當(dāng)過表達(dá)時(shí)抑制興奮性突觸發(fā)生。在CRH神經(jīng)元中蒙袍，DSCAML1缺失是否會(huì)增加興奮性突觸傳遞并激活活性依賴性細(xì)胞存活通路仍有待確定俊卤。

值得注意的是，CRH神經(jīng)元細(xì)胞死亡可能不是dscaml1影響CRH神經(jīng)元數(shù)量的唯一機(jī)制害幅。我們在dscaml1突變體中觀察到消恍，神經(jīng)祖細(xì)胞數(shù)量或增殖能力的變化可能有助于CRH神經(jīng)元數(shù)量的增加。此外以现，dscaml1缺失導(dǎo)致的crhb高表達(dá)可能導(dǎo)致更多的細(xì)胞被鑒定為CRH神經(jīng)元狠怨。需要進(jìn)一步的工作來確定這些因素在發(fā)育過程中如何控制CRH神經(jīng)元數(shù)量约啊。

DSCAML1缺陷動(dòng)物的應(yīng)激軸功能障礙

dscaml1?/?動(dòng)物在基線時(shí)表現(xiàn)出應(yīng)激軸激活的多種跡象，包括皮質(zhì)醇升高和免疫相關(guān)基因的抑制佣赖∏【兀基線皮質(zhì)醇水平升高可能導(dǎo)致對(duì)急性應(yīng)激源的反應(yīng)減弱，類似于慢性皮質(zhì)醇管理下的動(dòng)物憎蛤。這些表型的一個(gè)可能原因是crhb的過度表達(dá)外傅。在小鼠中，CRH的廣泛過度表達(dá)導(dǎo)致皮質(zhì)酮(嚙齒動(dòng)物的應(yīng)激糖皮質(zhì)激素)升高俩檬，并產(chǎn)生與庫欣綜合征相似的表型萎胰，庫欣綜合征是一種由皮質(zhì)醇過量產(chǎn)生引起的人類疾病。

除了下丘腦神經(jīng)元和CRH信號(hào)的功能障礙外棚辽，更廣泛的神經(jīng)失衡也可以激活應(yīng)激軸技竟。例如，癲癇發(fā)作已被證明會(huì)激活下丘腦軸屈藐，從而增加未來癲癇發(fā)作的可能性灵奖。據(jù)報(bào)道，Dscaml1突變大鼠和DSCAML1功能喪失變異體的人類患者表現(xiàn)出神經(jīng)元過度激活和癲癇發(fā)作估盘。因此，在斑馬魚dscaml1突變體中骡尽，下丘腦外區(qū)域的興奮-抑制不平衡可能導(dǎo)致下丘腦CRH神經(jīng)元放電增加遣妥。需要進(jìn)一步研究dscaml1的細(xì)胞類型特異性功能，以了解dscaml1?/?動(dòng)物應(yīng)激軸過度激活的確切原因攀细。

皮質(zhì)醇信號(hào)與CRH神經(jīng)元發(fā)育之間的相互作用

促進(jìn)和反饋是應(yīng)力軸的特征箫踩。當(dāng)CRH神經(jīng)元控制皮質(zhì)醇水平時(shí)，皮質(zhì)醇信號(hào)也影響CRH神經(jīng)元的發(fā)育谭贪。斑馬魚基因突變體具有與dscaml1-/-動(dòng)物相似的表型境钟，包括緩慢的視覺背景適應(yīng)、緩慢的光起反應(yīng)俭识、升高的皮質(zhì)醇和增加的crhb表達(dá)慨削。令人驚訝的是，dscaml1-/-動(dòng)物的糖皮質(zhì)激素受體信號(hào)并沒有減少(如在突變體中)套媚，而是具有完整的糖皮質(zhì)激素受體信號(hào)缚态，地塞米松對(duì)NPO中的crhb表達(dá)有很強(qiáng)的抑制作用。因此堤瘤，盡管表面上的表型相似玫芦，潛在的信號(hào)機(jī)制在dscaml1和gr突變體之間是不同的。

鑒于DSCAML1在調(diào)節(jié)突觸形成中的已知作用本辐，crhb表達(dá)的增加可能是由上游應(yīng)激相關(guān)神經(jīng)輸入的過度激活引起的桥帆。在嚙齒類動(dòng)物中医增，各種慢性應(yīng)激模式通常會(huì)導(dǎo)致PVN中CRH的上調(diào)。應(yīng)激相關(guān)突觸活動(dòng)引起的轉(zhuǎn)錄激活可能克服了糖皮質(zhì)激素受體信號(hào)介導(dǎo)的負(fù)反饋老虫。需要進(jìn)一步的工作來澄清皮質(zhì)醇紊亂和發(fā)育缺陷之間的關(guān)系叶骨。一種可能的方法是通過基因消融腎間細(xì)胞(即，基因腎上腺切除術(shù))和補(bǔ)充恒定水平的外源性皮質(zhì)醇來使皮質(zhì)醇水平正痴旁猓化邓萨。

結(jié)語

總之，本研究表明DSCAML1在調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌應(yīng)激軸的下丘腦神經(jīng)元的發(fā)育中是不可或缺的菊卷。我們將斑馬魚作為應(yīng)激軸發(fā)生的脊椎動(dòng)物模型缔恳，發(fā)現(xiàn)dscaml1的缺失會(huì)導(dǎo)致CRH神經(jīng)元缺陷和應(yīng)激軸功能障礙,進(jìn)而導(dǎo)致人們承受及調(diào)節(jié)壓力的能力失衡，導(dǎo)致抑郁和焦慮的發(fā)生洁闰。這項(xiàng)研究不僅揭示了壓力誘發(fā)抑郁焦慮的潛在機(jī)制途徑歉甚，也為多種精神疾病的治療帶來新的探索方向（包括智力障礙、自閉癥譜系障礙扑眉、精神分裂癥纸泄、癲癇和應(yīng)激障礙等疾病中均發(fā)現(xiàn)了DSCAML1缺陷，這些疾病的發(fā)生可能同樣和應(yīng)激軸的發(fā)育缺陷有關(guān)）腰素。

基金：本項(xiàng)目由聯(lián)邦研究商業(yè)化基金(ER14S-001LS to YAP)聘裁、弗吉尼亞-馬里蘭獸醫(yī)學(xué)院校內(nèi)研究基金、聯(lián)邦衛(wèi)生研究委員會(huì)撥款(# 208-06-21 to YAP)弓千、美國國立衛(wèi)生研究院(R01MH131820)和弗吉尼亞理工大學(xué)資助衡便。