原名：BDE-47 Causes Depression-like Effects in Zebrafish Larvae via a Non-Image-Forming Visual Mechanism

雜志：Environmental Science & Technology

影響因子：11.4（2022）

年份：2023

通訊作者：Ting Xu

摘要

抑郁癥是一種高發(fā)病率的情緒障礙音诫，常伴有睡眠障礙惨奕，可由非圖像形成（NIF）視覺系統(tǒng)觸發(fā)。因此竭钝，我們假設(shè)已知多溴化二苯醚可誘導(dǎo)視覺障礙梨撞，可以通過破壞NIF視覺通路來促進(jìn)抑郁。在本研究中香罐，將斑馬魚幼蟲暴露于環(huán)境相關(guān)濃度（2.5和25 μg/L）的BDE-47中卧波。BDE-47引起的黑視素基因主導(dǎo)了NIF視覺系統(tǒng)，在夜間下降（p < 0.05）庇茫，但在早晨上升（p < 0.05）港粱。這種雙向差異傳遞到視交叉上核中的時(shí)鐘基因和神經(jīng)肽，并影響了鄰近的血清素系統(tǒng)。然而查坪，抑郁的指示性因素寸宏，包括serta、htr1aa和aanat2偿曙，單向增加了1.3-1.6倍（p < 0.05）氮凝。它們與夜間趨同性增加（p < 0.05）和晝夜節(jié)律活動(dòng)減退（p < 0.05）相一致。黑視素拮抗作用的結(jié)果也表明望忆，這些結(jié)果可能是由于黑視素的直接光同步和由黑視素引起的晝夜節(jié)律中斷的結(jié)合罩阵。總的來說启摄，我們的研究結(jié)果顯示稿壁，BDE-47暴露破壞了NIF視覺通路，導(dǎo)致抑郁樣效應(yīng)鞋仍，這可能進(jìn)一步加深對(duì)健康影響常摧，如情緒障礙搅吁。

關(guān)鍵詞：黑視素威创，非圖像形成，抑郁谎懦，BDE-47肚豺，晝夜節(jié)律，睡眠

前言

抑郁癥是世界范圍內(nèi)最大的健康挑戰(zhàn)之一界拦，而抑郁癥的發(fā)病率在幾十年來不斷上升吸申。雖然單胺類神經(jīng)遞質(zhì)理論仍然是抑郁癥病理生理學(xué)中的主要假說，但單胺能藥物的有效性和可靠性還遠(yuǎn)不能令人滿意享甸。據(jù)此截碴，新的致病因素如晝夜節(jié)律被提出。抑郁癥患者通常表現(xiàn)出有規(guī)律的日間情緒變化和生理振蕩蛉威，以及睡眠障礙日丹。在一項(xiàng)研究中，超過三分之二的抑郁癥兒童經(jīng)歷了明顯的睡眠異常蚯嫌，而在另一項(xiàng)縱向流行病學(xué)研究中哲虾，兒童睡眠問題顯著預(yù)示著更高的抑郁水平。對(duì)于成年人來說择示，一項(xiàng)橫斷研究獲得了睡眠時(shí)間和抑郁之間很強(qiáng)的U型關(guān)聯(lián)束凑，表明睡眠不足和睡眠過度都可能顯著增加抑郁風(fēng)險(xiǎn)。時(shí)間療法栅盲，特別是光療法汪诉，也成為流行的臨床治療方法，可以獨(dú)立使用或與抑郁癥藥物一起使用谈秫。

光療法的原理利用了非圖像形成（NIF）視覺扒寄，這種新發(fā)現(xiàn)的視覺系統(tǒng)的功能不同于著名的圖像形成視覺拴签。NIF通路主要依賴于本質(zhì)上具有光敏性的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（ipRGCs），它們利用黑視素作為信號(hào)光色素旗们，并投射到十幾個(gè)大腦區(qū)域蚓哩。例如，帶有黑視素的ipRGCs可以直接光引導(dǎo)外側(cè)系帶和伏隔核的一些情緒相關(guān)的腦區(qū)域上渴，或通過主要靶點(diǎn)“主生物鐘”視交叉上核（硫氰酸鹽）影響這些區(qū)域岸梨。在上述過程中，黑視素通常與褪黑素建立聯(lián)系稠氮。褪黑激素是松果體釋放的一種與晝夜節(jié)律相關(guān)的激素曹阔，在夜間產(chǎn)生，以增加人類和日間動(dòng)物的睡眠傾向隔披。在一些抑郁癥患者中赃份，褪黑激素的分泌已被顯示為異常水平和相移，其合成也可以在短波長光下被夜間黑視素激活顯著抑制奢米。黑視素在情緒和晝夜節(jié)律障礙中的因果作用已被最近的光污染研究進(jìn)一步證實(shí)抓韩。因此，我們有理由合理地推測鬓长，這種視網(wǎng)膜-大腦通路會(huì)被化學(xué)污染物破壞谒拴。

多溴二苯醚（PBDEs）在受到斯德哥爾摩公約的限制之前，已被廣泛用作阻燃劑涉波。由于其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性英上，PBDEs仍然普遍存在于環(huán)境中。受污染水中的PBDEs含量高達(dá)29 μg/L啤覆，并且通常在生物群樣品中檢測到μg/g到mg/g干重水平苍日。因此PBDEs長期健康的后果仍然不可忽視。PBDEs的不良反應(yīng)多樣且復(fù)雜窗声，其特征是甲狀腺內(nèi)分泌紊亂相恃、生殖毒性和視力障礙。大量的研究都集中在PBDEs的神經(jīng)毒性上嫌佑，特別是在生命的早期階段豆茫。多項(xiàng)隊(duì)列研究報(bào)道了PBDEs與抑郁癥狀之間的關(guān)系，并觀察到顯著的正相關(guān)屋摇，特別是與2,2’揩魂，4,4’-四溴修飾苯醚（BDE-47）。值得注意的是炮温，在中國上海閔行的一項(xiàng)出生隊(duì)列研究中火脉，4歲兒童睡眠問題和較高的BDE-47血清水平之間存在一致的模式。在動(dòng)物研究中，PBDE損害了嚙齒動(dòng)物和斑馬魚中與抑郁相關(guān)的5-羥色胺能信號(hào)通路倦挂，包括干擾5-羥色胺能合成基因的轉(zhuǎn)錄和降低全身5-羥色胺（5-HT）水平畸颅。暴露于BDE-47的代謝物6-OH-BDE-47，也會(huì)導(dǎo)致斑馬魚幼魚大腦中5-HT免疫反應(yīng)神經(jīng)元的減少方援，同時(shí)TPH2（色氨酸羥化酶2）的表達(dá)減少没炒，TPH2是5-HT合成的限速酶。

視覺障礙是PBDEs毒理學(xué)作用的一種新興類別犯戏。有大量研究表明送火，急性或慢性暴露于多溴二苯醚可能損害斑馬魚的圖像形成視力，并干擾視覺引導(dǎo)行為先匪。因此种吸，多溴二苯醚很可能會(huì)破壞斑馬魚視覺系統(tǒng)的NIF功能。我們假設(shè)呀非，NIF系統(tǒng)的主要光色素黑視素是BDE-47的潛在靶點(diǎn)坚俗，其破壞可能進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到下游的晝夜節(jié)律系統(tǒng)和情緒，最終促進(jìn)抑郁岸裙。本研究旨在描述NIF系統(tǒng)在BDE-47暴露下的表現(xiàn)猖败，特別是在白天夜晚的差異下，并驗(yàn)證黑視素在促進(jìn)斑馬魚幼蟲抑郁樣效應(yīng)中的作用模式哥桥。

材料和方法

斑馬魚的維護(hù)

本研究采用了晝夜斑馬魚模型辙浑，因?yàn)樵诳紤]光感知和晝夜節(jié)律作為心理健康的危險(xiǎn)因素時(shí)激涤，它比夜間小鼠模型具有不可替代的優(yōu)勢(shì)拟糕。選擇4~6個(gè)月齡的健康野生型斑馬魚（AB菌株）進(jìn)行產(chǎn)卵。培養(yǎng)環(huán)境保持在28.5°C倦踢，14小時(shí)光照/10小時(shí)黑暗循環(huán)送滞，上午8點(diǎn)亮燈，晚上10點(diǎn)燈關(guān)閉辱挥。在第一個(gè)早晨光照后親代魚交配犁嗅，收集受精卵用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)方案均在同濟(jì)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)（TJAD00122102）的指導(dǎo)和批準(zhǔn)下進(jìn)行晤碘。

BDE-47的化學(xué)暴露

根據(jù)報(bào)告的BDE-47的環(huán)境水平褂微，將0.01% DMSO作為溶劑，BDE-47濃度設(shè)計(jì)為0园爷、2.5和25 μg/L宠蚂。在暴露期間，暴露溶液每天更新一半童社∏蟛蓿考慮到晝夜節(jié)律系統(tǒng)可能參與，我們收集晚上11點(diǎn)的5dpf斑馬魚和上午9點(diǎn)的6dpf斑馬魚用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。BDE-47的定量（在水和魚中）程序是基于我們之前的研究進(jìn)行了修改呀癣。

RNA提取和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）

每個(gè)暴露組約50只幼蟲美浦，進(jìn)行4個(gè)生物重復(fù)，然后均質(zhì)化進(jìn)行RNA提取和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)项栏。使用TRIzol試劑（Invitrogen浦辨，美國）提取總RNA后，按照制造商的說明沼沈，使用PrimeScript RT試劑試劑盒（Takara荤牍，日本）將樣品逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR熱循環(huán)過程包括10 min預(yù)變性庆冕，95°C 30 s康吵，60°C 30s，72°C 40 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)访递。采用2?ΔΔCt法計(jì)算化學(xué)暴露條件下基因與對(duì)照組相比的倍數(shù)變化晦嵌。

免疫熒光染色

每組3個(gè)生物重復(fù)，處理組收集30只幼蟲拷姿，進(jìn)行固定惭载，解剖，制備腦組織石蠟片响巢。VIP（血管活性腸肽）和AVP（精氨酸加壓素）神經(jīng)肽的一抗被用于共定位SCN描滔。下丘腦5-HT神經(jīng)元也被標(biāo)記為成像。采用ImageJ對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行量化和分析踪古。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

收集幼蟲含长，用PBS洗滌，以去除培養(yǎng)基中褪黑素的干擾伏穆。然后拘泞，對(duì)每個(gè)標(biāo)本加入PBS，以10 mg新鮮幼蟲重量與100 μL PBS的比例勻漿枕扫，12000rpm離心20 min陪腌。收集上清液，分別使用褪黑素Elisa試劑盒（mlbio烟瞧，China）和AANAT Elisa Kit（mlbio诗鸭，China），按照制造商的說明檢測褪黑素和AANAT酶的水平参滴。同時(shí)强岸，使用BCA蛋白檢測試劑盒（Beyotime，China）檢測5個(gè)生物重復(fù)的每個(gè)標(biāo)本上清液的總蛋白量卵洗。

原位雜交

詳細(xì)的程序遵循Monje和Kim的說明请唱，每個(gè)暴露組有3個(gè)重復(fù)弥咪。opn4.1的克隆探針模板的引物序列為CGTGTGAAAGAGAAGGACCT（正向）和CAGTGTCACTTACGTG-ACAG（反向）。

趨化實(shí)驗(yàn)

趨化試驗(yàn)用于測試斑馬魚幼魚在突然亮燈時(shí)的抑郁樣行為十绑。計(jì)算方法為黑暗期在外區(qū)總游泳時(shí)間的百分比（%）聚至，其趨同性水平與抑郁樣狀態(tài)呈正相關(guān)。每組至少有20只幼魚的行為數(shù)據(jù)本橙。斑馬魚幼蟲趨化性實(shí)驗(yàn)方案是遵循Schnorr等人的工作扳躬。

睡眠/覺醒行為

考慮到睡眠障礙是抑郁癥的核心癥狀之一，在臨床試驗(yàn)和動(dòng)物研究中測量抑郁癥時(shí)甚亭，通常會(huì)報(bào)道觀察睡眠/覺醒狀態(tài)贷币。在斑馬魚中，“類似睡眠”的狀態(tài)可以被定義為“1分鐘的不活動(dòng)”亏狰。在5 dpf時(shí)役纹，3個(gè)處理組（每組32只）的幼蟲被轉(zhuǎn)移到96孔板上，每孔有1只幼蟲暇唾。在平板上適應(yīng)4小時(shí)后促脉，使用斑馬魚跟蹤模塊連續(xù)測試斑馬魚幼魚的睡眠/覺醒行為。光/暗循環(huán)與繁殖環(huán)境保持一致（光照14小時(shí)：黑暗10小時(shí)）策州，以及穩(wěn)定的環(huán)境溫度（28.5°C）瘸味，以減少蒸發(fā)。

黑視素拮抗劑AA92593顯微注射

AA92593注入溶液固定濃度為10 μM够挂，溶解于DMSO中旁仿。各組均微注射拮抗試驗(yàn)，包括兩組注射對(duì)照組（溶于10%Hank溶液的0.01%DMSO）孽糖，另外兩組注射AA92593枯冈。注射行為對(duì)斑馬魚幼蟲的死亡率、畸形和孵化沒有明顯的影響梭姓。注射后霜幼，胚胎在0或25 μg/L BDE-47水暴露下培養(yǎng)。結(jié)果誉尖，拮抗試驗(yàn)中有4個(gè)處理組，包括空白注射對(duì)照組铸题、AA92593注射對(duì)照組铡恕、空白注射BDE-47暴露組、AA92593注射BDE-47暴露組丢间。

數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 22（IBM探熔，USA）和Matlab R2019b（MathWorks，USA）對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析烘挫。對(duì)照組與BDE-47處理組之間的顯著差異采用單因素方差分析（方差分析）計(jì)算诀艰，然后采用事后Dunnett多重比較檢驗(yàn)柬甥。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義定義為p<為0.05。最終數(shù)據(jù)以平均±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM）表示其垄。使用Origin 2022b（Originlab苛蒲，美國）繪制圖表。

結(jié)果

BDE47的暴露濃度

在水中暴露5天后绿满，2.5和25 μg/L 標(biāo)準(zhǔn)BDE-47暴露濃度實(shí)際分別下降到0.22和11.98 μg/L臂外。隨著暴露BDE-47量的顯著下降可能是由于PBDEs的高生物積累。據(jù)報(bào)道喇颁，在真實(shí)環(huán)境中漏健，BDE- 47在受污染的水中的水生濃度可高達(dá)29 μg/L，這有助于驗(yàn)證我們的濃度設(shè)置的環(huán)境相關(guān)性橘霎。同時(shí)蔫浆，5 dpf幼蟲的生物區(qū)系BDE-47水平在0.12?0.48μg/g范圍內(nèi)，與之前報(bào)道的魚類常見PBDE水平（0.562?1.61μg/g）相當(dāng)甚至更低姐叁。

BDE-47干擾了幼蟲的黑視素系統(tǒng)

我們首先仔細(xì)研究了BDE-47對(duì)斑馬魚幼蟲黑視素系統(tǒng)的影響（圖1）克懊。由于黑視素的晝夜節(jié)律相關(guān)功能，在實(shí)驗(yàn)中安排了兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)：6dpf斑馬魚上午9點(diǎn)（白天）和5dpf斑馬魚晚上11點(diǎn)（晚上）七蜘。幼蟲視網(wǎng)膜組織學(xué)異常在INL谭溉、PCL、OPL橡卤、GCL各層非常明顯（圖1A）扮念，并且在25 μg/L BDE-47暴露下，晝夜均觀察到PCL紊亂碧库。這與我們之前關(guān)于視覺視蛋白柜与、視桿狀細(xì)胞和視錐細(xì)胞受損的發(fā)現(xiàn)一致。此外嵌灰，在BDE-47暴露下弄匕，IPL層變厚。在轉(zhuǎn)錄水平上沽瞭，與具有單一黑視素基因的哺乳動(dòng)物相比迁匠，斑馬魚擁有兩組同源基因，非洲蟾蜍相關(guān)的opn4x（opn4xa和opn4xb)驹溃，在此不考慮城丧，以及哺乳動(dòng)物相關(guān)的opn4（opn4a、opn4b和opn4.1）豌鹤，它們被證實(shí)與人類OPN4基因同源亡哄。RT-PCR結(jié)果顯示，BDE-47暴露后opn4基因表達(dá)顯著降低（圖1B）布疙，第二天早上蚊惯，opn4a和opn4.1的表達(dá)量顯著增加愿卸。opn4.1的ISH檢測進(jìn)一步證實(shí)了其在視網(wǎng)膜中的分布，并與qPCR結(jié)果一致（圖1C）截型。我們還檢測了5 dpf斑馬魚上午9時(shí)opn4.1的轉(zhuǎn)錄水平（圖1D）趴荸。結(jié)果證實(shí)，BDE-47暴露具有雙向的菠劝，而不是逐漸減弱的效應(yīng)赊舶，使黑視素的晝夜節(jié)律表達(dá)波動(dòng)更強(qiáng)。有趣的是赶诊，一些新發(fā)現(xiàn)的非視覺視蛋白笼平，包括神經(jīng)蛋白酶（opn5）和兩種脊椎動(dòng)物古代視蛋白（纈草和纈草），其功能仍有待揭示舔痪，在BDE-47暴露下表現(xiàn)出類似的時(shí)間依賴性表達(dá)模式寓调。

圖1 BDE-47擾亂黑視素系統(tǒng)（A）在BDE-47暴露下，通過H&E染色測定視網(wǎng)膜的組織學(xué)結(jié)構(gòu)（bars = 1 μm）锄码。RPE夺英、視網(wǎng)膜色素上皮；PCL滋捶、光感受器層（桿狀細(xì)胞和錐狀細(xì)胞）痛悯；OPL，外叢狀層重窟；INL载萌、內(nèi)核層；IPL巡扇，內(nèi)叢狀層扭仁；GCL、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層厅翔。（B）BDE-47暴露條件下opn4黑視蛋白基因（opn4a乖坠、opn4b和opn4.1）的mRNA水平。結(jié)果用平均±SEM表示。每個(gè)基因的不同字母均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p < 0.05）。(C)對(duì)opn4.1的對(duì)照組和25 μg/L BDE-47處理組的全身原位雜交（bars = 100 μm）胃珍。(D)opn4.1mRNA水平的變化趨勢(shì)。星號(hào)表示顯著性：*p < 0.05戈次，**p < 0.01，分別比較對(duì)照組和25 μg/L BDE-47暴露組筒扒。

調(diào)節(jié)了SCN中的神經(jīng)肽和時(shí)鐘基因

BDE-47對(duì)血管活性腸多肽（VIP）和精氨酸加壓素（AVP）等神經(jīng)肽以及中央晝夜節(jié)律起搏器SCN中時(shí)鐘基因per2、clocka绊寻、cray1a和bmal1b等的影響如圖2所示花墩。SCN的視網(wǎng)膜起始核心包含分泌VIP的神經(jīng)元悬秉，而分泌AVP的神經(jīng)元主要位于SCN殼部分，特別是對(duì)ipRGCs信號(hào)作出反應(yīng)的VIP+神經(jīng)元冰蘑。在BDE-47暴露下和泌，VIP和AVP的熒光強(qiáng)度在夜間均顯著下降，在白天均顯著升高祠肥。定量結(jié)果顯示武氓，至少有一種BDE-47的測試濃度引起了其含量的顯著變化（圖2C）。對(duì)于時(shí)鐘基因仇箱，BDE-47在清晨導(dǎo)致per2和cry1a顯著增加（圖2A）县恕，而在夜間，進(jìn)入黑暗后不久剂桥，正晝夜節(jié)律元素時(shí)鐘顯著下降忠烛。對(duì)于上午9點(diǎn)5 dpf的測試點(diǎn)，BDE-47暴露下per2的異常振蕩（圖2B）與opn4.1（圖1D）相同权逗∶朗總的來說，SCN中的神經(jīng)肽和時(shí)鐘基因與黑視素基因的變化趨勢(shì)相似斟薇，這表明SCN是由受影響的黑視素調(diào)節(jié)的师坎。

圖2 BDE-47暴露影響生物鐘基因和SCN神經(jīng)肽 (A)BDE-47暴露下時(shí)鐘基因的 mRNA水平。結(jié)果用平均±SEM表示堪滨。每個(gè)基因的不同字母均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p < 0.05）胯陋。(B)per2 mRNA水平的變化趨勢(shì)。星號(hào)表示顯著性：對(duì)照組與25 μg/L BDE-47暴露組在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的比較時(shí)**p < 0.01椿猎，***p < 0.001惶岭。(C)SCN神經(jīng)肽AVP（綠色）和VIP（紅色）（bar=10μm）的免疫染色和統(tǒng)計(jì)分析。

中斷5-HT系統(tǒng)和抑郁相關(guān)的趨同性

受SCN在下丘腦中的位置的啟發(fā)犯眠，我們繼續(xù)研究BDE-47是否影響5-HT系統(tǒng)按灶，而5-HT系統(tǒng)可能在調(diào)節(jié)情緒、食欲和睡眠中發(fā)揮重要作用筐咧。在25 μg/L BDE-47暴露下鸯旁，5-HT主要合成基因tph2的表達(dá)在夜間顯著下降，而在白天顯著增加（圖3C）量蕊，5-HT含量也有類似的變化趨勢(shì)铺罢。為了進(jìn)一步描述5-HT的變化，我們使用免疫染色法檢測了下丘腦中的5-HT水平残炮。結(jié)果顯示韭赘，BDE-47對(duì)下丘腦5-HT的表達(dá)變化（圖3F）與tph2的表達(dá)變化一致（圖3C）。.然而势就，BDE-47對(duì)5- HT1A受體htr1aa和5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體血清的影響表現(xiàn)出在兩個(gè)晝夜節(jié)律階段的單向趨勢(shì)（圖3D泉瞻，E）脉漏，這暗示了黑視素的直接參與。

趨向性測試是研究斑馬魚情緒相關(guān)行為（尤其是抑郁）的一種常用方法袖牙。我們研究了在不同光照條件下侧巨，BDE-47暴露的斑馬魚幼魚趨向性行為的變化。在從100%光照（8000 lux）切換到100%黑暗的條件下鞭达，BDE-47暴露沒有顯著差異司忱。當(dāng)光照轉(zhuǎn)變變得對(duì)比性減弱時(shí)（從100%光照到95%黑暗），夜間的趨同性發(fā)生了顯著變化（圖3B）畴蹭。只有在昏暗的光線下才會(huì)出現(xiàn)明顯的趨動(dòng)性坦仍，這與人類和斑馬魚的黑視素高度適應(yīng)光線的事實(shí)相一致;因此，在100%的黑暗下撮胧，視覺因素可能不會(huì)起重要作用桨踪。這也表明，類似抑郁的行為受到光照條件的影響芹啥，更有可能發(fā)生在夜間锻离，這與5-HT、其受體和轉(zhuǎn)運(yùn)體結(jié)合變化的預(yù)期結(jié)果一致墓怀。

圖3 BDE-47誘導(dǎo)了趨性行為并破壞了5-HT系統(tǒng)汽纠，特別是在下丘腦（A）趨向性實(shí)驗(yàn)方案（n = 24）。(B)各組在整個(gè)試驗(yàn)階段的平均趨觸性水平傀履。(C)tph基因 mRNA表達(dá)水平虱朵。(D)5-HT1A受體基因 mRNA表達(dá)水平。(E)serta基因mRNA表達(dá)水平钓账。不同字母的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p < 0.05）碴犬。(F)下丘腦5-HT的免疫染色和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（綠色熒光，bar = 30 μm）梆暮。星號(hào)表示顯著性： *p < 0.05服协，**p < 0.01，ns =不顯著性啦粹。

BDE-47導(dǎo)致褪黑激素的中斷和“睡眠樣”活性減退

睡眠問題與異常的晝夜節(jié)律緊密相關(guān)偿荷，也是抑郁癥的一個(gè)標(biāo)志。因此唠椭，我們研究了BDE-47對(duì)斑馬魚褪黑素系統(tǒng)和睡眠?喚醒行為的影響跳纳。雖然褪黑素受體（mtnr1aa、mtnr1al和mtnr1bb）和一種代謝酶（aanat1）的表達(dá)與黑視素和時(shí)鐘基因相似贪嫂，但在BDE-47處理后寺庄，松果體中主要的aanat2基因表現(xiàn)出晝夜單調(diào)的增加（圖4E，F(xiàn)）。因此铣揉，芳烷基胺n-乙酰轉(zhuǎn)移酶（AANAT）和褪黑素的含量一直在上升饶深，因?yàn)锳ANAT是5-HT合成褪黑素的限速酶（圖4A餐曹，D）逛拱。我們猜測aanat2受到了黑視素的直接調(diào)控。同時(shí)台猴，長期夜間運(yùn)動(dòng)測試常被用作斑馬魚睡眠?喚醒行為的指標(biāo)朽合，活動(dòng)不足表示“嗜睡”狀態(tài)。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)饱狂，斑馬魚幼魚的活動(dòng)水平下降（圖4B）曹步，在白天（70%，p<0.0.05）和夜間（88%休讳，p < 0.001）的游泳距離顯著降低（圖4C）讲婚。結(jié)果與促進(jìn)睡眠的褪黑激素水平的改變相一致。

圖4 BDE-47破壞了褪黑激素的合成和褪黑激素的受體 (A)褪黑素的含量俊柔。結(jié)果用平均±SEM表示筹麸。星號(hào)表示顯著性： *p < 0.05，**p < 0.01雏婶，***p < 0.001物赶。(B)斑馬魚幼魚的晝夜節(jié)律活動(dòng)（5?6dpf）。(C)斑馬魚幼魚在夜間（5 dpf）和白天（6 dpf）的總游泳距離留晚。(D)AANAT酶含量酵紫。(E)aanat基因的mRNA水平。(F)褪黑素受體基因的mRNA水平错维。

黑視素參與了BDE-47引起的睡眠和情緒障礙

基于htr1aa和aanat2的非節(jié)律性變化與黑視素的直接調(diào)控相關(guān)的推測奖地，我們合子注射黑視素拮抗劑AA92593作為陽性對(duì)照進(jìn)一步揭示了黑視素在BDE-47誘導(dǎo)中的作用。AA92593拮抗劑療效通過上調(diào)per1b mRNA的表達(dá)水平（圖S5）和aanat2（圖5a赋焕，暗示褪黑素的增加）來證實(shí)参歹，這與之前的報(bào)道一致。黑視素對(duì)抗aanat2表達(dá)（圖5A）和睡眠?喚醒行為（圖5B宏邮，C）可能導(dǎo)致與BDE-47誘導(dǎo)的低活性表現(xiàn)泽示，特別是在夜間（圖5B，C）蜜氨。黑視素拮抗劑對(duì)其趨向性行為的影響如圖5D所示械筛。與對(duì)照組相比，AA92593在100%黑暗條件下發(fā)生了顯著變化飒炎，表明黑視素在黑暗環(huán)境中起到了促抑郁的作用埋哟，特別是在夜間。同時(shí)，AA92593注射抑制了htr1aa的轉(zhuǎn)錄水平赤赊，這表明黑視素可能具有抗抑郁作用（圖5E）闯狱。和野生型斑馬魚相比，在注射了aa92593的幼蟲中抛计，BDE-47誘導(dǎo)的變化幅度較溫和哄孤。這表明，BDE-47誘導(dǎo)的抑郁最有可能是由于黑視素及其光同步吹截，盡管也可能存在一些其他因素瘦陈。

圖5 黑視素拮抗劑AA92593顯微注射對(duì)25 μg/L BDE-47暴露的幼魚影響 (A)aanat2 mRNA表達(dá)水平的影響。結(jié)果用平均±SEM表示波俄。不同字母的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p < 0.05）晨逝。(B)斑馬魚幼魚的晝夜節(jié)律活動(dòng)（5?6dpf）。(C)斑馬魚幼魚在夜間（5 dpf）和白天（6 dpf）的總游泳距離懦铺。(D)斑馬魚幼魚的趨化性水平捉貌。(E) htr1aa mRNA表達(dá)水平。

討論

在本研究中冬念，BDE-47被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致黑視素和相關(guān)的NIF功能在5和6 dpf之間存在明顯的晝夜差異趁窃。這種差異被傳遞到SCN中的時(shí)鐘基因和神經(jīng)肽，并影響了鄰近的5-HT和褪黑素受體刘急。然而棚菊，抑郁和睡眠等重要因素的變化是單向的，導(dǎo)致BDE-47暴露的幼蟲出現(xiàn)抑郁樣（包括抑郁和嗜睡）效應(yīng)叔汁。黑視素拮抗作用提示统求，這可能主要是由于黑視素的直接光同步功能。

抑郁癥的病因長期以來一直爭論据块，但人們并沒有達(dá)成共識(shí)码邻。“低5-HT假說”在抑郁癥研究的歷史中具有深遠(yuǎn)的影響另假，可用于由遺傳像屋、生理和外源性化學(xué)因素促進(jìn)的抑郁癥。最近边篮，NIF視覺通路己莺，可以被光調(diào)節(jié)，并被環(huán)境化學(xué)物質(zhì)破壞戈轿，被提出與抑郁癥中的中樞神經(jīng)遞質(zhì)相協(xié)調(diào)凌受。該途徑利用黑視素發(fā)揮這種影響，依賴于直接光誘導(dǎo)或通過晝夜節(jié)律間接調(diào)節(jié)思杯，我們?cè)诒狙芯恐邪l(fā)現(xiàn)BDE-47聯(lián)合了該機(jī)制（圖6）胜蛉。中央晝夜節(jié)律依賴于SCN神經(jīng)遞質(zhì)（包括神經(jīng)肽）和時(shí)鐘基因，在BDE-47暴露下被黑視素基因系統(tǒng)地調(diào)節(jié)。時(shí)鐘基因per2和clocka都受到了顯著的影響誊册，但趨勢(shì)相反领突，表現(xiàn)為夜間減少，白天增加案怯，共同表明時(shí)鐘基因表達(dá)的振蕩增強(qiáng)（圖2A）君旦。5-HT合成酶tph2和下丘腦5-HT水平受到時(shí)鐘基因節(jié)律的同步影響。然而殴泰，htr1aa和serta的變化并沒有表現(xiàn)出這種晝夜節(jié)律上的差異（圖3）于宙。夜間serta和5-HT水平下降提示抑郁癥狀加重，這被BDE-47暴露下較高的夜間趨性所證實(shí)悍汛。對(duì)于5-HT1A受體的單調(diào)變化，我們推測這是因?yàn)闇p少夜間黑視素通過直接光同步減輕了5-HT受體的抑制至会，而不干擾晝夜節(jié)律系統(tǒng)离咐，考慮到現(xiàn)有的研究報(bào)告，光在“錯(cuò)誤的”晝夜節(jié)律時(shí)間（例如奉件，夜間）可能誘發(fā)獨(dú)立于硫氰酸鹽的抑郁行為宵蛀。AA92593的拮抗作用進(jìn)一步證實(shí)了黑視素在直接調(diào)控htr1aa表達(dá)中的重要作用（圖5E)。

睡眠障礙是抑郁癥的核心癥狀县貌，越來越受到關(guān)注术陶，夜間5-HT缺乏被發(fā)現(xiàn)與睡眠障礙，如睡眠過度和睡眠質(zhì)量差有關(guān)煤痕。褪黑激素現(xiàn)在被認(rèn)為是調(diào)節(jié)睡眠的中心因素梧宫，而AANAT是從5- HT中合成褪黑激素的限速酶。對(duì)于斑馬魚摆碉，有兩種annta亞型：aanat1僅在視網(wǎng)膜中表達(dá)塘匣，而在aanat2循環(huán)，特別是在松果體（高）和視網(wǎng)膜（低）巷帝。用BDE-47處理時(shí)忌卤，aanat1在夜間顯著增加，而aanat2（AANAT活動(dòng)）的顯著下降與幼蟲運(yùn)動(dòng)的均勻低活動(dòng)狀態(tài)一致楞泼。AA92593觸發(fā)了aanat2的表達(dá)增加驰徊，與BDE-47的性能相似（圖5A）。這與現(xiàn)有的證據(jù)相一致堕阔，即減少黑視素將有利于AANAT的活動(dòng)棍厂，特別是在夜間。與此同時(shí)印蔬，由于褪黑素主要是在晚上產(chǎn)生的勋桶，我們推測，夜間所有三種opn4黑視素表達(dá)的下降可能是BDE-47暴露后aanat2相關(guān)睡眠異常的主要原因。相反例驹，考慮到野生型和aa92593中注射的相對(duì)微妙的表達(dá)捐韩，白天黑視素的影響不那么重要，而褪黑素前體5- HT的增加可能是導(dǎo)致幼蟲活性低下的主要原因鹃锈。

環(huán)境污染物對(duì)視覺系統(tǒng)的毒性影響可能在很大程度上被低估了荤胁。隨著越來越多的關(guān)注，許多有機(jī)和無機(jī)污染物被發(fā)現(xiàn)具有這樣的潛力屎债。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)仅政，多溴二苯醚可損害斑馬魚幼蟲視網(wǎng)膜的視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞以及視覺引導(dǎo)行為。然而盆驹，與傳統(tǒng)的光感受器（視桿狀體和視錐體）及其圖像形成功能相比圆丹，NIF視覺很少能引起關(guān)注，因?yàn)樗诤艽蟪潭壬先晕幢惶剿髑Ｔ谀壳暗难芯恐斜璺猓覀冊(cè)谧C明黑視素的重要性方面取得了進(jìn)展，并發(fā)現(xiàn)它不僅作為斑馬魚視網(wǎng)膜中BDE-47在斑馬魚視網(wǎng)膜中的一個(gè)新的毒性靶點(diǎn)廉丽，而且作為破壞NIF通路的初始事件倦微。考慮到NIF視覺系統(tǒng)的高度復(fù)雜的原理正压，研究工作仍在進(jìn)行中欣福。例如，表達(dá)黑視素的ipRGCs也通過突觸信號(hào)接收來自桿狀細(xì)胞和錐狀細(xì)胞的信號(hào)焦履；因此拓劝，BDE-47對(duì)黑視素基因的雙向影響可能包含了這些成象光感受器的一些部分。這里所提供的機(jī)制解釋可能需要在未來隨著不斷加深的理解而加以完善裁良。

總之凿将，我們首次報(bào)道了PBDE暴露下NIF介導(dǎo)的神經(jīng)毒性機(jī)制。BDE-47對(duì)黑視素的影響通過ipRGC投射改變了大腦不同區(qū)域的時(shí)鐘基因价脾、神經(jīng)遞質(zhì)牧抵、激素和代謝酶，并導(dǎo)致了斑馬魚幼蟲的抑郁樣行為侨把。它是一種擴(kuò)展對(duì)于經(jīng)典圖像形成視覺的工作犀变，表明多溴二苯醚的視覺損傷可能具有深刻和復(fù)雜的健康影響，包括正如最近的科學(xué)進(jìn)展所聲稱的那樣秋柄，人類大腦的各種更高的認(rèn)知和情感功能获枝。在此基礎(chǔ)上，我們的研究為人類抑郁癥與PBDE暴露之間的流行病學(xué)相關(guān)性提供了機(jī)制線索骇笔。這種機(jī)制成功地解釋了一些抑郁指標(biāo)的晝夜節(jié)律差異省店。值得注意的是嚣崭，在與環(huán)境相關(guān)的BDE-47濃度下，黑視素的神經(jīng)毒性敏感性可能表明其作為水生PBDE暴露生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的新靶點(diǎn)的潛在意義懦傍。此外雹舀，盡管與哺乳動(dòng)物相比，魚類在進(jìn)化上距離人類很遙遠(yuǎn)粗俱，但日間斑馬魚模型確實(shí)有它自己的優(yōu)勢(shì)说榆。一旦光感覺和晝夜節(jié)律被認(rèn)為是人類情緒障礙的危險(xiǎn)因素，小鼠模型的夜間性質(zhì)就不再可以忽略不計(jì)寸认。在小鼠和斑馬魚中保守的毒性機(jī)制對(duì)環(huán)境污染物引起的與視覺相關(guān)的不良結(jié)果更為可靠签财。

基金:國家自然科學(xué)基金（22236006和22076146），上海市科委（22DZ1202400）偏塞，中央大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)基金（22120220584）唱蒸，長江水環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)，教育部（同濟(jì)大學(xué)）（YRWEF202106）烛愧。

本文章原文：Cao et al. Environ. Sci. Technol. (2023) 57:9592-9602

詳細(xì)網(wǎng)址：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.est.3c01716