雜志：Molecular Psychiatry

影響因子：11（2022）

年份：2013

通訊作者：H Baier

摘要

糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合后淘正，糖皮質(zhì)激素受體（GR）調(diào)控特定靶基因的轉(zhuǎn)錄，包括編碼應(yīng)激激素促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）和促腎上腺皮質(zhì)激素的靶基因臼闻。壓力軸的失調(diào)是人類(lèi)患者重度抑郁癥的一個(gè)標(biāo)志鸿吆。然而，目前尚不清楚糖皮質(zhì)激素信號(hào)通路是如何與情感障礙有關(guān)的述呐。我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)成年存活的斑馬魚(yú)突變體惩淳，由于GR的所有轉(zhuǎn)錄活性被取消，對(duì)應(yīng)激反應(yīng)的負(fù)反饋被破壞乓搬。因此思犁，皮質(zhì)醇水平升高，但不能通過(guò)GR發(fā)出信號(hào)进肯。當(dāng)GR突變體斑馬魚(yú)被放入一個(gè)不熟悉的水缸（“新魚(yú)缸”）時(shí)激蹲，突變魚(yú)變得不動(dòng)（“凍結(jié)”），表現(xiàn)出減少的探索行為江掩，并且在反復(fù)暴露時(shí)不習(xí)慣這種應(yīng)激源学辱。在水中加入抗抑郁藥氟西汀可以恢復(fù)正常行為乘瓤，隨后降低皮質(zhì)醇水平。氟西汀不影響CRH项郊、鹽皮質(zhì)激素受體（MR）馅扣、血清素轉(zhuǎn)運(yùn)體（Serta）或GR本身的轉(zhuǎn)錄。然而着降，氟西汀卻抑制了野生型魚(yú)類(lèi)和突變體中應(yīng)激誘導(dǎo)的MR和Serta的上調(diào)差油。我們的研究表明，糖皮質(zhì)激素信號(hào)在調(diào)節(jié)情緒行為過(guò)程中具有保守的保護(hù)功能任洞，并揭示了慢性應(yīng)激如何影響脊椎動(dòng)物大腦生理和行為的新分子方面蓄喇。重要的是，斑馬魚(yú)模型開(kāi)辟了高通量藥物篩選的可能性交掏，以尋找新型抗抑郁藥物妆偏。

關(guān)鍵詞：焦慮，抑郁盅弛，魚(yú)模型钱骂，糖皮質(zhì)激素，血清素挪鹏，壓力

前言

對(duì)威脅性環(huán)境刺激的感知會(huì)引起內(nèi)分泌變化见秽，進(jìn)而觸發(fā)一系列的生理和行為過(guò)程。這種所謂的“應(yīng)激反應(yīng)”是由下丘腦讨盒、垂體解取、腎上腺（HPA）軸介導(dǎo)的。下丘腦中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）的合成和釋放增加返顺，促進(jìn)促腎上腺皮質(zhì)激素（由pomc基因編碼）從垂體進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)中禀苦。促腎上腺皮質(zhì)激素刺激腎上腺糖皮質(zhì)激素的產(chǎn)生，魚(yú)類(lèi)的腎上腺同源物被稱(chēng)為腎間器官遂鹊。在硬骨魚(yú)和人類(lèi)中振乏，主要的糖皮質(zhì)激素是皮質(zhì)醇（嚙齒類(lèi)動(dòng)物中的皮質(zhì)酮）。皮質(zhì)醇水平不僅在壓力下增加稿辙，而且表現(xiàn)出晝夜節(jié)律昆码，在斑馬魚(yú)和人類(lèi)中都在白天達(dá)到峰值。

在人類(lèi)中邻储，HPA軸的過(guò)度活躍是與重度抑郁癥相關(guān)赋咽。此外，即使在未患病的個(gè)體中吨娜，循環(huán)系統(tǒng)中的高皮質(zhì)醇水平（高皮質(zhì)醇血癥）也被認(rèn)為是一個(gè)危險(xiǎn)因素脓匿，容易導(dǎo)致疾病的發(fā)展。降低皮質(zhì)醇在臨床上經(jīng)常被用于監(jiān)測(cè)治療干預(yù)的成功程度宦赠。短期壓力和輕度的慢性壓力都可導(dǎo)致情感障礙陪毡，包括抑郁和病理性焦慮米母，這表明壓力與長(zhǎng)期情緒變化的因果關(guān)系。然而毡琉，目前還不清楚HPA軸的哪些組成部分是負(fù)責(zé)導(dǎo)致抑郁癥的神經(jīng)回路的變化铁瞒。HPA相關(guān)激素和藥物治療抑郁癥被證明是有效的，如苯二氮卓類(lèi)藥物桅滋，調(diào)節(jié)伽馬氨基丁酸受體慧耍，和選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑。

了解HPA軸和抑郁癥之間的分子機(jī)制是很重要的丐谋，因?yàn)樗鼘閷ふ腋玫闹委煼椒ㄌ峁┬畔⑸直獭Ｔ诖竽X中，已知皮質(zhì)醇通過(guò)一個(gè)配體依賴(lài)的轉(zhuǎn)錄因子号俐，即糖皮質(zhì)激素受體（GR）發(fā)出信號(hào)泌豆。在與皮質(zhì)醇結(jié)合后，GR形成同型二聚體并從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核吏饿，在那里它結(jié)合被稱(chēng)為糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件（GREs）的特定DNA序列踪危，以組織特異性的方式調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。這些GREs通常是高度保守猪落，可以作為基因轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子或阻遏子陨倡。GR也可以與其他轉(zhuǎn)錄因子形成異二聚體，主要是為了抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄许布。GR廣泛表達(dá)，只在日峰值或應(yīng)激條件下被皮質(zhì)醇占據(jù)绎晃。一個(gè)相關(guān)的因子蜜唾，礦物皮質(zhì)激素受體（MR），在大腦中表達(dá)更稀疏庶艾，其配體親和力是GR的10倍袁余。Mr和GR共同行動(dòng)了廣泛的皮質(zhì)醇濃度。在生理范圍內(nèi)咱揍，通過(guò)GR發(fā)出信號(hào)被認(rèn)為可以終止應(yīng)激反應(yīng)颖榜，促進(jìn)恢復(fù)和記憶。

GR信號(hào)的過(guò)量和缺乏都可能不利于大腦功能煤裙。在嚙齒動(dòng)物中有一些證據(jù)表明掩完，糖皮質(zhì)激素對(duì)海馬的神經(jīng)發(fā)生和突觸可塑性有負(fù)面影響，這些影響在幾周內(nèi)通過(guò)SSRI給藥逆轉(zhuǎn)硼砰。另一方面且蓬，GR活動(dòng)似乎通過(guò)降低應(yīng)激反應(yīng)來(lái)保護(hù)大腦。在后一種觀點(diǎn)中题翰，抑郁癥的特征是“糖皮質(zhì)激素抵抗”恶阴，而導(dǎo)致疾病的罪魁禍?zhǔn)资沁^(guò)量的一些其他激素诈胜，可能是CRH。在具有HPA軸功能的人類(lèi)中冯事，使用地塞米松（右美托咪定焦匈，GR的合成配體）可以抑制皮質(zhì)醇。然而昵仅，在HPA軸過(guò)度激活的抑郁癥患者中缓熟，這種效應(yīng)是遲鈍的。這是至少在某些形式的重度抑郁癥中支持糖皮質(zhì)激素抵抗的證據(jù)岩饼。

材料與方法

grs357的定位克隆和基因分型

通過(guò)1230個(gè)減數(shù)分裂的連鎖定位漓帚，將s357突變定位到14號(hào)染色體上母债，位于微衛(wèi)星標(biāo)記z9017（0.08 cM）和z22094（0.16 cM）之間。4個(gè)部分重疊的BAC克隆尝抖，zK10H23毡们、zC221F10、zC143O2和zC119P14覆蓋了該區(qū)域（斑馬魚(yú)基因組指紋識(shí)別項(xiàng)目昧辽；http://www.sanger.ac.uk/）衙熔。通過(guò)將該區(qū)域的genscan預(yù)測(cè)的多肽序列爆破到NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/）中，鑒定出9個(gè)基因搅荞。斑馬魚(yú)kohtalo/ TRAP230突變體補(bǔ)充了grs357红氯，排除了該基因作為候選位點(diǎn)。對(duì)其他8個(gè)基因的編碼區(qū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）-PCR擴(kuò)增并測(cè)序咕痛。在GR cDNA中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)突變痢甘，這在基因組序列中也得到了證實(shí)。GR的野生型（WT）cDNA序列與NCBI登錄號(hào)AB218424相匹配茉贡。

采用gr位點(diǎn)側(cè)面的標(biāo)記z9017产阱、基因組DNA模板標(biāo)記z9017和z22094或cDNA模板錯(cuò)配cDNA模板限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性策略進(jìn)行基因分型。設(shè)計(jì)PCR引物块仆，在突變位點(diǎn)附近的WT等位基因上添加一個(gè)DrdI位點(diǎn)构蹬。PCR產(chǎn)物用DrdI酶切王暗，2%瓊脂糖凝膠電泳分離，鑒定載體庄敛。

細(xì)胞培養(yǎng)俗壹、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和熒光素酶檢測(cè)

在U2OS和COS-7兩種細(xì)胞系中測(cè)定了轉(zhuǎn)錄活性。為了轉(zhuǎn)染細(xì)胞藻烤，我們構(gòu)建了WT（pCDNA3-GRWT）和突變體（pCDNA3-GRR443C）形式的flag標(biāo)記的GR構(gòu)建物绷雏。采用抗flag抗體（Sigma，St Louis怖亭，MO涎显，USA），采用熒光免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)GR兴猩。共轉(zhuǎn)染gre-熒光素酶報(bào)告基因期吓，并按照標(biāo)準(zhǔn)程序測(cè)定熒光素酶活性。

為了轉(zhuǎn)染U2OS細(xì)胞倾芝，我們使用了以下報(bào)告質(zhì)粒：AP1- Luc含有胸苷激酶（TK）啟動(dòng)子上游的單一共識(shí)激活蛋白-1（AP-1）位點(diǎn)讨勤，含有骨鈣素基因344/t33片段的pOS-344-3，以及含有單一核因子（NF）-kB-Luc位點(diǎn)晨另。U2OS人骨肉瘤細(xì)胞表現(xiàn)為在杜爾貝科改良的Eagle培養(yǎng)基中保存（DMEM潭千；GIBCO，佩斯利借尿，英國(guó)）刨晴，添加5%胎牛血清（FBS）。為了進(jìn)行報(bào)告基因活性測(cè)定路翻，將細(xì)胞以DMEM/5%胎牛血清接種到24孔板中割捅，每孔約20 000個(gè)細(xì)胞。第二天帚桩，用0.8 ml的DMEM轉(zhuǎn)染細(xì)胞，每孔0.8 ml脂質(zhì)體和1.6mlPLUS試劑（Invitrien嘹黔，佩斯利账嚎，英國(guó)），20 ng報(bào)告基因儡蔓，20nglacZ加100 ng空質(zhì)粒p6R郭蕉。轉(zhuǎn)染后（3小時(shí)），細(xì)胞用DMEM/5%胎牛血清喂江，恢復(fù)3小時(shí)召锈，用含100納米的胎牛血清或乙醇載體(AP-1和骨鈣素記者）12小時(shí)，或第二天用乙醇載體获询，腫瘤壞死因子（TNFa）（5 ng毫升1）涨岁，或TNFa（5微克毫升1）t100納米右美牛血清6小時(shí)（NF-kB記者）拐袜。處理后，細(xì)胞在100ml1裂解緩沖液（PharMingen梢薪，圣何塞蹬铺，加州，美國(guó)）中裂解秉撇，并檢測(cè)熒光素酶和b-半乳糖苷酶活性甜攀。

行為測(cè)試和圖像分析

實(shí)驗(yàn)魚(yú)每隔4-7天記錄一次，每周1-2次琐馆。由于HPA軸受到晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)规阀，所有的行為測(cè)試都被限制在下午早些時(shí)候（光照開(kāi)始后5-8小時(shí)；1300-1600小時(shí)）瘦麸。視頻用數(shù)碼相機(jī)（HandyCam谁撼，索尼電子，圣地亞哥瞎暑，CA彤敛，美國(guó)）錄制，通過(guò)火線(xiàn)轉(zhuǎn)移到電腦上了赌，并保存在硬盤(pán)上墨榄。離線(xiàn)分析采用LabVIEW8（美國(guó)國(guó)家儀器公司，奧斯汀勿她，德克薩斯州袄秩，美國(guó)）和Matlab 6.5（MathWorks，納蒂克逢并，MA之剧，美國(guó)）定制編寫(xiě)的軟件進(jìn)行。

藥物處理

長(zhǎng)期使用鹽酸氟西涂沉摹（西格瑪背稼，0.8 mM）、鹽酸安非他酮（Sigma玻蝌，3 mM）和RU-486（米非司酮蟹肘，西格瑪，2.5-10mM）進(jìn)行魚(yú)類(lèi)（n?4-5）俯树，藥物溶劑作為對(duì)照帘腹。經(jīng)過(guò)藥物處理的魚(yú)每天喂食一次活的豐年蝦，1小時(shí)后更換水和藥物许饿。用地西泮（Sigma阳欲，5 mM）進(jìn)行短期治療，在實(shí)驗(yàn)前30 min將該藥物加入到魚(yú)缸中，從而進(jìn)行短期治療球化。所有的藥物也被添加到進(jìn)行行為測(cè)試的水箱的水中秽晚。右美托咪定（Sigma，25 mM）的治療是在提取皮質(zhì)醇的前一天1800小時(shí)將藥物加入魚(yú)缸中進(jìn)行的赊窥。第二天上午（0900小時(shí)）爆惧，喂魚(yú)，用系統(tǒng)水代替含dex的水锨能。

cDNA分離和定量RT-PCR

成魚(yú)浸泡在三卡因（西部化學(xué)扯再，芬代爾，WA址遇，美國(guó)）熄阻。從新鮮大腦中提取的RNA，立即在Trizol試劑（Invitrogen）中溶解倔约，并保存在冰中直到處理（10-40 min）秃殉。如果在行為測(cè)試后立即提取大腦，則首先將頭部放在干冰上冷凍浸剩，并在解剖和RNA提取前保存在80 1C中钾军。制備cDNA（Invitrogen），并按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行定量RT-PCR（應(yīng)用生物系統(tǒng)公司绢要，福斯特市吏恭，加州，美國(guó)公司）重罪。所有RT-PCR表達(dá)數(shù)據(jù)均歸一化為斑馬魚(yú)ppia-1（NM199957）樱哼。

全RNA原位雜交和振動(dòng)組切片

成魚(yú)浸泡三卡因殺死，用4%多聚甲醛（Ted Pella剿配，Redding搅幅，CA，美國(guó)）磷酸鹽緩沖鹽水過(guò)夜或室溫下4小時(shí)呼胚。全腦在解剖鏡下取出茄唐，在20 1C的100%甲醇中保存。以來(lái)自pomca（NM_181438）蝇更、crh（NM_0001007379）和血清素轉(zhuǎn)運(yùn)體（血清素沪编；NM_001039972）編碼序列的SP6和T7克隆為模板，制備地高辛標(biāo)記的反義核糖體探針（羅氏簿寂，曼海姆，德國(guó)）宿亡。大的探針被進(jìn)一步酶切成200-300bp的片段常遂。全安裝原位雜交按照標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行。雜交后挽荠，大腦被清洗并安裝在4%瓊脂糖(磷酸鹽緩沖鹽水中宿礁，并使用振動(dòng)組（徠卡微系統(tǒng)内狗，韋茲拉文兢，德國(guó)，）在100 mm處進(jìn)行切片捏雌。BM用紫色（Roche）底物進(jìn)行AP染色。圖像由安裝在徠卡立體鏡上的CCD相機(jī)拍攝成笆搓。

皮質(zhì)醇測(cè)量

魚(yú)在冰上麻醉性湿，用紙巾擦干，尾巴取出满败。用肝素化毛細(xì)血管（Fisher科學(xué)公司肤频，匹茲堡，PA算墨，美國(guó)）從尾靜脈采血宵荒，預(yù)填充樣品緩沖液（1%牛血清白蛋白（Sigma），2 TIU抑肽蛋白（Sigma）磷酸鹽緩沖鹽水）净嘀。將血液吹入含有樣品緩沖液的管中报咳，最終量為20 ml，或直接在1.5ml的管中離心挖藏，使用凝膠裝載尖端從毛細(xì)管中取出血漿暑刃。血漿在4 1C，3000 g離心10 min熬苍，80 1C保存稍走。皮質(zhì)醇血漿濃度采用酶免疫分析試劑盒（美國(guó)密歇根州安娜伯開(kāi)曼化學(xué)公司或德國(guó)德美迪克診斷有限公司）或皮質(zhì)醇放射免疫分析試劑盒（外套計(jì)數(shù)，西門(mén)子醫(yī)療診斷公司柴底，英國(guó)坎伯利）測(cè)定婿脸。為了達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的敏感范圍，用酶免疫分析緩沖液或零校準(zhǔn)器稀釋血漿1：25-60（grt/t和grs357/t）或1：500-1000（grs357/s357）柄驻。

統(tǒng)計(jì)分析

采用JMP8軟件（SAS研究所狐树，Cary，NC鸿脓，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析抑钟。在所有的圖中，誤差條表示s.e.m.為了進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較野哭，我們使用了單向或雙向的方差分析在塔，然后是配對(duì)的學(xué)生t檢驗(yàn)。夏皮羅-威爾克檢驗(yàn)用于確定正態(tài)分布拨黔。

結(jié)果

grs357突變?cè)贕R的DNA結(jié)合域產(chǎn)生了一個(gè)精氨酸(R)到半胱氨酸的(C)的取代

grs357突變體（最初命名為utoutos357）是通過(guò)化學(xué)誘導(dǎo)的破壞幼蟲(chóng)行為的大規(guī)模正向遺傳篩選確定的蛔溃。14突變體幼蟲(chóng)在受精后6天（6 dpf）的活動(dòng)活性不如WT幼蟲(chóng)，但在進(jìn)入成年期的所有階段，在形態(tài)上與WT沒(méi)有明顯區(qū)別贺待。我們使用了標(biāo)準(zhǔn)的遺傳定位技術(shù)來(lái)識(shí)別斑馬魚(yú)基因組中的突變徽曲。純合子grs357突變體的幼蟲(chóng)比它們的野生型同胞顏色稍深，這是由于它們的黑素載體中分散了黑色素麸塞。這種表型可能與a-黑素細(xì)胞刺激激素（一種由pomc基因編碼的肽激素）的失調(diào)有關(guān)秃臣，它被用于從WT中對(duì)突變體進(jìn)行分類(lèi)。一組多態(tài)的簡(jiǎn)單序列重復(fù)序列被掃描哪工，以確定那些與突變體表型共分離的序列奥此。然后利用WIK/TL雜交組合中的約600個(gè)純合子突變體（見(jiàn)材料和方法）來(lái)細(xì)化染色體定位。

將該位點(diǎn)縮小到14號(hào)染色體上的一個(gè)小區(qū)域正勒，并對(duì)候選位置進(jìn)行測(cè)序得院，確定編碼GR的基因gr為突變位點(diǎn)（圖1a）。斑馬魚(yú)基因組包含一個(gè)GR副本章贞，與人類(lèi)GR蛋白的高蛋白身份（47%）祥绞，特別是在DNA結(jié)合域（97%）和配體結(jié)合域（73%）。15突變cDNA測(cè)序顯示一個(gè)錯(cuò)義突變鸭限，用dna結(jié)合域的半胱氨酸(C)取代了443位的半精氨酸(R)蜕径。該結(jié)構(gòu)域?qū)τ贕R16-20的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是必不可少的（圖1b-d）。GR的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型（http:// www.rcsb.org/pdb/）預(yù)測(cè)败京，精氨酸的正電荷兜喻，對(duì)應(yīng)于R496老鼠，R484老鼠和R477人類(lèi)GR赡麦，是至關(guān)重要的綁定第二鋅指關(guān)節(jié)帶負(fù)電荷的磷酸基的DNA骨干朴皆。21（圖1d)。這表明（并在下面驗(yàn)證）grs357突變產(chǎn)生了一個(gè)強(qiáng)的GR的亞型或空等位基因泛粹。

該突變改變了激素結(jié)合和核易位遂铡，但去除了GR的轉(zhuǎn)錄活性

為了確定哪些蛋白功能被R443C突變破壞，我們?cè)贑OS-7細(xì)胞中表達(dá)了flag標(biāo)記的GR晶姊。在沒(méi)有配體的情況下扒接，抗flag抗體在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均檢測(cè)到GR蛋白。在合成的GR配體Dex的存在下们衙，WT和突變的GRs現(xiàn)在都只在細(xì)胞核中被發(fā)現(xiàn)（圖1e）钾怔，這表明突變并沒(méi)有破壞激素結(jié)合和隨后的核易位。這與之前的結(jié)構(gòu)和功能研究一致蒙挑，表明核易位并不依賴(lài)于攜帶取代的蛋白結(jié)構(gòu)域宗侦。

為了檢測(cè)R443C突變對(duì)GR轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響，我們將WT或突變GR共轉(zhuǎn)染報(bào)告質(zhì)粒忆蚀，重現(xiàn)了GR依賴(lài)的轉(zhuǎn)錄激活（GRE和GRE-tk）或抑制（骨鈣素矾利、AP-1懊悯、NF-kB）。在兩種不同的細(xì)胞系（COS7和U2OS）中梦皮，通過(guò)直接與強(qiáng)GRE結(jié)合的轉(zhuǎn)錄激活被取消，即使右美托咪定濃度超過(guò)WT的最大效應(yīng)10倍（圖1f桃焕；補(bǔ)充圖S1）剑肯。類(lèi)似地，轉(zhuǎn)錄抑制也可以通過(guò)直接DNA結(jié)合（骨鈣素观堂；陰性GRE）介導(dǎo)让网，也可以通過(guò)與其他連接GR與DNA的轉(zhuǎn)錄因子相互作用（AP-1和NF-kB），也被破壞（圖1g-i）师痕。我們的研究結(jié)果表明溃睹，GR的轉(zhuǎn)錄活性在很大程度上被s357突變所消除。

Fig.1 對(duì)一種破壞斑馬魚(yú)糖皮質(zhì)激素受體（GR）轉(zhuǎn)錄活性的突變的正向遺傳鑒定和生化特征胰坟。(a) BAC序列因篇，跨越兩個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記z9017和z22094之間的時(shí)間間隔。該區(qū)域包含9個(gè)預(yù)測(cè)基因笔横。(b)在gr基因的基因組序列改變竞滓。(c)對(duì)突變氨基酸殘基附近的鋅指基序進(jìn)行序列比較（紅色，標(biāo)記為*）吹缔。鋅指中的四個(gè)保守的半胱氨酸用粗體表示商佑。非保守的氨基酸用藍(lán)色表示。(d)鋅指的示意圖和精氨酸(R)到半胱氨酸(C)取代的位置厢塘。(e)在COS-7細(xì)胞中表達(dá)的Flag標(biāo)記野生型（WT）和R443C GR蛋白的亞細(xì)胞定位茶没，用抗flag抗體檢測(cè)。在1 mM地塞米松（Dex）的存在下晚碾，兩者均顯示了核易位抓半。比例尺為10毫米。（f-i）GR（R443C）在轉(zhuǎn)錄抑制方面存在缺陷迄薄。缺乏內(nèi)源性GR的U2OS細(xì)胞與空載體（“0”）或WT GR（WT）或突變GR（R443C）的表達(dá)構(gòu)建物以及PRE-tk葡萄糖cort的報(bào)告基因構(gòu)建物共轉(zhuǎn)染琅关。

突變體的應(yīng)激軸長(zhǎng)期升高和失調(diào)

GR的破壞有望消除皮質(zhì)醇介導(dǎo)的生理應(yīng)激信號(hào)的負(fù)反饋。事實(shí)上讥蔽，我們發(fā)現(xiàn)純合子grs357突變體中的皮質(zhì)醇水平顯著升高（圖2a）涣易。個(gè)體動(dòng)物之間的皮質(zhì)醇變化為3倍，但突變體（1-3mgml1）總是是來(lái)自同一魚(yú)缸的WT同胞魚(yú)（0.02-0.2mgml1）的幾倍冶伞。在野生型中新症，皮質(zhì)醇在急性禁閉應(yīng)激下略有增加（將成年魚(yú)放在狹窄的玻璃管中10 min；圖2a）响禽。純合子突變體在應(yīng)激治療后并沒(méi)有表現(xiàn)出皮質(zhì)醇的進(jìn)一步增加徒爹，這表明存在上限效應(yīng)荚醒。在非應(yīng)激條件下，雜合子攜帶者的皮質(zhì)醇水平高于WT隆嗅，并且對(duì)限制應(yīng)激的反應(yīng)更強(qiáng)烈界阁，但從未達(dá)到純合子突變體的水平（圖2a，插入）胖喳。

為了研究GR在HPA軸上的負(fù)反饋是否被突變所鈍化泡躯，我們進(jìn)行了“右美托咪定抑制試驗(yàn)”。血液皮質(zhì)醇水平在下午早些時(shí)候（1300-1600小時(shí)丽焊，與一天中進(jìn)行行為測(cè)量的時(shí)間相匹配较剃，見(jiàn)下文），在前一天晚上服用Dex后（1800小時(shí)）（燈從0700到2100小時(shí)點(diǎn)亮）技健。雖然在WT和雜合子攜帶者中写穴，右美托咪定治療消除了皮質(zhì)醇的增加，但突變體中的皮質(zhì)醇水平仍然很高（圖2b）雌贱，表明對(duì)糖皮質(zhì)激素的耐藥性啊送。

對(duì)大腦前部（包括端腦和下丘腦前部）的總RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR顯示，與雜合子相比欣孤，突變體的crh轉(zhuǎn)錄水平長(zhǎng)期增加了兩倍（圖2c）删掀。下丘腦視前區(qū)（哺乳動(dòng)物室旁核的同源物22；圖2d）和外側(cè)結(jié)節(jié)核（補(bǔ)充圖S2）的crh mRNA水平升高导街。在突變體中披泪，pomca mRNA也同樣增加（數(shù)據(jù)未顯示），特別是在側(cè)結(jié)節(jié)核中（圖2e）搬瑰。通過(guò)RT-PCR和原位雜交款票，限制脅迫導(dǎo)致雜合子中crh和pomca轉(zhuǎn)錄本的增加，但其影響很小突變體（圖2c-e)泽论“伲總之，這些肽激素表達(dá)的變化表明在HPA軸上對(duì)基因轉(zhuǎn)錄缺乏負(fù)反饋翼悴。

Fig.2 grs357突變型斑馬魚(yú)的下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸的過(guò)度活躍缚够。(a)通過(guò)酶免疫分析法測(cè)定突變體（grs357/s357）與雜合子（grs357/+）的(（非應(yīng)激）和限制應(yīng)激（應(yīng)激）后的血漿皮質(zhì)醇水平。雜合子(grs357/+）和野生型（WT）魚(yú)的皮質(zhì)醇較低鹦赎。皮質(zhì)醇在突變體中最高谍椅。雜合子中的皮質(zhì)醇高于WT。應(yīng)激增加了雜合子和WT中的皮質(zhì)醇之間的差異古话。(b)地塞米松（右美托咪定）抑制試驗(yàn)雏吭。在前一天的1800小時(shí)內(nèi)加入右美托咪定。在1300-1600h時(shí)測(cè)定皮質(zhì)醇陪踩。在07時(shí)亮燈杖们。在W型和雜合子中悉抵，皮質(zhì)醇的日峰值被大大抑制。突變體沒(méi)有顯示出減少摘完。(c)（RT）-PCR的表達(dá)姥饰。從非應(yīng)激和應(yīng)激魚(yú)的大腦前部（包括端腦和下丘腦前部提取RNA）。crh mRNA在突變體和限制脅迫后中增加孝治。(d)切片顯示下丘腦視前區(qū)表達(dá)crh的細(xì)胞媳否。在突變體中可以看到更多的信號(hào)。右邊的圖紙顯示了斑馬魚(yú)大腦側(cè)視圖中的切片位置（頂部）荆秦，以及在染色切片水平（底部）上的腦核和腦室的邊界。(e) Sagital切片顯示下丘腦外側(cè)結(jié)節(jié)核（NLT）中表達(dá)pomca的細(xì)胞力图。突變體和受壓力的魚(yú)顯示出更強(qiáng)的信號(hào)步绸。

當(dāng)突變體被放置在一個(gè)新的水箱中時(shí)，它會(huì)凍結(jié)吃媒，并不能適應(yīng)重復(fù)的應(yīng)激處理

為了檢測(cè)grs357突變體是否表現(xiàn)出異常的應(yīng)激相關(guān)行為瓤介，我們觀察了WT、雜合子和突變體對(duì)輕度焦慮環(huán)境的反應(yīng)赘那。10只雄魚(yú)被放置在一個(gè)新的水箱中刑桑，水箱光線(xiàn)明亮，墻壁不透明募舟、黑暗祠斧、不反射。新缸測(cè)試每周重復(fù)兩次拱礁，超過(guò)3周琢锋。在每次測(cè)試中，用頭頂上的攝像機(jī)記錄了魚(yú)的游泳軌跡呢灶，并隨著時(shí)間的推移繪制成圖表吴超，并根據(jù)動(dòng)物的位置和速度進(jìn)行評(píng)估（圖3a，b）鸯乃。在10個(gè)min后鲸阻，這些魚(yú)被送回了它們熟悉的缸中。在被轉(zhuǎn)移到新的魚(yú)缸后缨睡，魚(yú)經(jīng)常停止游泳鸟悴，并在魚(yú)缸底部下沉10到60秒，然后在剩余的觀察期間恢復(fù)正常游泳（圖3c奖年；頂部面板顯示了一條具有代表性的WT魚(yú)經(jīng)過(guò)五次測(cè)試后的速度分布遣臼，在首次接觸新魚(yú)缸后的第三周）。大多數(shù)魚(yú)在前60秒反應(yīng)最強(qiáng)烈拾并。然后揍堰，在10分鐘的觀察期內(nèi)鹏浅，魚(yú)可以靜止長(zhǎng)達(dá)6 min，并且只在水箱中顯示短時(shí)間的游泳回合（圖3c屏歹；底部面板顯示了一個(gè)純合子突變體的速度分布隐砸，之前的暴露與上面的野生型魚(yú)相同）。

盡管個(gè)體之間的行為是不同的蝙眶，特別是最初的凍結(jié)反應(yīng)（測(cè)試的第1分鐘）季希，但我們觀察到突變型魚(yú)和野生型魚(yú)的行為模式之間存在強(qiáng)烈的種群差異。經(jīng)過(guò)43次試驗(yàn)幽纷，每次試驗(yàn)間隔4-7天的恢復(fù)式塌，突變體的凍結(jié)率明顯多于WT和雜合子攜帶者。在整個(gè)10個(gè)min過(guò)程中友浸，他們?cè)陟o止?fàn)顟B(tài)下花費(fèi)的時(shí)間比例更長(zhǎng)（見(jiàn)圖3c）峰尝。我們計(jì)算凍結(jié)指數(shù)為不移動(dòng)的時(shí)間除以總觀測(cè)時(shí)間。冷凍指數(shù)圖顯示突變體與WT之間存在顯著差異（圖3d）收恢∥溲В基因型差異在第一次暴露于新的坦克時(shí)無(wú)法檢測(cè)到，但由于經(jīng)驗(yàn)逐漸發(fā)展伦意。WT魚(yú)每次接觸時(shí)冷凍的次數(shù)更少火窒，明顯習(xí)慣于重復(fù)隔離（圖3e）。雜合子遵循WT的趨勢(shì)驮肉，盡管它們的凍結(jié)指數(shù)顯示出的習(xí)慣過(guò)程慢于WT（圖3e）熏矿。相比之下，經(jīng)歷過(guò)的突變體在3周的過(guò)程中表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)离钝；每次暴露時(shí)曲掰，它們的冷凍時(shí)間越來(lái)越長(zhǎng)，這表明它們對(duì)新的水箱敏感（圖3e奈辰；補(bǔ)充圖S3b）栏妖。因此，具有一個(gè)或兩個(gè)GRWT拷貝的斑馬魚(yú)似乎表現(xiàn)出對(duì)一個(gè)新的水箱的長(zhǎng)期（試驗(yàn)間）習(xí)慣奖恰，而純合子突變體對(duì)這種應(yīng)激源的厭惡效應(yīng)變得敏感吊趾。這里選擇的條件反射機(jī)制因此放大了基因型之間的行為差異。

突變體在新的魚(yú)缸中表現(xiàn)出減少的探索行為

我們?cè)?0分鐘的測(cè)試期間瑟啃，評(píng)估了新魚(yú)缸中的魚(yú)的位置论泛，作為基因型和先前經(jīng)驗(yàn)的函數(shù)。生成了“熱圖”蛹屿，使我們能夠可視化魚(yú)的累積位置屁奏，較暖的顏色代表魚(yú)缸的首選區(qū)域，較冷的顏色代表魚(yú)很少訪問(wèn)的區(qū)域（圖3f）错负。位置偏好的計(jì)算方法是將在中央50%的水箱體積中所花費(fèi)的時(shí)間（遠(yuǎn)離墻壁坟瓢；如圖3g所示）除以總觀測(cè)時(shí)間勇边。這個(gè)指標(biāo)被稱(chēng)為“避墻指數(shù)”。WT和雜合子在第一次暴露時(shí)對(duì)細(xì)胞壁沒(méi)有偏好（補(bǔ)充圖S3c）折联。隨著反復(fù)暴露粒褒，WT魚(yú)越來(lái)越有可能游到近壁附近（指數(shù)從40.5下降到0.2左右；圖3h诚镰；補(bǔ)充圖S3c奕坟，從兩個(gè)不同的魚(yú)類(lèi)隊(duì)列收集的數(shù)據(jù)）。突變體表現(xiàn)出更大程度的壁回避清笨，不習(xí)慣每周暴露月杉，在周邊附近同樣可能發(fā)現(xiàn)在坦克的內(nèi)部區(qū)域（指數(shù)0.5；圖3h抠艾；補(bǔ)充圖S3d）苛萎。因此，可能焦慮程度較高的魚(yú)傾向于避開(kāi)新魚(yú)缸的墻壁跌帐。

兩種基因型之間的行為差異，無(wú)論是在凍結(jié)反應(yīng)和位置偏好上绊率，都不能歸因于運(yùn)動(dòng)缺陷谨敛，因?yàn)橥蛔凅w魚(yú)以峰值速度游泳與WT非常相似，盡管它們的平均速度和它們移動(dòng)的總距離被抑制了滤否。

Fig.3 斑馬魚(yú)grs357突變體在一個(gè)新的水箱中的夸大的凍結(jié)反應(yīng)和位置偏好的改變脸狸。幼魚(yú)在第0天（第1周）在新的水箱中進(jìn)行測(cè)試，然后在接下來(lái)的2周內(nèi)每4-7天再次測(cè)試一次藐俺。超過(guò)10個(gè)min炊甲，每15秒記錄一次運(yùn)動(dòng)。(a)具有代表性的野生型（WT）魚(yú)在5次后的軌跡欲芹。(b)一個(gè)具有代表性的突變體在5次暴露后的軌跡卿啡。該突變體的游泳量明顯少于WT。(c)在10分鐘觀察時(shí)間內(nèi)的速度圖菱父。WT（上圖）在第一分鐘內(nèi)顯示了短期的習(xí)慣化颈娜，然后以大約恒定的速度游泳9 min。突變體（底部）有一半的時(shí)間是靜止的浙宜，并在短時(shí)間內(nèi)游泳官辽。峰值速度與WT相似。(d)新魚(yú)缸中經(jīng)驗(yàn)魚(yú)的凍結(jié)指數(shù)（靜止時(shí)間/觀察時(shí)間）粟瞬。數(shù)據(jù)被合并并平均同仆。該指數(shù)在第一分鐘下降，但在突變體中仍然很高裙品。WT的冷凍率略低于雜合子俗批。凍結(jié)閾值（虛線(xiàn)）為1.6 cm s 1俗或。(e)凍結(jié)指數(shù)，平均超過(guò)9 min扶镀。觀察期的第一分鐘（短期習(xí)慣化）不包括在內(nèi)蕴侣。WT和雜合子表現(xiàn)出超過(guò)3周的長(zhǎng)期習(xí)慣化；它們逐漸凍結(jié)減少臭觉。突變體變得更加敏感或保持不變）昆雀。(f)熱圖，顯示了五次暴露后的動(dòng)物在新水箱中的空間偏好蝠筑∧欤空間箱大小為1010像素。暖色代表首選的位置（見(jiàn)右邊的比例）什乙。突變體（底部）比WT（頂部）或雜合子（中間）花費(fèi)的時(shí)間更短（注意WT和雜合子細(xì)胞壁附近的黃色和青色像素）挽封。橙色和紅色的像素表示魚(yú)結(jié)冰的地方。在突變體中可以看到更多的紅色像素臣镣，它們往往離墻壁有距離辅愿。(g)地點(diǎn)偏好的量化。如上所示忆某，坦克的視頻圖像被分成兩個(gè)同樣大的隔間点待。避壁指數(shù)計(jì)算為在中央腔室所花費(fèi)的時(shí)間除以總觀察時(shí)間。(h)有經(jīng)驗(yàn)的魚(yú)避免了墻壁弃舒。突變體仍然留在中央隔室中癞埠。0.5).在短期習(xí)慣化指數(shù)從0.5下降到0.3后，WT更傾向于外圍聋呢。雜合子表現(xiàn)出中間的偏好苗踪。

社會(huì)互動(dòng)減少了突變體的凍結(jié)反應(yīng)

斑馬魚(yú)是一種高度群居性的動(dòng)物。根據(jù)社會(huì)緩沖范式削锰，人類(lèi)受試者在允許與其他非壓力群體成員互動(dòng)時(shí)通铲，不太容易受到壓力環(huán)境的焦慮效應(yīng)，相反器贩，在孤立時(shí)测暗，表現(xiàn)出更多的壓力反應(yīng)。我們?cè)儐?wèn)了是否在新的水箱中的冷凍和放置偏好可以通過(guò)暴露于同種物質(zhì)來(lái)改變磨澡。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中碗啄，我們改變了結(jié)構(gòu)，使魚(yú)缸的一壁沒(méi)有被遮擋稳摄，從而能夠與相鄰魚(yú)缸中的WT魚(yú)進(jìn)行視覺(jué)互動(dòng)（圖4a）稚字。一個(gè)空坦克作為控制裝置。對(duì)游泳軌跡（圖4b）、累積“熱圖”（圖4c）和平均位置的測(cè)量（圖4d）的分析胆描，都顯示了斑馬魚(yú)有明顯的趨勢(shì)瘫想，無(wú)論基因型如何，花更多的時(shí)間在透明壁附近昌讲。當(dāng)鄰近的坦克含有同種坦克時(shí)国夜，這種趨勢(shì)更強(qiáng)。有趣的是短绸，當(dāng)允許與其他魚(yú)進(jìn)行視覺(jué)互動(dòng)時(shí)车吹，突變體凍結(jié)的時(shí)間更少，接近雜合子的水平（圖4e）醋闭。減少冷凍水平與皮質(zhì)醇水平的明顯降低無(wú)關(guān)（圖4f）窄驹。我們得出的結(jié)論是，社會(huì)互動(dòng)逆轉(zhuǎn)了突變體的凍結(jié)行為证逻，并且在沒(méi)有糾正HPA軸的情況下就這樣做了乐埠。

Fig.4 社會(huì)互動(dòng)減少了斑馬魚(yú)grs357突變體的凍結(jié)和魚(yú)缸回避。(a)實(shí)驗(yàn)裝置的俯視圖囚企。被測(cè)試的魚(yú)被描述在底部一排的水箱中丈咐。(a)行為在帶有一個(gè)透明壁的水箱中進(jìn)行測(cè)試，允許與相鄰水箱中的非突變同種動(dòng)物進(jìn)行視覺(jué)交互（“其他魚(yú)的視圖”龙宏，右圖）棵逊。一個(gè)有四個(gè)不透明墻的標(biāo)準(zhǔn)水箱（“孤立的”，左面板）和一個(gè)有一個(gè)透明墻的水箱烦衣，上面有一個(gè)空的水箱（“空水箱的觀點(diǎn)”歹河，中間的面板）被用作控制掩浙。(b)同種突變魚(yú)的代表性軌跡花吟。(c)熱圖，顯示位置偏好厨姚，如在a衅澈。雜合子（頂部面板）更喜歡水箱的墻壁和角落，特別是放置空水箱的墻壁或裝有其他魚(yú)的水箱谬墙。分離出來(lái)的突變體對(duì)細(xì)胞壁沒(méi)有偏好今布。然而，它們更喜歡靠近透明的墻壁游泳拭抬，尤其是當(dāng)鄰近的魚(yú)缸里有另一條魚(yú)的時(shí)候部默。(d)魚(yú)與不透明墻和透明墻的平均距離。(e)兩種基因型的凍結(jié)指數(shù)作為其視覺(jué)環(huán)境的功能造虎。當(dāng)能夠看到同種時(shí)傅蹂，經(jīng)歷的突變體凍結(jié)要少得多。(f)血漿皮質(zhì)醇，通過(guò)酶免疫分析法）測(cè)定份蝴。在被行為拯救的突變體中犁功，激素水平?jīng)]有改變。

急性安定和長(zhǎng)期氟西汀治療可逆轉(zhuǎn)抑郁樣行為

為了進(jìn)一步研究?jī)鼋Y(jié)和減少的壁探索行為是否涉及與抑郁和/或焦慮相關(guān)的神經(jīng)回路婚夫，我們用已知對(duì)哺乳動(dòng)物有抗抑郁或抗焦慮作用的藥物治療魚(yú)類(lèi)浸卦。地西泮與-氨基丁酸A型受體的苯二氮卓結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，在那里它作為一個(gè)正的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑案糙。在水箱水中加入地西泮（5mM限嫌，30 min），可以將經(jīng)歷過(guò)的突變體的冷凍反應(yīng)降低到未經(jīng)處理的雜合子中所見(jiàn)的水平（圖5a）侍筛。細(xì)胞壁的探索也同樣增加到未經(jīng)處理的雜合子的水平（圖5c萤皂；補(bǔ)充圖S5b）。用地西泮處理的雜合子顯示出最低可能的可能凍結(jié)指數(shù)（0匣椰；圖5a)和最低的測(cè)量壁回避指數(shù)(ca裆熙。0.1；請(qǐng)參見(jiàn)圖5c禽笑，右上角的面板）入录。SSRI氟西汀（0.8 mM）治療在使用4天后也有類(lèi)似的效果佳镜，但在較短的治療后沒(méi)有效果（圖5b）僚稿。地西泮和氟西汀都沒(méi)有改變突變體或雜合子的平均游泳速度（補(bǔ)充圖S4c），這表明這些藥物在所使用的濃度下沒(méi)有發(fā)揮鎮(zhèn)靜或其他不良作用蟀伸。選擇性去甲腎上腺素和多巴胺再攝取抑制劑安非他酮（3 mM）對(duì)冷凍行為沒(méi)有影響（補(bǔ)充圖S6a）蚀同。與預(yù)期的一樣，強(qiáng)效GR拮抗劑RU486（5 mM）對(duì)突變體沒(méi)有行為影響（補(bǔ)充圖S6b-d）啊掏。然而蠢络，RU486增加了WT的凍結(jié)反應(yīng)，但不影響游泳速度和位置偏好（補(bǔ)充圖S6e-g）迟蜜，因此部分對(duì)突變進(jìn)行了表型復(fù)制刹孔。

我們接下來(lái)探索氟西汀治療是否降低了應(yīng)激魚(yú)的皮質(zhì)醇水平和/或糾正了行為拯救突變體的皮質(zhì)醇水平。治療4天后娜睛，即在行為測(cè)試后立即髓霞，皮質(zhì)醇沒(méi)有變化（圖5d）。然而畦戒，在持續(xù)氟西汀治療2周后方库，皮質(zhì)醇顯著降低，盡管沒(méi)有達(dá)到雜合子和WT中相對(duì)較低的水平（圖5e）障斋。因此纵潦，皮質(zhì)醇的糾正是緊隨行為改善之后的，但顯然不是必要的。

氟西汀和grs357突變揭示了糖皮質(zhì)激素信號(hào)通路和血清素能系統(tǒng)之間的相互作用

為了更好地理解SSRIs是如何影響應(yīng)激軸的酪穿，我們?cè)诼暂p度應(yīng)激（CMS）治療后凳干，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了GR和Mr的表達(dá)水平。CMS是通過(guò)分離一條魚(yú)長(zhǎng)達(dá)2周的被济，定期自由喂食和日常處理救赐。我們發(fā)現(xiàn)gr mRNA本身略有但持續(xù)地增加(通過(guò)ca。CMS和實(shí)驗(yàn)條件均未檢測(cè)到明顯的變化只磷。氟西汀對(duì)gr的表達(dá)有微妙的影響（圖5f）经磅。編碼Mr的基因mr的轉(zhuǎn)錄水平在所有基因型中都是相似的，這表明Mr不受GR的調(diào)控（圖5g）钮追。CMS后预厌，mr mRNA顯著增加(通過(guò)ca。100%)元媚；氟西汀的使用減弱了這種增長(zhǎng)（圖5g)轧叽。這可能是mr介導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)的衰減解釋了氟西汀對(duì)行為的一些有益影響。

慢性應(yīng)激可能會(huì)影響對(duì)血清素能信號(hào)傳導(dǎo)重要的基因的表達(dá)刊棕。因此炭晒，我們分析了腦血清的水平和表達(dá)模式。全腦定量RT-PCR顯示甥角，在WT网严、突變體和雜合子中，應(yīng)激狀態(tài)和非應(yīng)激狀態(tài)之間的serta表達(dá)略有增加（圖5h）嗤无。這一趨勢(shì)在CMS4天可檢測(cè)到震束，在2周時(shí)顯著（補(bǔ)充圖S7）。氟西偷狈浮（4天或2周）可以降低了暴露于cms的魚(yú)的血清水平至基線(xiàn)水平垢村，而地西泮則沒(méi)有，即使連續(xù)使用4天也不能（補(bǔ)充圖S7）灶壶。因此肝断，對(duì)血清膜轉(zhuǎn)錄的調(diào)控可能是氟西汀和地西泮治療效果不同的機(jī)制之一杈曲。我們的測(cè)量結(jié)果還表明驰凛，在應(yīng)激過(guò)程中，血清素的調(diào)節(jié)和SSRIs的影響并不被grs357突變所破壞担扑。然而恰响，原位雜交提供了一個(gè)更復(fù)雜的圖像。這里涌献，突變體中縫上核似乎serta mRNA缺失（圖5i）胚宦。頂蓋前核表達(dá)明顯正常水平的血清（補(bǔ)充圖S8）。總之枢劝，觀察到的氟西汀對(duì)行為井联、GR和MR表達(dá)的影響，以及grs357突變體中明顯的血清失調(diào)您旁，與糖皮質(zhì)激素信號(hào)與血清素能傳遞系統(tǒng)交聯(lián)的觀點(diǎn)烙常，以及血清素失衡易導(dǎo)致斑馬魚(yú)的抑郁行為相一致。

Fig.5 地西泮和氟西汀對(duì)斑馬魚(yú)行為和基因表達(dá)的影響鹤盒。(a)安定或溶劑處理之前斑馬魚(yú)冷凍指數(shù)的變化蚕脏。(b)氟西汀處理后（0.8 mM，4天）的魚(yú)冷凍指數(shù)侦锯。(c)位置偏好的熱圖驼鞭。雜合子魚(yú)對(duì)魚(yú)的魚(yú)角和魚(yú)壁表現(xiàn)出輕微的偏好，在氟西汀和地西泮處理后尺碰，這種偏好顯著增加挣棕。用地西泮處理過(guò)的魚(yú)（右上方）大部分時(shí)間都待在魚(yú)缸的角落里。突變體也受到類(lèi)似的影響亲桥，盡管其壁回避沒(méi)有達(dá)到地西泮處理的雜合子的水平（右下面板）穴张。(d)在氟西汀（0.8 mM）治療后两曼，突變體和雜合子的血漿皮質(zhì)醇水平的改變皂甘。氟西汀在沒(méi)有拯救皮質(zhì)醇水平的情況下使行為正常化悼凑。(e)氟西汀治療）后偿枕，通過(guò)放射免疫法測(cè)定初始WT、突變體和雜合子的血漿皮質(zhì)醇水平户辫。gr mRNA大部分不受壓力和藥物治療的改變(f)渐夸。mr mRNA在不同基因型之間相似，但在所有基因型的脅迫魚(yú)中均上調(diào)渔欢，并被氟西汀歸一化(g)墓塌。在全腦轉(zhuǎn)錄水平上，實(shí)驗(yàn)組間的serta表達(dá)無(wú)顯著性差異(h)奥额，但見(jiàn)(i)苫幢。(i)在后腦矢狀面切片上進(jìn)行的原位雜交顯示，在上中縫中垫挨，表達(dá)血清的細(xì)胞缺失或明顯減少韩肝。

討論

我們已經(jīng)提出證據(jù)表明，GR的破壞會(huì)在成年斑馬魚(yú)中引起一種類(lèi)似于情感障礙的綜合征九榔。該綜合征攜帶著慢性壓力的分子特征和抑郁的行為特征哀峻，包括探索行為減少和反復(fù)暴露于焦慮環(huán)境的習(xí)慣受損涡相。在分子上，該突變導(dǎo)致GR蛋白的第二鋅指基序中一個(gè)高度保守的精氨酸(R)取代了半胱氨酸(C)剩蟀，這是DNA結(jié)合所必需的重要組成部分催蝗。在廣泛的體外檢測(cè)中，這種變化消除了靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制和激活育特，包括那些需要GR同型二聚體與陽(yáng)性或陰性GREs結(jié)合以及與NF-kB或AP-1異二聚的基因生逸。我們從這些數(shù)據(jù)中得出結(jié)論，該突變對(duì)GR的大多數(shù)基因組功能產(chǎn)生了一個(gè)空值且预，如果不是全部的話(huà)槽袄。與我們?cè)诎唏R魚(yú)中對(duì)這種突變的分子后果的研究結(jié)果一致，人類(lèi)GR中自然發(fā)生的等效殘基（R477）的突變也破壞了GR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控锋谐。此外遍尺，相應(yīng)的氨基酸殘基也發(fā)生了突變。

我們證實(shí)了GR基因組活性的破壞會(huì)導(dǎo)致一個(gè)HPA軸的過(guò)度激活涮拗。特別是CRH乾戏，促腎上腺皮質(zhì)激素和皮質(zhì)醇長(zhǎng)期升高。與放大的應(yīng)激反應(yīng)相一致的是三热，突變體對(duì)焦慮性環(huán)境反應(yīng)過(guò)度鼓择，這是一種從同種物種中分離出來(lái)的新容器。野生型和雜合子魚(yú)在短期內(nèi)（在個(gè)體試驗(yàn)的10 min內(nèi)）和長(zhǎng)期內(nèi)（在試驗(yàn)之間）都適應(yīng)于這種壓力環(huán)境就漾。他們的行為從凍結(jié)和位置冷漠轉(zhuǎn)變?yōu)榭拷鼔Ρ诘膹?qiáng)烈的探索性游泳行為呐能。另一方面，純合子突變體在很大程度上保持在凍結(jié)姿勢(shì)抑堡，在凍結(jié)回合之間和凍結(jié)期間沒(méi)有表現(xiàn)出位置偏好摆出；它們幾乎沒(méi)有在試驗(yàn)中習(xí)慣，甚至在試驗(yàn)之間變得敏感首妖。地西泮和氟西汀的治療降低了突變體的凍結(jié)時(shí)間和避免壁的行為偎漫，也增加和加速了WT和雜合子的習(xí)慣化。

在斑馬魚(yú)中有缆，墻壁探索的行為象踊，或趨向性，在新的水箱中似乎是動(dòng)機(jī)棚壁，探索行為的一個(gè)指標(biāo)杯矩。與之前的研究一致，我們觀察到灌曙，對(duì)新魚(yú)缸的習(xí)慣化導(dǎo)致了墻壁回避的減少菊碟。據(jù)報(bào)道节芥，中等劑量的乙醇增加了焦慮的一些指標(biāo)在刺，而甲狀腺的趨同性則降低了逆害。另一方面，d-麥角酸二乙酰胺減少了凍結(jié)和其他焦慮相關(guān)行為蚣驼，同時(shí)增加了趨同性魄幕。我們?cè)谶@里表明，抗焦慮和抗抑郁治療同樣會(huì)導(dǎo)致明顯的斑馬魚(yú)在魚(yú)缸壁附近游泳颖杏。因此纯陨，一個(gè)共識(shí)正在形成，至少在我們和其他人使用的小型留储、光線(xiàn)充足的容器中翼抠，“趨向性”隨著壓力水平的下降和缺點(diǎn)的下降而增加反的這可能似乎違反直覺(jué)，因?yàn)樗c在大鼠和老鼠身上的報(bào)道相反获讳，但可能是由于日間被膜和夜間嚙齒動(dòng)物之間的生態(tài)差異阴颖。斑馬魚(yú)是視覺(jué)專(zhuān)家。對(duì)它們來(lái)說(shuō)丐膝，當(dāng)受到威脅時(shí)量愧，移動(dòng)到開(kāi)闊的田野，在那里它們不會(huì)被隱藏的捕食者伏擊帅矗，并且可以尋找同種魚(yú)群偎肃，這可能是一種適應(yīng)性策略。還需要做進(jìn)一步的工作來(lái)解決這一重要問(wèn)題浑此。

在這里觀察到的凍結(jié)行為與焦慮或抑郁更密切相關(guān)嗎累颂？藥理學(xué)讓這個(gè)問(wèn)題沒(méi)有答案，因?yàn)榭菇箲]藥物（地西泮）和抗抑郁藥物（氟西土菥恪）都可以逆轉(zhuǎn)冷凍喘落。所以，我們必須考慮行為參數(shù)最冰。斑馬魚(yú)的焦慮特征是穿越坦克瘦棋，積極探索逃跑路線(xiàn)。我們沒(méi)有在我們的突變體中觀察到這種行為暖哨。此外赌朋，突變體和WTs之間的行為差異只有在反復(fù)暴露后才能檢測(cè)到，這表明類(lèi)似于習(xí)得性無(wú)助的長(zhǎng)期篇裁、經(jīng)驗(yàn)依賴(lài)效應(yīng)沛慢。雖然我們不能知道魚(yú)的情緒，但因此我們將grs357突變體的凍結(jié)行為和靜止解釋為一種更類(lèi)似于抑郁而不是焦慮的綜合癥的表現(xiàn)达布。然而团甲，不能排除突變體的行為可能反映了一種極端形式的焦慮形式，或者焦慮黍聂、恐慌躺苦、緊張癥身腻、絕望和抑郁的界限對(duì)硬骨魚(yú)來(lái)說(shuō)可能是流動(dòng)的。

氟西汀的成功治療匹厘，以及與其他斑馬魚(yú)的社會(huì)互動(dòng)嘀趟，使突變體的高皮質(zhì)醇水平最初保持不變，顯然繞過(guò)了HPA軸愈诚。只有在氟西汀治療2周后她按，我們才觀察到皮質(zhì)醇的降低。因此炕柔，盡管在這種斑馬魚(yú)模型中酌泰，gr介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄控制的中斷足以引起情感障礙，但隨后對(duì)皮質(zhì)醇水平的糾正對(duì)行為的正池袄郏化并不是必要的宫莱。相反，其他與壓力相關(guān)的機(jī)制哩罪，可能是在大腦的情緒中心授霸，是SSRIs和其他成功的治療方法的獨(dú)立目標(biāo)。皮質(zhì)醇的減少會(huì)延遲际插，似乎是成功治療的結(jié)果碘耳，而不是原因。

HPA失調(diào)調(diào)節(jié)斑馬魚(yú)行為反應(yīng)的神經(jīng)機(jī)制目前尚不清楚框弛。有間接證據(jù)表明辛辨，CRH和血清素能系統(tǒng)之間的相互作用可能參與其中。血清素系統(tǒng)的亞敏感性與哺乳動(dòng)物的抑郁密切相關(guān)瑟枫。在硬骨動(dòng)物和兩棲動(dòng)物中斗搞，腦內(nèi)注射CRH可以以一種環(huán)境依賴(lài)的方式調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)活動(dòng)和位置偏好。這些crh誘導(dǎo)的行為分別被氟西汀或5-HT1A受體拮抗劑強(qiáng)烈增強(qiáng)或抑制慷妙。在我們的斑馬魚(yú)grs357突變體中僻焚，中縫上核的腦Serta表達(dá)似乎降低。來(lái)自中縫核的5-羥色胺能神經(jīng)元廣泛地投射到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的許多區(qū)域膝擂，是大腦可塑性和神經(jīng)發(fā)生虑啤，以及運(yùn)動(dòng)和情感行為的重要調(diào)節(jié)器。上述觀察到的SSRIs的治療效果可能與中縫上核正常血清素功能的恢復(fù)有關(guān)架馋，并對(duì)前腦或腦干運(yùn)動(dòng)回路有分布效應(yīng)狞山。

已經(jīng)產(chǎn)生了幾個(gè)GR表達(dá)或功能有條件改變的小鼠系。GR的構(gòu)成性敲除在小鼠中是胚胎致死的）叉寂。在雜合子GR敲除42或前腦限制性GR敲除的小鼠中觀察到抑郁行為萍启。然而，總神經(jīng)元或膠質(zhì)GR敲除44或反義GR敲低要么導(dǎo)致焦慮減少屏鳍，要么對(duì)行為沒(méi)有可測(cè)量的影響勘纯。矛盾的是局服，在前腦中GR過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠在術(shù)后表現(xiàn)出焦慮和/或抑郁樣行為的增加接觸CMS。因此屡律，小鼠的行為結(jié)果不能輕易地與人類(lèi)患者的數(shù)據(jù)相一致腌逢，這可能是因?yàn)榻M織限制的操作對(duì)HPA軸和/或邊緣系統(tǒng)有不完全或復(fù)雜的影響降淮。

GR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控并不是大腦中皮質(zhì)醇信號(hào)傳導(dǎo)的唯一中介超埋。最近的研究表明，前腦中Mr的轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)可以抑制小鼠的焦慮相關(guān)行為佳鳖。除了經(jīng)典基因組活動(dòng)GR和先生霍殴，另一種快速，非基因組皮質(zhì)醇信號(hào)通路顯示系吩，這可能也可能不涉及GR或先生顯然来庭，這個(gè)信號(hào)至關(guān)重要調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素影響神經(jīng)活動(dòng)和可塑性，促進(jìn)或抑制信號(hào)的離子通道和神經(jīng)遞質(zhì)受體穿挨。在grs357突變體中月弛，非基因組效應(yīng)和由皮質(zhì)醇產(chǎn)生的mr依賴(lài)性信號(hào)傳導(dǎo)預(yù)計(jì)都是完整的，甚至可能因?yàn)槠べ|(zhì)醇水平的升高而被夸大科盛。由于grs357突變體缺乏所有的GR基因組活性帽衙，它可能是解開(kāi)這些其他信號(hào)通路在應(yīng)激反應(yīng)中的貢獻(xiàn)的有用工具。

總之贞绵，我們的發(fā)現(xiàn)證明了在脊椎動(dòng)物中調(diào)節(jié)情緒的神經(jīng)內(nèi)分泌回路中存在顯著程度的進(jìn)化保護(hù)厉萝。我們的數(shù)據(jù)有力地支持了一個(gè)假設(shè)，即HPA軸的過(guò)度激活榨崩，通過(guò)獲得性或（在這種新的魚(yú)突變體的情況下）遺傳的糖皮質(zhì)激素抵抗谴垫，是抑郁癥發(fā)展的一個(gè)重要因素。斑馬魚(yú)作為一種與人類(lèi)相似的皮質(zhì)醇節(jié)律的晝夜活動(dòng)物種母蛛，可能為神經(jīng)精神病學(xué)研究提供一個(gè)有用的模型系統(tǒng)翩剪，作為廣泛使用的嚙齒動(dòng)物模型的補(bǔ)充。在未來(lái)的應(yīng)用中彩郊，我們的斑馬魚(yú)gr突變體有可能被用作一種小分子篩選工具肢专，用于發(fā)現(xiàn)新的抗抑郁藥物。