雜志：Molecular pharmaceutics

影響因子：4.9（2022-2023）

年份：2022

通訊作者：Carol S. Lim, and Kimberley J. Evason

通訊作者單位：Kimberley J. Evason-Department of Pathology and Huntsman Cancer Institute, University of Utah, Salt Lake City, Utah 84112, United States;

Carol S. Lim-Department of Molecular Pharmaceutics, University of Utah, Salt Lake City, Utah 84112, United States.

摘要

肝細胞癌（hepatellular carcinoma庭呜，HCC）的治療方法很少，全球年死亡率超過80萬犀忱，迫切需要新的治療方法募谎。盡管野生型p53基因療法已被證明在HCC患者中是安全的，但尚未顯示出足夠的療效阴汇。該研究旨在展示p53如何通過融合促凋亡BH3蛋白Bcl-2細胞死亡拮抗劑（Bad）來重新設計数冬，以提高抗HCC活性，并可能產(chǎn)生一種新的HCC治療藥物p53-Bad*搀庶。p53-Bad*是p53和Bad的融合產(chǎn)物拐纱，有兩個突變，S112A和S136A哥倔。我們通過熒光顯微鏡檢測了不同p53突變狀態(tài)的肝癌細胞系中p53- bad*的線粒體定位秸架。我們用流式細胞術(shù)測定了p53-Bad*在4種肝癌細胞系中的凋亡活性。為了確定p53-Bad*在體內(nèi)的作用咆蒿，我們生成并分析了表達肝細胞特異性p53-Bad*的轉(zhuǎn)基因斑馬魚东抹。無論p53突變狀態(tài)如何，p53-bad*都定位于線粒體沃测，并且在早期缭黔、中期和晚期的凋亡實驗中表現(xiàn)出優(yōu)于WT p53的凋亡活性。通過肝體質(zhì)量比和組織病理學檢測蒂破，p53-Bad*可減輕斑馬魚HCC的腫瘤負荷馏谨。通過TUNEL染色檢測，p53-Bad*在斑馬魚HCC中誘導了顯著的細胞凋亡附迷，而在非HCC魚類中未誘導細胞凋亡惧互。p53-bad*在斑馬魚體內(nèi)可誘導不同p53突變狀態(tài)的肝癌細胞系凋亡哎媚，誘導細胞凋亡/減輕HCC腫瘤負荷。p53-Bad*作為一種潛在的新型HCC治療藥物值得進一步研究壹哺。

關鍵詞：肝癌抄伍，腫瘤抑制因子p53, Bcl-2細胞死亡拮抗劑，線粒體凋亡管宵，p53-bad*融合 

前言

據(jù)估計截珍，全球每年有80萬人死于肝癌，不斷上升的發(fā)病率（從1990年到2015年增加了75%）和高死亡率使肝細胞癌（HCC）成為最常見的肝癌類型箩朴，對全球健康構(gòu)成巨大威脅岗喉。多年來，唯一被批準用于晚期HCC的系統(tǒng)性治療是索拉非尼（sorafenib）炸庞，這是一種酪氨酸激酶抑制劑钱床，可將患者的總生存期提高2.8個月，但會引起明顯的不良反應埠居。治療HCC迫切需要副作用更少的改進療法查牌，特別是對于疾病晚期和/或肝功能低下的患者。

HCC腫瘤具有獨特的血管系統(tǒng)滥壕，75-80%的血液供應來自肝動脈纸颜。正常肝組織只有25%的血供來自肝動脈，大部分來自門靜脈绎橘。這種二分法導致HCC特異性的自然機制胁孙，通常用于HCC治療，如經(jīng)動脈化療栓塞或Y90放射栓塞称鳞，可緩解癥狀涮较，延長無進展生存期，并使患者在更長的時間內(nèi)保持移植資格冈止。這種獨特的HCC動脈內(nèi)輸送的特異性對基因治療特別有利狂票，因為基因治療需要靶向給藥才能成功。動脈內(nèi)注射和瘤內(nèi)注射均能有效地對肝癌進行基因治療熙暴，雖然Gendicine顯示出輕微毒性苫亦，并且成功地給藥至HCC，但野生型（WT）p53基因療法治療HCC的療效存在爭議怨咪，而且尚未開展進一步試驗，盡管幾種p53再激活劑（APR-246和COTI-2）目前正在多種癌癥類型中進行臨床試驗润匙。

Gendicine p53基因療法已在中國對許多癌癥進行了試驗雖然在某些癌癥（如頭頸部）比其他癌癥（如卵巢癌）更成功诗眨，但WT p53基因治療尚未被確定為成功的抗癌基因治療方法。這種失敗通常歸因于癌細胞能夠通過p53通路的替代突變孕讳、核p53效應的顯性負抑制以及過去幾代腺病毒載體的問題來克服WT p53的影響匠楚。

重新設計的p53融合結(jié)構(gòu)顯示出前景巍膘，將p53重定向到線粒體以增加凋亡潛能。WT p53主要定位于細胞核芋簿，在細胞核內(nèi)四聚結(jié)合DNA峡懈，調(diào)節(jié)細胞代謝，控制糖酵解与斤，誘導細胞周期阻滯肪康、DNA修復、衰老撩穿、外源性凋亡和氧化磷酸化磷支。WT p53也能定位線粒體——通常是微量的，凋亡細胞除外食寡，在凋亡細胞中雾狈，單體p53刺激快速的內(nèi)在凋亡。線粒體p53失活抗凋亡因子抵皱，激活促凋亡因子Bak和Bax善榛，導致細胞色素C釋放、凋亡體組裝呻畸、caspase級聯(lián)和細胞凋亡（圖1）移盆。線粒體p53誘導細胞凋亡的優(yōu)點包括繞過核p53途徑，增加凋亡誘導速度擂错，減少癌細胞克服p53作用的可能突變池味滞，并避免顯性負作用。理論上允許強大的p53凋亡活性钮呀，無論腫瘤p53狀態(tài)剑鞍。這些作用可以通過p53與線粒體靶向信號（MTS）融合來實現(xiàn)，以增加線粒體定位爽醋，我們已經(jīng)證明這可以誘導卵巢癌和乳腺癌的細胞凋亡蚁署。

圖1 p53-Bad*與線粒體凋亡

(A)激活時，促凋亡蛋白Bak和Bax同質(zhì)寡聚并誘導線粒體孔的形成蚂四，釋放細胞色素c光戈。這導致caspase級聯(lián)激活，凋亡體的形成遂赠，并誘導凋亡久妆。(B)抗凋亡因子如Bcl-xL、Bcl-2和Mcl-1與Bak和/或Bax結(jié)合跷睦，阻止同質(zhì)寡聚筷弦。在線粒體，p53 (C)滅活抗凋亡因子，(D)激活Bak和Bax烂琴。(E)促凋亡的BH3-only蛋白如Bad與抗凋亡因子結(jié)合爹殊，釋放Bak和Bax。(F) p53-Bad*定位于線粒體奸绷，使p53和Bad具有雙重活性梗夸。

為了進一步增加凋亡活性，我們將p53融合到促凋亡的線粒體蛋白而不是mts中号醉。細胞在抗凋亡因子和促凋亡因子的平衡下會導致線粒體凋亡反症。抗凋亡因子(如Bcl-2扣癣、Bcl-xL惰帽、Mcl-1和Bcl-W)可以隔離凋亡誘導劑Bak和Bax，而促凋亡的BH3蛋白(如Bad父虑、Bid和Bim)具有BH3結(jié)構(gòu)域该酗，可以阻斷抗凋亡因子上的Bak/Bax結(jié)合位點，阻止它們抑制細胞凋亡士嚎。癌細胞經(jīng)常上調(diào)抗凋亡因子的水平呜魄，使這種平衡遠離凋亡活性，在HCC中莱衩，Bcl-xL在三分之二的患者樣本中高度上調(diào)爵嗅。高Bcl-xL水平與患者中位生存時間減少31.4個月相關，并與Mcl-1水平升高相關(在51%的HCC患者樣本中上調(diào))笨蚁。

由于p53同時抑制Mcl-1和Bcl-xL睹晒，預計通過與BH3蛋白融合，直接靶向這些抗凋亡因子中的任何一個括细，可以增加線粒體凋亡(除了p53線粒體定位的影響外)伪很。我們選擇Bad (Bcl-2細胞死亡拮抗劑)作為p53融合(p53-Bad)的理想候選者，因為它能強烈結(jié)合Bcl-xL, HCC中最高度上調(diào)的抗凋亡因子奋单。Bad還能結(jié)合Bcl-W和Bcl-2锉试。由于Bad與線粒體外膜結(jié)合而不是插入跨膜結(jié)構(gòu)域，Bad也可能比其他BH3蛋白更有利览濒，因為p53和Bad都需要結(jié)合不同的靶標來誘導細胞凋亡呆盖。

Bad在112和136位點含有兩條絲氨酸，它們可以被磷酸化贷笛，導致支架蛋白14-3-3與Bad結(jié)合并隨后被細胞質(zhì)隔離將這些絲氨酸突變?yōu)楸彼嵯诉@些磷酸化位點应又，并產(chǎn)生了一種在文本中稱為Bad*的蛋白質(zhì)。我們之前的研究表明乏苦，p53-Bad*融合增加了線粒體在p53-Bad上的定位丁频，并誘導卵巢癌細胞凋亡。本文詳細介紹了線粒體定位、體外凋亡活性和p53-Bad*在斑馬魚體內(nèi)抗肝癌的功效席里。

材料和方法

克隆：

構(gòu)建體pCMV-EGFP拢驾、pCMV-EGFP-p53奖磁、pCMV-EGFP-bad、pCMV-EGFP-bad*繁疤、pCMV-EGFP-p53-bad咖为、pCMV-EGFP-p53-bad*的克隆和突變與前作相同。

細胞系稠腊，維持和轉(zhuǎn)染：

細胞系購自ATCC躁染，在37℃和5% CO2條件下單層培養(yǎng)于燒瓶中。肝癌細胞系包括HepG2/C3A（C3A, HepG2衍生物架忌，WT p53）吞彤、Hep3B2.1-7 （Hep3B, p53無效）、PLC/PRF/5（PP5叹放，顯性陰性p53）和Snu398（p53無效）饰恕。細胞保存在DMEM（C3A、Hep3B和PLC/PRF/5）或RPMI 1640（Snu398）中井仰。培養(yǎng)基中添加1% L-谷氨酰胺埋嵌、1%青霉素-鏈霉素和10% FBS（Atlanta Biologicals）。細胞以40萬/孔的速度接種于六孔板（Sigma Aldrich）進行檢測或兩孔觀察室（Thermo Fisher）進行顯微鏡觀察俱恶。24小時后雹嗦，按照制造商的說明，使用JetPrime試劑（PolyPlus Transfection）轉(zhuǎn)染每孔1pmol DNA合是。所有實驗均在細胞傳代5至20代之間進行了罪。

線粒體染色、顯微鏡和圖像分析：

轉(zhuǎn)染24小時后端仰，細胞與之前一樣染色捶惜，然后使用熒光尼康A1R共聚焦顯微鏡（Cell Imaging Core Facility，University of Utah）的60X Plan Apo油浸物鏡成像荔烧。與之前一樣吱七，使用NIS軟件進行圖像可視化，并使用ImageJ中的JACoP插件進行Pearson’s correlation coefficient (PCC)共定位分析和post-Costes’自動閾值算法重復實驗鹤竭，每個構(gòu)建物/細胞系≥30個細胞踊餐。

TMRE化驗：

四甲基羅丹明乙酯(TMRE)測定方法如前所述。簡單地說臀稚，細胞在轉(zhuǎn)染24 h后成球吝岭，在100nM的TMRE（Invitrogen）中重懸，在37°C下孵育20-40m。孵育后窜管，流式細胞儀分析細胞（FACS-canto-ii散劫，使用FACS Diva軟件，流式細胞儀核心設施幕帆，猶他大學）获搏。實驗重復3次，每3次獨立轉(zhuǎn)染失乾，然后將最低的線粒體試驗外膜通透性（MOMP）值設為0%常熙，最高的MOMP值設為100%歸一化，以結(jié)合實驗碱茁。

Annexin V檢測：

轉(zhuǎn)染24 h后裸卫，收集培養(yǎng)基和細胞，制粒纽竣，在冷PBS中洗滌2次墓贿，然后懸浮在100 μL冷膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液（Biolegend）中。每個樣品加入5μL apc偶聯(lián)膜聯(lián)蛋白V（Biolegend）退个，然后加入5μL 7-AAD（Biolegend）募壕，每次加入后，樣品在室溫下渦流孵育5 min语盈。每個樣品加入300 μL膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液舱馅，旋流保存，在LSRFortessa（BD-BioSciences, Flow Cytometry Core Facility）上進行分析刀荒。檢測細胞形態(tài)和EGFP（綠色熒光蛋白）表達（激發(fā)488 nm/檢測507 nm）代嗤，然后檢測annexin V（激發(fā)640 nm/檢測660 nm）和7-AAD（激發(fā)496 nm/檢測785 nm）。每個結(jié)構(gòu)在三個單獨的實驗中進行三次分析缠借，并將膜聯(lián)蛋白V數(shù)據(jù)歸一化干毅，最低（GFP）結(jié)構(gòu)為0%，最高為100%泼返。

7-AAD化驗：

7-氨基放線菌素D測定方法同前硝逢。簡單地說，轉(zhuǎn)染后將細胞制成顆粒24h（PLC/PRF/5和Snu398）或48h（C3A和Hep3B2.1-7）绅喉，然后在1.25μg/mL 7-AAD（Invitrogen）中重懸渠鸽。細胞冰凍后，流式細胞術(shù)（FACS-Canto-II）對細胞進行分析每個實驗重復3次柴罐，每3次獨立轉(zhuǎn)染徽缚，將7-AAD最低值設為0%，最高值設為100%歸一化革屠，將3次實驗合并凿试。

斑馬魚品系和Tg(fabp10a：p53-Bad*)斑馬魚的生成：

斑馬魚的所有護理和安樂死均按照猶他大學IACUC指南（21-09009）進行排宰。雌性和雄性Tg（fabp10a：pt-β-cat）和野生型AB和TL保持不變。對于Tg（fabp10a：p53-Bad*）那婉，用引物5 ' -CTAGTTAGATCTATGGAGGAGCCGCAGTCAG-3'和5' -TAAATTGCGGCCGCTCACTGGGAGGGGGCGGAG-3 '從pcpv-egfp-p53-Bad*中擴增出p53-Bad*板甘，含有BglII和NotI位點。在fabp10a啟動子之后详炬，將p53-Bad*插入到含有晶狀體特異性啟動子晶體蛋白αa (cryaa)的質(zhì)粒中虾啦，隨后是mCherry熒光蛋白編碼序列。該質(zhì)粒還具有I-SceI限制性內(nèi)切酶位點痕寓，可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因斑馬魚，簡而言之蝇闭，在奧林巴斯SZ51顯微鏡下呻率，將單細胞期的胚胎同時微注射fabp10a：p53-Bad*質(zhì)粒和I-SceI酶（New England Biolabs）。將受精后3~4天紅眼睛的胚胎飼養(yǎng)至成年呻引，并與野生型斑馬魚進行異交礼仗。將紅眼睛的后代指定為F0個建立者，培養(yǎng)F0個在3?4 dpf表達cryaamCherry的后代逻悠，以維持p53-Bad*F1B系元践。

qRT-PCR：

使用Direct-zol RNA迷你試劑盒（zimo Research）對每個細胞系、轉(zhuǎn)染細胞系和斑馬魚肝臟樣本進行RNA提取童谒。對于斑馬魚肝臟单旁，切片在解剖后立即在- 80°C冷凍，研磨饥伊，然后在TriReagent（zimo Research）中渦流象浑，然后提取RNA。提取RNA前琅豆，在TriReagent中渦流1x106個細胞/樣品愉豺。在使用Superscript III第一鏈合成系統(tǒng)試劑盒（ThermoFisher）制備cDNA之前，將樣品稀釋至相同的RNA濃度茫因。預先設計的Taqman探針（ThermoFisher）靶向人18S（Hs99999901_s1）蚪拦、人Bad（Hs00997773_m1）、人p53（Hs01034254_g1 TP53）冻押、人Mcl-1（Hs01050896_m1 MCL1）驰贷、人Bcl-2 （Hs01048932_g1 BCL2）、人Bcl-xL（Hs00236329_m1 BCL2L1）和斑馬魚β-actin （Dr03432610_m1 actb1）翼雀。使用Taqman Universal PCR Master Mix（ThermoFisher）在StepOnePlus實時熒光定量PCR機（Applied Biosystems）上在96孔板（Genesee Scientific）上運行qRT-PCR饱苟。每個樣本的數(shù)據(jù)一式兩份，根據(jù)標準曲線和18S（人細胞系樣本）或β actin（斑馬魚樣本）在Microsoft Excel中的表達進行歸一化狼渊。

肝臟解剖與組織學：

將Tg（fabp10a：pt-β-cat）斑馬魚（綠色眼睛）與Tg（fabp10a：p53-Bad*）基因F1B（紅色眼睛）雜交箱熬，分析幼魚和成年斑馬魚的組織學和肉眼變化类垦。用熒光解剖顯微鏡觀察受精后3天（dpf）或之后的眼睛顏色，將卵分為四組：(?)pt-β-cat/(?)p53-Bad*城须，(?)pt-β-cat/(+)p53-Bad*蚤认，（+）pt-β-cat/(?)p53-Bad*和(+)pt-β-cat(+)p53-Bad*。對于幼蟲實驗糕伐，斑馬魚被安樂死砰琢、解剖，和以前一樣分析良瞧。成蟲實驗中陪汽，飼養(yǎng)3只p53-Bad* f1bxβ-cat，并將其飼養(yǎng)在平行箱中（每箱4只）褥蚯。受精后6個月（mpf）挚冤，斑馬魚被快速冷卻安樂死。通過檢查眼睛顏色來確定基因型赞庶。稱重斑馬魚训挡，用奧林巴斯SZ51顯微鏡解剖肝臟，PBS沖洗歧强，稱重澜薄。計算肝臟與身體的質(zhì)量比。肝臟樣品在4%多聚甲醛中固定24-48 h摊册，然后在70%乙醇中保存肤京。樣品涂上藍色或黑色組織標記染料（StatLab醫(yī)療產(chǎn)品），噴灑3%醋酸丧靡，干燥5-10 s蟆沫，用70%乙醇沖洗，包裝在盒中温治，然后提交給ARUP實驗室進行石蠟包埋饭庞、切片和蘇木精-伊紅（H&E）染色。完成的載玻片經(jīng)盲法處理熬荆，由專業(yè)病理學家K.J.E.和以前一樣分析組織學變化標本被劃分為(1)HCC舟山，(2)輕度改變，或(3)正常/輕微改變卤恳。在GraphPad Prism 9.2.0中對(+)pt-β-cat/(?)p53-Bad*組和(+)pt-β-cat/(+)p53-Bad*組進行Fischer精確檢驗累盗。實驗進行了三次（三個獨立的離合器），每次都看到類似的趨勢突琳。圖4是這些實驗的匯總結(jié)果若债。

TUNEL檢測：

未染色的石蠟包埋肝切片切片重新水化。對于TUNEL實驗拆融，載玻片用ApopTag過氧化物酶原位凋亡檢測試劑盒（Millipore）處理蠢琳，片段DNA DAB染色和甲基綠反染啊终。使用尼康Eclipse TE2000-U顯微鏡捕獲每個肝臟橫切面的10個代表性框架（遠離組織邊緣和其他潛在的偽影）。對圖片進行盲法處理傲须，計數(shù)陽性染色（凋亡）細胞蓝牲。陽性對照，在非轉(zhuǎn)基因載玻片上進行DNaseI處理泰讽，顯示肝細胞核彌漫性染色例衍。采用Olympus BX53顯微鏡、DP73相機和cellSens Entry 1.16軟件拍攝具有代表性的H&E和tunel染色切片已卸。

統(tǒng)計數(shù)據(jù)：

除特別說明外佛玄，所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 6.01或9.2.0的Tukey事后檢驗進行單因素方差分析，其中ns=不顯著累澡，*p< 0.05翎嫡， **p<0.01， ***p< 0.001永乌， ****p< 0.0001。

結(jié)果

熒光顯微鏡檢測不同p53突變狀態(tài)的肝癌細胞系中p53-bad*的線粒體定位

為了確定p53-bad和/或p53-bad*是否能夠成功地使p53定位到線粒體具伍，我們用三種不同p53狀態(tài)的肝癌細胞系——c3a（p53 WT）翅雏、Hep3B（p53 null）和PLC/PRF/5（p53 R249S）進行了實驗。p53的細胞狀態(tài)有兩個問題：首先人芽，我們的p53-bad結(jié)構(gòu)體被假設會誘導細胞凋亡望几，而不管p53的狀態(tài)如何；其次萤厅，細胞中的p53可能與p53-bad結(jié)構(gòu)體四聚橄抹，導致p53-bad定位的改變和失活。r249s顯性負p53突變是特別有趣的惕味，因為在過去楼誓，WT p53基因治療的顯性負抑制一直是成功治療癌癥的障礙。

在顯微鏡研究中名挥，Hoechst和MitoTracker染料分別表明細胞核和線粒體位置疟羹，并且通過GFP融合熒光定位構(gòu)建體（圖2A）。正如預期的那樣禀倔，所有細胞系均未顯示GFP對照的特異性定位模式榄融，也未顯示W(wǎng)T p53構(gòu)建體的核定位模式13所有細胞系也顯示了p53-Bad的細胞核和線粒體定位，這很可能是由于p53的細胞核定位信號和Bad的MTS之間的相互作用救湖。S112A和S136A突變使Bad MTS能夠如預期那樣壓倒p53的核定位信號愧杯。這種效應在不同細胞系中強度不同，這可能是由于p53狀態(tài)不同鞋既。PLC/PRF/5 (R249S p53突變)似乎具有最強的p53-bad核內(nèi)定位力九，低于0.6閾值的線粒體共定位PCC被認為是線粒體共定位(圖2B)耍铜。這可能是由于p53-bad與突變的細胞p53結(jié)合，從而增加細胞核定位畏邢。Hep3B2.1-7是p53缺失的細胞业扒，沒有p53與p53 bad結(jié)合的能力。Hep3B2.1-7細胞核定位最少舒萎，被認為是線粒體共定位(PCC>0.6)程储。野生型p53細胞系C3A為中間核定位。所有三個細胞系的p53-Bad*均顯示PCC>0.6臂寝，表明定量線粒體共定位章鲤，并且與p53-Bad相比線粒體定位更多(圖2B)。

圖2 HCC細胞系顯微鏡下測定線粒體定位抗

(A)轉(zhuǎn)染CMV-GFP咆贬、CMV-GFP- bad败徊、CMV-GFP- bad、CMV-GFP-p53- bad掏缎、CMV-GFP-p53- bad皱蹦、CMV-GFP-p53- bad *的C3A (WT p53)、Hep3B2.1-7 (p53 null)和PLC/PRF/5 (p53 R249S)的代表性細胞眷蜈。細胞核顯示為藍色(Hoechst)沪哺，線粒體顯示為紅色(MitoTracker)，每個結(jié)構(gòu)體顯示為綠色(GFP)酌儒。(B)紅色(線粒體)和綠色(結(jié)構(gòu)體)的PCC共定位分析辜妓。

細胞系凋亡檢測p53-Bad*在4種肝癌細胞系中的凋亡活性

為了評估p53-Bad和p53-Bad*構(gòu)建體是否誘導肝癌細胞凋亡，我們對C3A忌怎、PLC/PRF/5籍滴、Hep3B和Snu398細胞系進行了三種不同的凋亡檢測。TMRE評估早期凋亡的MOMP變化榴啸，膜聯(lián)蛋白V探索中期凋亡膜的變化孽惰，7-AAD監(jiān)測細胞膜通透性的晚期凋亡轉(zhuǎn)移。為了確保凋亡的差異不是由構(gòu)建體的表達水平引起的鸥印，我們評估了每個細胞系灰瞻，發(fā)現(xiàn)p53-bad *的表達與WT p53相比一致（圖S2）。因此辅甥，與WT p53相比酝润，p53-Bad*的凋亡作用可能被低估了，在表達水平相同的情況下璃弄，p53-Bad*的凋亡作用可能會進一步增強要销。

圖S2 肝癌細胞系中p53 WT和p53-bad*蛋白表達水平直方圖

與WT p53相比，p53-bad/p53-bad*在所有四種細胞系中都增加了MOMP活性（TMRE測定）（圖3A）夏块。這種效應在Hep3B細胞中最為顯著疏咐，從WT p53到p53-bad和p53-bad*纤掸，MOMP增加了4倍以上。PLC/PRF/5和C3A細胞系顯示從WT p53到p53- bad/p53-bad*的MOMP增加2-3倍浑塞。Snu398細胞顯示借跪，從WT p53到p53-bad，MOMP僅輕微增加酌壕，但從WT p53到p53-bad*掏愁，MOMP增加了約兩倍（圖S1）。p53-Bad*在PLC/PRF/5和Snu398細胞中引起的MOMP明顯高于p53-Bad（圖3A和S1）卵牍。在任何細胞系中果港，Bad和Bad*單獨治療的療效都不如p53-Bad*強（p<0.0001）。

圖S1 Snu398細胞的早糊昙、中辛掠、晚期凋亡測定

圖3肝癌細胞系C3A、Hep3B和PLC/PRF/5的早释牺、中萝衩、晚期凋亡測定對于早期凋亡的TMRE檢測(左)，描述了MOMP陽性細胞的相對百分比没咙。對于中期凋亡膜聯(lián)蛋白V檢測(中)欠气，描繪了膜聯(lián)蛋白V陽性細胞的相對百分比。對于晚期7-AAD檢測(右)镜撩，描述了7-AAD陽性細胞的相對百分比。

annexin V測定的凋亡在所有四種細胞系中p53-Bad*結(jié)構(gòu)中最為普遍（圖3B）队塘。與WT p53相比袁梗，C3A和Hep3B細胞中p53-bad*的膜聯(lián)蛋白V凋亡均增加了約4倍，而PLC/PRF/5細胞也增加了約1.5倍憔古。對于Snu398細胞遮怜，p53-bad*與WT p53相比，凋亡增加了約1.5倍鸿市，但通過膜聯(lián)蛋白V測量锯梁，WT p53比p53-bad更有效地誘導凋亡（圖S1）。Hep3B焰情、PLC/PRF/5和Snu398細胞顯示p53-Bad*誘導的凋亡量高于Bad和Bad* （p<0.0001）陌凳。

7-AAD，一種晚期凋亡的測量方法内舟，也顯示p53-Bad*是所有四種細胞系中最有效的凋亡誘導劑（圖3C）合敦。在C3A、PLC/PRF/5和Hep3B2.1?7細胞中验游，p53-bad*顯示7-aad凋亡比WT p53增加2-3倍充岛。在Snu398細胞中保檐，p53-bad再次不如WT p53有效，但p53-bad*顯示7-AAD凋亡活性比WT p53增加了1.5倍（圖S1）崔梗。p53-Bad*在誘導凋亡方面均優(yōu)于Bad和Bad*（p<0.0001）夜只。

細胞系中mRNA基因表達的qRT-PCR分析顯示，與其他三種細胞系相比蒜魄，Snu398細胞中Bcl-xL的表達明顯減少（圖S3）扔亥。Hep3B細胞比其他細胞系表達更多的Mcl-1, PLC/PRF/5細胞比C3A或Snu398細胞表達更多的Mcl-1（圖S3）。C3A細胞表達的Bcl-2明顯高于Hep3B和PLC/PRF/5細胞权悟，而Snu398細胞表達的Bcl-2明顯高于PLC/PRF/5細胞砸王。經(jīng)WT p53、p53-bad或p53-bad*處理后峦阁，C3A細胞Bcl-xL mRNA水平升高（圖S4）谦铃。與WT p53相比，Hep3B2.1-7在p53-bad或p53-bad*處理后顯示出這種增加榔昔，PLC/PRF/5和Snu398細胞在p53-bad處理后顯示出與WT p53相比Bcl-xL mRNA水平的增加（圖S4）驹闰。

圖S3 Bcl-xL、Mcl-1和Bcl-2在肝癌細胞系中的表達

圖S4 WT p53撒会、p53-bad嘹朗、p53-bad*治療后Bcl-xL mRNA表達水平

斑馬魚的體內(nèi)研究

作為確定p53-Bad*在活體脊椎動物中的作用的第一步，我們在肝細胞特異性fabp10a啟動子的控制下產(chǎn)生了表達p53-Bad*的轉(zhuǎn)基因斑馬魚诵肛。通過qRT-PCR屹培，在Tg（fabp10a：p53-Bad*）斑馬魚的代表性隊列中證實了p53-Bad*的表達，同時使用靶向人類Bad和人類p53的探針（圖S5）怔檩。Tg（fabp10a：p53-Bad*）斑馬魚可育褪秀，無明顯表型。在6 dpf時薛训，Tg（fabp10a：p53-Bad*）斑馬魚和對照兄弟姐妹之間的肝臟大小沒有顯著差異（圖S6）媒吗。總之乙埃，這些數(shù)據(jù)表明p53-Bad*不會破壞非癌性肝組織闸英，至少不會超出斑馬魚肝臟的再生能力。

圖S5 p53-Bad*在斑馬魚中的表達

圖S6 斑馬魚受精后6天的幼蟲肝臟大小

為了確定p53-Bad*對斑馬魚肝癌發(fā)生的影響介袜，我們將Tg（fabp10a：p53-Bad*）斑馬魚與Tg（fabp10a：pt-β-cat）斑馬魚雜交甫何，它們表達肝細胞特異性活化的β-catenin，并在6個月大時以約80%的外顯率發(fā)展為HCC遇伞。我們分析了四個實驗組：(1)非轉(zhuǎn)基因(NT)沛豌；(2) Tg（fabp10a：p53-Bad*）；(3) Tg（fabp10a：pt-β-cat）；(4)Tg（fabp10a：p53-Bad*）加派；Tg（fabp10a：pt-β-cat）叫确。所有四組均增加至6 mpf，稱重芍锦，然后解剖計算肝臟與身體的質(zhì)量比竹勉，這是肝臟腫瘤負荷的指標（圖4A）。Tg（fabp10a：p53-Bad*）斑馬魚的肝臟與身體質(zhì)量比與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招值荇~相比無顯著差異（平均0.025 vs 0.034娄琉，p= ns）次乓。與之前一樣，Tg（fabp10a：pt-β-cat）斑馬魚的肝臟與身體質(zhì)量比顯著高于非轉(zhuǎn)基因斑馬魚（平均值0.085 vs 0.034孽水，p < 0.0001）票腰。Tg（fabp10a：p53Bad*）、Tg（fabp10a：pt-β-cat）斑馬魚表達肝細胞特異性p53-Bad*和pt-β-catenin的肝體質(zhì)量比顯著低于單獨表達pt-β-catenin的Tg（fabp10a：pt-β-cat）斑馬魚（平均0.044 vs 0.085女气， p < 0.0001）杏慰。

每個肝臟由委員會認證的病理學家K.J.E.進行組織學分析，并將其分為正常/輕微變化炼鞠，輕度變化或HCC27（圖4B缘滥，C）。與之前一樣谒主，27條表達肝細胞特異性激活β-catenin的斑馬魚比非轉(zhuǎn)基因的對照兄弟魚明顯顯示更多的HCC（圖4B, 87.5% vs 0%;Fisher精確檢驗朝扼，p < 0.0001）。肝細胞特異性p53-Bad*的共表達導致表達肝細胞特異性活化β-catenin的斑馬魚的HCC水平顯著降低（圖4B霎肯，67.4 vs 87.5%擎颖；Fischer精確檢驗，p = 0.04）观游。

圖4 p53-Bad*對F1B p53-Bad*斑馬魚HCC腫瘤影響的表征

(A) p53-Bad*對肝-體質(zhì)量比測定的肝癌腫瘤負荷的影響搂捧。(B) p53-Bad*對p53-Bad*的肝臟組織學影響。(C)未見明顯病理異常的雄性斑馬魚(上圖)-細胞核均勻备典、圓形、間隔規(guī)律意述，結(jié)構(gòu)正常提佣，包括分散的膽管(插圖)；輕度改變(中圖)-結(jié)構(gòu)正常荤崇，包括膽管分散(箭頭)拌屏，但偶見核增大(插圖)；HCC(下圖)-結(jié)構(gòu)紊亂术荤，核增大倚喂，多形性，不規(guī)則(插圖)。

為了確定p53-Bad*在體內(nèi)誘導的細胞凋亡活性端圈，我們對斑馬魚肝臟切片進行TUNEL染色焦读。非轉(zhuǎn)基因、僅p53-Bad*和僅pt-β-cat斑馬魚每10個高倍場（HPF）分別顯示0.83舱权、1.33和1.60個凋亡小體（圖5矗晃，p = ns，三種比較）宴倍。經(jīng)p53-Bad*處理的pt-β-cat魚平均每10 HPF有14個凋亡小體（圖5张症，P < 0.01）。綜上所述鸵贬，這些數(shù)據(jù)支持p53-Bad*誘導細胞凋亡俗他，導致β-catenin驅(qū)動的肝癌斑馬魚肝臟腫瘤負荷降低的假設。

圖5 p53-Bad*/pt-β-cat斑馬魚的細胞凋亡

(A)斑馬魚肝臟橫斷面TUNEL法檢測凋亡小體阔逼。(B) TUNEL染色代表性圖像;箭頭指向凋亡小體兆衅。

討論

在這里，我們證明在p53狀態(tài)可變的肝癌細胞系中颜价，與p53-bad和WT p53相比涯保，p53-bad*的線粒體定位和凋亡誘導增加。將這些結(jié)果擴展到斑馬魚體內(nèi)肝癌模型周伦，我們發(fā)現(xiàn)肝細胞特異性p53-Bad*減少了肝臟腫瘤負荷并促進了細胞凋亡夕春。

無論p53狀態(tài)或其他突變?nèi)绾危覀兊膒53-bad*融合構(gòu)建在所有肝癌細胞系和凋亡檢測評估中均能顯著誘導更多的細胞凋亡专挪，最高可達WT p53的4.5倍及志。這一發(fā)現(xiàn)不是由于蛋白表達增加，因為在所有細胞系中寨腔，WT p53的表達水平始終高于p53-bad*（圖S2）速侈。盡管p53-Bad在大多數(shù)情況下被證明是一種強大的凋亡誘導劑，但對Snu398細胞的凋亡實驗（圖S1）表明迫卢，至少一些細胞系對p53-Bad*的反應明顯高于p53-Bad倚搬。

盡管p53-bad*在四種細胞系中均能有效誘導凋亡，但不同細胞系中p53-bad*乾蛤、p53-bad和WT p53的凋亡活性差異令人感興趣每界，例如不同細胞系對WT p53的反應性存在差異，這可能與p53的突變狀態(tài)有關家卖。在C3A中眨层，WT p53的存在需要癌細胞進化才能破壞p53的促凋亡作用。增加WT p53的表達可能不足以克服這些顛覆性機制上荡。完全缺乏p53的Snu398細胞更容易受到WT p53過表達的影響（圖S1）趴樱。單獨使用Bad和Bad*的反應也存在差異，在C3A中，Bad和Bad*誘導細胞凋亡的效果始終高于WT p53（WT p53）叁征，在Snu398中纳账，Bad和Bad*誘導細胞凋亡的效果低于WT p53（p53 null），在Hep3B2.1-7（p53 null）和PLC/PRF/5（p53 R249S）中航揉，不同檢測方法之間存在差異塞祈。Bcl-xL和Bcl-2水平在細胞系之間的差異至少可以部分解釋這一現(xiàn)象；C3A對Bad和Bad*最敏感帅涂，與其他細胞系相比议薪，Bcl-xL和Bcl-2 （Bad的主要和次要結(jié)合伴侶）的表達水平也較高（圖S3）。Hep3B2.1-7和PLC/PRF/5細胞在Bad和Bad*的作用下表現(xiàn)出中等水平的凋亡活性（圖3）媳友，與其他細胞系相比斯议，它們的Bcl-xL水平相對較高，但Bcl-2水平非常低（圖S3）醇锚。對Bad/Bad*最不敏感的Snu398細胞Bcl-2水平有所升高哼御，但Bcl-xL水平相對較低（圖S3）。就與p53-Bad*的相互作用而言焊唬，Bcl-xL可能是這些因子中最關鍵的恋昼，因為Bcl-xL是Bad的主要結(jié)合伙伴；Bcl-xL水平似乎比Bcl-2對Bad/Bad*療效的影響更大赶促，而Snu398細胞是唯一Bcl-xL水平顯著降低的細胞系液肌，在WT p53和p53-Bad*之間，其凋亡活性的改善最信副酢（圖S1）嗦哆。

基于這一想法，我們簡要探討了我們的構(gòu)建物對細胞中Bcl-xL表達水平的影響（圖S4）婿滓。Hep3B2.1-7細胞經(jīng)p53-Bad或p53-Bad*處理后老速，與未處理和WT p53處理的細胞相比，Bcl-xL mRNA增加（圖S4）凸主。一種可能的解釋是橘券，癌細胞對治療的反應是增加Bcl-xL水平，試圖從凋亡中恢復過來卿吐。這種效應可能被略微高估了旁舰，因為在這個時間點仍然存活的細胞自然會比已經(jīng)發(fā)生凋亡的細胞平均表達更多的Bcl-xL。有趣的是在PLC/PRF/5細胞中但两，轉(zhuǎn)染p53-Bad后Bcl-xL水平升高鬓梅，而轉(zhuǎn)染p53-Bad*后Bcl-xL水平升高（圖S4）供置。這可能是由于p53-Bad*殺死癌細胞的速度更快谨湘，使癌細胞對這種結(jié)構(gòu)做出反應的時間更少。正如在所有細胞系中看到的p53-Bad*的強凋亡作用所證明的那樣（圖3），這些反應似乎不足以通過p53-Bad*阻止細胞凋亡紧阔，這可能是由于p53-Bad*融合與線粒體凋亡相關因子的相互作用比單獨的Bad更多（圖1）坊罢。

在Hep3B2.1-7中，WT p53誘導的凋亡比在Snu398中少擅耽，盡管這兩種細胞系都是p53均為零活孩。這種差異的一個可能解釋是這些細胞系之間關鍵基因如Bcl-xL、Mcl-1和/或β-catenin的不同表達乖仇。我們發(fā)現(xiàn)憾儒，與Hep3B相比，Snu398中Bcl-xL和Mcl-1的表達較低（圖S3）乃沙。由于單獨表達p53不足以誘導Hep3B細胞凋亡起趾，必須通過抑制Bcl-xL來補充，因此Bcl-xL在Snu398細胞中的低表達可能使其比Hep3B更容易被p53誘導凋亡警儒。同樣训裆，Hep3B細胞比Snu398細胞具有更高水平的活性β-連環(huán)蛋白。p53已被證明可促進β-catenin的降解蜀铲，因此边琉，β-catenin含量高的細胞（如Hep3B）可能比β-catenin含量低的細胞（如Snu398）需要更多的p53才能成功中和額外的β-catenin。

接下來记劝，我們探討了p53-Bad*在脊椎動物HCC模型中的療效变姨。我們產(chǎn)生了一種轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系Tg（fabp10a：p53-Bad*），在肝臟細胞中表達p53-Bad*隆夯，并將其與Tg（fabp10a：pt-β-cat）斑馬魚雜交钳恕，其中活化的β-catenin的肝細胞特異性表達導致約80%的斑馬魚發(fā)生6 mpf的HCC。我們發(fā)現(xiàn)p53-Bad*基因在β-catenin驅(qū)動的HCC模型中顯著降低了肝臟腫瘤負荷蹄衷，增加了細胞凋亡忧额。這一令人信服的發(fā)現(xiàn)表明，p53-Bad*在脊椎動物模型中抑制肝癌的發(fā)生愧口，而不會引起實質(zhì)性的毒性睦番。

我們觀察到p53-Bad*沒有顯著增加非癌性斑馬魚肝臟的細胞凋亡，至少有三種可能的解釋耍属。首先托嚣，p53-Bad*在斑馬魚肝細胞中的表達水平可能不足以導致細胞死亡。這種解釋不太可能厚骗，因為(a) p53-Bad*是由一種強的肝細胞特異性啟動子fabp10a驅(qū)動的示启；(b)通過qPCR檢測斑馬魚肝臟中p53-Bad*的顯著表達；(c)在p53-Bad*轉(zhuǎn)基因存在的情況下领舰，斑馬魚HCC的肝臟更小夫嗓，細胞凋亡更多迟螺，支持p53-Bad*凋亡活性。其次舍咖，p53-Bad*可能在大多數(shù)斑馬魚肝細胞中誘導細胞死亡矩父，但p53-Bad*轉(zhuǎn)基因沉默發(fā)生在一小部分肝細胞中，這些細胞能夠重新填充肝臟排霉。完全轉(zhuǎn)基因沉默似乎不能解釋p53-Bad*在非hcc斑馬魚中的低毒性窍株，因為我們在Tg（fabp10a：p53-Bad*）和Tg（fabp10a：p53-Bad*）；Tg（fabp10a：pt-β-cat）斑馬魚中檢測到類似的p53-Bad*表達攻柠。盡管如此球订，轉(zhuǎn)基因沉默和隨后的再生可能至少是低毒性的部分原因，特別是如果至少一些斑馬魚肝細胞中的p53-Bad*水平低到足以使細胞逐漸凋亡瑰钮。第三辙售，p53-bad*可以保留部分WT p53的癌特異性。這種可能性是出乎意料的飞涂，因為大多數(shù)p53的癌癥特異性是通過其作為核轉(zhuǎn)錄因子的作用發(fā)生的旦部，因此p53-bad*應該在線粒體中丟失〗系辏總的來說士八，我們假設在表達p53-bad*的非hcc斑馬魚中觀察到的低毒性涉及部分轉(zhuǎn)基因沉默、肝細胞再生和可能保留的一些p53癌癥特異性的組合梁呈。

斑馬魚HCC模型的兩個局限性是其體積小婚度，這阻礙了局部遞送方法，以及缺乏建立的斑馬魚HCC特異性啟動子官卡，如甲胎蛋白蝗茁，甘聚糖-3和白蛋白。我們實驗室未來的研究旨在探索基于甲胎蛋白的啟動子在HCC小鼠模型中的癌癥特異性遞送寻咒。在更大的動物模型和人類患者中哮翘，在p53-Bad*構(gòu)建體中加入動脈內(nèi)或腫瘤內(nèi)遞送和/或hcc特異性啟動子可以進一步增強p53-Bad*的有效性，同時限制毒性毛秘。

結(jié)語

綜上所述饭寺，p53-bad*在所有測試的肝癌細胞系中都能持續(xù)誘導有效的細胞凋亡，并且無論p53的突變狀態(tài)如何叫挟，它都能大大提了WT p53的凋亡活性艰匙，這表明它有望成為未來癌癥基因治療的一種方法，可以克服WT p53的許多缺點抹恳。在脊椎動物肝癌模型中员凝，p53-Bad*有效地降低了腫瘤負荷和HCC發(fā)病率，并誘導了細胞凋亡奋献，且毒性很小健霹。這項研究是首個針對肝癌的同類研究硕舆，也是首個在體內(nèi)證明p53-Bad*對任何癌癥有效的研究。特別有趣的是骤公，與我們的預期相反，p53-Bad*在斑馬魚中表現(xiàn)出最小的體內(nèi)毒性扬跋，盡管在該模型中缺乏癌癥特異性阶捆。這是令人鼓舞的證據(jù)，表明該基因結(jié)構(gòu)可能保留了WT p53的一些癌癥特異性钦听，同時獲得了增加的細胞凋亡功效洒试，表明p53-bad*具有進一步開發(fā)用于各種HCC患者治療的潛力。

基金：本項目由5R21CA241015-02基金會朴上、ALSAM基金會垒棋、R01CA222570基金會等資助。

原文：Bowman K E R, Ahne L, O’Brien L, et al. p53-Bad*  Fusion  Gene  Therapy  Induces  Apoptosis  In  Vitro  and  Reduces  Zebrafish  Tumor  Burden  in  Hepatocellular  Carcinoma[J]. Molecular Pharmaceutics, 2022, 20(1): 331-340.

原文地址：https://pubs.acs.org/10.1021/acs.molpharmaceut.2c00665