雜志：Cell Death and Disease

影響因子：9.685（2022）

年份：2022

通訊作者：Francesca Maradonna, Camilla M. Fontana.

通訊作者單位：Department of Fisheries,Faculty of Fisheries and Environmental Sciences, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, Iran.

摘要

背景：結腸癌是世界范圍內(nèi)的主要死亡原因之一刻获。近年來蜀涨，大麻素因其潛在的抗癌作用和癥狀管理而被廣泛研究。一些體外研究報道了anandamide(AEA)阻斷癌細胞增殖和遷移的能力蝎毡，但體內(nèi)研究的證據(jù)仍然缺乏厚柳。

方法：本研究評估了AEA暴露對移植HCT116細胞的斑馬魚胚胎的影響。將48hpf異種移植物分別暴露于10nMAEA沐兵、10nM大麻素1受體(CB1)拮抗劑/逆激動劑之一AM251和AEA+AM251别垮，以驗證AEA治療的特異性效果。

結果：通過共聚焦顯微鏡評估AEA的有效性扎谎，結果表明這些異種移植物的腫瘤大小較小碳想，腫瘤血管生成減少，并且沒有微轉(zhuǎn)移形成毁靶。為了獲得AEA作用的更深入證據(jù)胧奔，通過分子分析完成了顯微鏡觀察。對斑馬魚轉(zhuǎn)錄組進行的RNA測序報告了與細胞增殖预吆、血管生成和免疫系統(tǒng)有關的基因的下調(diào)龙填。相反，HCT116細胞轉(zhuǎn)錄不受AEA處理的影響拐叉。事實上岩遗，體外HCT116培養(yǎng)證實了AEA暴露不影響細胞增殖和活力，這表明腫瘤大小的減小主要取決于對魚的直接影響凤瘦，而不是對移植癌細胞的影響宿礁。AEA可通過socs3和pcnpmRNA及Vegfc蛋白水平降低細胞增殖和腫瘤血管生成，并可通過il-11a蔬芥、mhc1uba和csf3bmRNA的降低發(fā)揮抗炎作用梆靖。值得注意的是控汉，在暴露于AM251的群體中獲得的結果，其存在抵消了AEA的有益作用返吻。

結論：本研究通過促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的能力暇番，促進了AEA在個性化癌癥治療中的功效，并強烈支持將斑馬魚異種移植作為癌癥研究的新興模型平臺思喊。

關鍵詞：結腸癌，斑馬魚次酌，大腸癌細胞系HCT116細胞恨课，顯微注射，轉(zhuǎn)化研究

前言

在過去的幾十年里岳服，大麻素被廣泛用于姑息治療剂公，以緩解癌癥患者的疼痛、緩解惡心和刺激食欲吊宋。然而纲辽，迄今為止的幾項研究強調(diào)了使用大麻素時安全措施的重要性，以避免認知功能損害璃搜。另一方面拖吼，以大麻素為基礎的藥物在氧化應激過程的調(diào)節(jié)中的作用是認知障礙的基礎，并認識到內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)(ECS)是這種神經(jīng)保護活性的主要參與者这吻。然而吊档，在過去的幾年里，大部分的興趣指向增加大麻素抗腫瘤活性的知識唾糯，這取決于它們與ECS網(wǎng)絡或其他細胞途徑相互作用的能力怠硼，影響疾病的發(fā)生/進展。具體來說移怯，越來越多的報道強調(diào)了大麻素在癌癥擴散香璃、侵襲、血管生成舟误、遷移和轉(zhuǎn)移機制中的作用葡秒。ECS激動劑通過與大麻素受體結合，激活Gi/o蛋白偶聯(lián)受體脐帝，觸發(fā)信號級聯(lián)同云，下調(diào)促血管生成因子，包括血管內(nèi)皮生長因子(vegf)和血管生成素-2(ang2)堵腹。此外炸站，大麻素類化合物抑制血管生成和侵襲，誘導基質(zhì)金屬蛋白酶-1(TIMP-1)的組織抑制劑的釋放疚顷，而TIMP-1反過來又作為內(nèi)源性基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)抑制劑旱易。此外禁偎，大麻素能夠影響Wnt通路，從而改變上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和化療耐藥的證據(jù)已經(jīng)在不同的腫瘤類型中得到證實阀坏，并與β-catenin靶基因和間質(zhì)標記物的減少有關[9]如暖。以n-花生四烯酰基乙醇胺忌堂，anandamide(AEA)為研究對象盒至，先前的體外實驗結果證明了其在抑制乳腺腫瘤誘導的血管生成以及改變轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細胞的代謝、糖基化特征和遷移方面的作用士修。

以此為出發(fā)點枷遂，本研究旨在探討AEA對人大腸癌細胞系HCT116細胞的抗腫瘤作用，了解其作用機制斑馬魚異種移植模型的體內(nèi)作用棋嘲。與患者來源的異種移植物(PDX)和類器官不同酒唉，它們具有顯著的缺點，包括長時間的生長會給腫瘤帶來遺傳和表觀遺傳變化沸移，而斑馬魚異種移植物試驗具有幾個優(yōu)點痪伦。年輕的胚胎缺乏有效的免疫系統(tǒng)，因此雹锣，注射的癌細胞不會被排斥网沾，原發(fā)腫瘤和微轉(zhuǎn)移的形成很快。此外笆制，對小而透明的異種移植物的成像可以捕捉到AEA對HCT116移植細胞或魚本身的宏觀變化绅这。所有這些宏觀證據(jù)都將與更深入的分子工具研究相結合，例如RNA測序和Westernblot在辆，這將為理解AEA對腫瘤細胞增殖的作用機制提供基礎证薇，并有望成為未來研究的起點，將考慮使用這種大麻素進行體內(nèi)癌癥治療匆篓。

方法

實驗模型

使用野生型Tuebingen (WT)浑度、Tg(fiT:EGFP[70]和Tg(mpeg1:EGFP)22[71]轉(zhuǎn)基因斑馬魚系進行不同的分析。Tg(fli1:EGFP) y[70]在內(nèi)皮細胞標志物fli1基因啟動子的控制下表達EGFP[72]鸦概，而Tg(mpeg1:EGFP)922系呈現(xiàn)綠色熒光巨噬細胞群體箩张。按照標準程序?qū)︳~進行養(yǎng)護。0.17 mM KCl;0.33 CaCl;0.3 mM MgSO pH=7)窗市。所有飼養(yǎng)和實驗程序均符合意大利和歐洲保護科學用動物立法(指令2010/63/EU)先慷。所有實驗數(shù)據(jù)均以受精后小時數(shù)(hpf)、注射后小時數(shù)(hpi)和受精后天數(shù)(dpf)表示胚胎年齡咨察。

細胞培養(yǎng)和標記

HCT116細胞的選擇考慮了其去分化表型论熙、侵襲和轉(zhuǎn)移潛力以及臨床意義。對細胞進行支原體檢測(VenorGeM Classic,MinervaBiolabs GmbH摄狱，#11-1025)脓诡，并在含有glutamax-1的RPMI培養(yǎng)基1640中培養(yǎng)(賽默飛世爾科學公司无午，威瑟姆，USA祝谚，#61870036)宪迟，補充10%胎牛血清(賽默飛世爾科學公司，威瑟姆交惯，USA次泽，#10270106)，在37°C含5%CO2的濕化氣氛中培養(yǎng)席爽。對于異種移植箕憾，將細胞洗滌、trypsinized拳昌，并在含有Dil Vybrant紅色熒光染料(賽默飛世爾科學,威瑟姆，USA钠龙，#V22885)的RPMI培養(yǎng)基中重新懸浮20分鐘炬藤，溫度37°C。然后將細胞以1200 rpm離心5 min碴里，丟棄上清沈矿，用PBS洗滌細胞2次。最后咬腋，將細胞重新懸浮在PBS中注射到斑馬魚蛋黃中羹膳。

異種器官移植

將野生型(WT)、Tg(fi1:EGFP)和Tg(mpeg1:EGFP) 922斑馬魚胚胎在48 hpf時用0.04%的三卡因(Merck KGaA, Darmstad, Germany根竿， #E10521)固定陵像，并將其放置在含有2%瓊脂糖的魚水厚膜上。為了研究腫瘤體積以及與宿主和治療分子的相互作用寇壳，將大約200-400個Dil標記(VybrantTM Dil)的HCT116細胞注射到卵黃囊的下段(補充圖1)醒颖。為了研究腫瘤的轉(zhuǎn)移潛力，將相同數(shù)量的細胞直接注射到居維葉靜脈中壳炎。注射后泞歉，將異種移植物保持在35℃芋簿，直到實驗結束嫂拴。在3 hpi時，注射失敗的異種移植物被丟棄枪芒。

體內(nèi)和體外給藥

花生四烯基乙醇酰胺（Anandamide-AEA）（Merck KGaA铲球，達姆斯塔德挺庞，德國，#94421-68-8）和 1-(2,4-二氯苯基)-5(4-碘苯基)-4-甲基-N-1-哌啶基-1H -吡唑-3-甲酰胺 (AM251)（Merck KGaA睬辐，達姆斯塔德挠阁，德國宾肺，#183232-66-8），在100%乙醇中溶解侵俗，在魚水中進一步稀釋锨用，并在10 nM下使用。

體內(nèi)暴露

6 hpi時隘谣，將斑馬魚異種移植物隨機分為4個實驗組:

●對照(Ctrl):暴露于乙醇(乙醚)AEA:暴露于10nM AEA

●AM251:暴露于10nM AM251

●AEA+AM251:暴露10 nM AEA+10 nM AM251

每日更換化學藥品增拥，直至4 dpf。對照組接受了等量的用于溶解化學物質(zhì)的乙醚寻歧。

體內(nèi)實驗的樣本量在整個手稿的圖例中顯示掌栅。斑馬魚實驗中使用的樣本大小由alpha誤差為0.05，統(tǒng)計力為95%確定码泛。6個對照和6個突變/處理樣本的最小數(shù)量由樣本總體所需的大小暗示(sample size Calculator,ClinCalc.com)猾封。熒光篩選后每個實驗可獲得的個體胚胎數(shù)量也對樣本量有影響。

通常會影響卵窩5-10%的嚴重先天性異常被排除在分析之外噪珊。數(shù)據(jù)排除的目的僅是收集由特定治療引起的具有生物學意義的表型晌缘，而不是來自野生動物中常見的零星變化。

體外暴露

采用細胞計數(shù)Kit-8比色法(CCK-8,Bimake痢站，USA磷箕，#B34304)測定細胞活力。將HCT 116細胞用RPMI 1640(Thermo Fisher Scientific阵难，沃爾瑟姆岳枷，USA，#61870010)和10%胎牛血清(FBS)以5個×10-3細胞/孔的密度接種于96孔板中呜叫。37℃孵育24 h后空繁，取出培養(yǎng)基，加入含有0.5%FBS和AEA的新培養(yǎng)基朱庆。將AEA在EtOH中直接溶解于細胞培養(yǎng)基中至50μM溶液家厌，然后依次稀釋至最終測試濃度為5、10椎工、100 nM和1饭于、5μM。濃度的選擇是基于先前在不同細胞系中評估AEA抗癌特性的體外研究维蒙。細胞在37°C下處理72小時掰吕，每天更換培養(yǎng)基，之后測量細胞活力颅痊。簡單地說殖熟，在每孔中加入10μl CCK-8試劑，在37°C下孵育30 min斑响，然后使用酶標儀(Infinite F200 PRO,Tecan,M?nnedorf菱属，瑞士)測量450 nm處的吸光度钳榨。以對照組吸光度為100%細胞活力。存活率的計算公式為:“[處理細胞的OD(光密度)背景吸光度/未處理細胞的OD(對照)-背景吸光度]×100”纽门。所有對照和樣品均通過4個獨立實驗進行測量薛耻，每個濃度重復5次。數(shù)值以平均值±SD表示赏陵。

實時成像

用0.04%的三卡因麻醉3 dpi WT饼齿、Tg(fli1:EGFP)y1和Tg(mpeg1:EGFP)gl22異種移植物，包埋在1%的低熔點瓊脂糖中蝙搔，置于壓片上缕溉，用共聚焦顯微鏡分析。尼康C2共聚焦系統(tǒng)(尼康吃型，Minato证鸥，日本)，連同軟件NIS ELEMENTS勤晚，被用來記錄圖像敌土。在3 dpi時，注射于居維葉靜脈的WT異種移植物用0.04%三卡因麻醉运翼，包埋于1%低熔點瓊脂糖中，置于凹載玻片上兴枯，使用徠卡DMR熒光顯微鏡(徠卡血淌，Wetzlar，德國)和尼康DS-Fi2數(shù)碼相機進行分析财剖。

腫瘤體積悠夯、血管生成、轉(zhuǎn)移勢量化

使用尼康C2共聚焦系統(tǒng)獲得的WT躺坟、Tg(fli1:EGFP)y1和Tg(mpeg1:EGFP)gl22異種移植物的所有圖像使用Fiji成像軟件(https://imagej.net/software/fiji/)進行分析沦补。通過計算每個Z堆疊的腫瘤面積(紅色熒光結構)獲得腫瘤大小，同時使用圖像計算器過程進行血管生成量化咪橙。為了僅識別內(nèi)皮細胞夕膀，從fli1-eGFP信號中減去HCT116熒光信號。根據(jù)前人的工作計算總信號強度美侦。使用Tg(mpeg1:EGFP)gl22異種移植物進行巨噬細胞分析产舞，通過計算腫瘤周圍區(qū)域存在的巨噬細胞數(shù)量。為所有樣本選擇一個相等的區(qū)域菠剩。

通過計算在所有不同處理條件下發(fā)生微轉(zhuǎn)移的3-dpi幼蟲的數(shù)量來計算微轉(zhuǎn)移動物的百分比易猫，盡管只在蛋黃中注射。用Fiji成像軟件分析動物居維葉靜脈直接注射轉(zhuǎn)移瘤的總熒光具壮，觀察治療分子對轉(zhuǎn)移瘤增殖的影響准颓。

RNA提取哈蝇，cDNA合成，實時熒光定量PCR

采用RNAzol RT(Merck KGaA攘已，達姆斯塔炮赦，德國，#R4533)贯被，從每組5池±20只幼蟲中提取總RNA眼五。基因組DNA通過DNase I酶切去除(Merck KGaA彤灶，達姆斯塔德看幼，德國，#AMPD1)幌陕。RNA濃度測定采用P330納米光度計(Implen,mnchen诵姜，德國)，完整性測定采用生物分析儀(Agilent,CA搏熄，USA)棚唆。總RNA的一部分用于cDNA合成心例，一部分用于建立RNA-seq文庫宵凌。用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosys-tems，沃爾瑟姆止后，馬薩諸塞州瞎惫，USA)從1μg總RNA中進行反轉(zhuǎn)錄。如前所述译株，qrt-pcr在CFX熱循環(huán)器(Bio-rad瓜喇，米蘭，意大利)中用SYBR綠色法進行歉糜。對于每個實驗組乘寒，重復(N=5)重復運行。最終引物濃度為10 pmol/μL匪补。同時使用核糖體蛋白13(rpl13)和核糖體蛋白0(rplp0)mrna對CFX Manager軟件3.1版(Bio-Rad)分析的靶基因表達水平進行歸一化伞辛，包括GeneEx Macro Conversion和GenEx Macro文件，結果用條形圖表示夯缺，并給出標準差始锚。使用primer-blast設計靶基因的特異性引物對(Supplementary Table 1)。

智人/D RNA-seq分析及差異表達分析-魚類異種移植

起始數(shù)據(jù)集包括來自四個實驗組(Ctrl喳逛、AEA瞧捌、AM251和AEA+AM251)的12個樣本的RNA-seq reads。使用FASTQC軟件(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)評估讀取的質(zhì)量，然后進行修剪步驟姐呐，以從讀取中去除適配器和低質(zhì)量堿基殿怜。使用以下參數(shù):最小長度設置為35 bp，質(zhì)量評分為25曙砂。TRIMMOMATIC軟件[81]用于該范圍头谜。平均而言，每個樣本獲得了1.4億個過濾讀數(shù)鸠澈。使用STAR aligner(version 2.7.9a)將高質(zhì)量的reads與智人基因組(GRCh38-104)和D.rerio基因組(GRCz11-105)進行比對[82]柱告。平均而言，0.74%的總reads可以在人類基因組上唯一定位笑陈，81.76%的reads可以在斑馬魚基因組上唯一定位际度。為了在這兩個物種之間進行消歧，使用了disambigate軟件涵妥。Feature-Counts(version 2.0.0)[83]用于計算作為原始片段計數(shù)的基因表達值乖菱。此外，通過使用m值的修剪平均值和每千基百萬次歸一化的片段蓬网，對原始片段計數(shù)進行歸一化窒所。

Western blot分析

從3個不同的池中取出全幼蟲勻漿，每組15-20只幼蟲帆锋，電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF上吵取，如前所述。簡單地說锯厢，每種蛋白質(zhì)樣品采用4%堆疊和10%分離的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離7 mg皮官，并使用微型反式印跡電泳轉(zhuǎn)移細胞(Bio-Rad，米蘭哲鸳，意大利)將其電印跡到過濾器上。使用Trans-Blot TurboTM transfer System進行30分鐘的轉(zhuǎn)移盔憨。阻斷2%牛血清白蛋白(BSA;Merck KGaA,Darmstad,Germany徙菠，#A2153)在PBS中。以下初選抗體使用:LC3A/B(細胞信號郁岩，Beverly,MA婿奔，USA，#BK4108S)问慎，Caspase 3(細胞信號萍摊，Beverly,MA，USA如叼，#BK9661S)冰木，IL6(Abcam，劍橋，英國踊沸，#ab208113歇终，)和VEGFC(細胞信號，Beverly,MA逼龟，USA评凝，#BK2445S，)抗體在含有2%BSA和0.1%TWEEN 20的PBS溶液中稀釋1:1000腺律，在4°C下孵育過夜奕短。β-肌動蛋白抗體(細胞信號傳導，Beverly,MA匀钧，USA翎碑，#BK4967S)作為內(nèi)標。用ECL-PLUS(GE Healthcare,Milano,Italy)化學發(fā)光試劑進行Western blotting觀察反應榴捡。使用Fiji Windows軟件進行密度分析杈女。

統(tǒng)計分析

RNA-seq統(tǒng)計分析用R和edgeR包進行。edgeR包確定差分表達式使用經(jīng)驗貝葉斯估計和基于負二項模型的精確測試吊圾。所有樣本中沒有表達的基因达椰，即零計數(shù)被丟棄。顯示FDR低于或等于0.05的基因被認為具有統(tǒng)計學意義项乒。使用graphpad Prism V9.0.1進行qPCR啰劲、Western blot和成像統(tǒng)計分析。(GraphPad Software,Inc.檀何，San Diego,CA蝇裤，USA)采用Shapiro-Wilk檢驗評估各組數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布(p>0.05)，采用Levene方差相等檢驗評估各組數(shù)據(jù)均為方差齊性(p>0.05)频鉴。數(shù)據(jù)以均數(shù)±SEM或±SD表示栓辜，并采用單向ANOVA和Dunnett多重比較檢驗進行分析。當收集到的數(shù)據(jù)以百分比表示時垛孔，在ANOVA之前進行arcsin變換藕甩。直方圖柱上的星號(*)或不同字母表示組間變化具有統(tǒng)計學意義。p值設為p<0.05周荐。使用Metaboanalyst 5.0在線平臺(University of Aberta,Edmonton,AB,Canada)對數(shù)據(jù)集進行中位數(shù)狭莱、對數(shù)變換和Pareto標度歸一化后，對p值<0.05的一組基因執(zhí)行無監(jiān)督PCA概作。為了可視化各組之間的分離腋妙，生成了一個2D評分圖，繪制了前兩個主成分讯榕，并計算了一個雙標圖骤素，以獲得有關投影中變量重要性的信息匙睹。

結果

移植最佳細胞數(shù)的優(yōu)化

初步實驗確定用于移植實驗的HCT116細胞的最佳數(shù)量。根據(jù)先前的研究谆甜，胚胎注射200-400或500-1000個細胞(1-3)垃僚。結果表明，只有在移植200-400個細胞的魚中规辱，AEA濃度才能顯著降低腫瘤細胞的增殖谆棺，因此以該細胞數(shù)為實驗對象。

 補充圖1 注射200-400個細胞和500-1000個細胞的WT異種移植物的HCT116腫瘤大小(3 dpi)以總Dil亮紅色熒光測量

每個試驗包括一個Ctrl組和一個AEA暴露組罕袋。取Ctrl中腫瘤大小的平均值為100%改淑。誤差條表示SEM (200-400 cells, Ctrl N = 17 AEA N = 12;500-1000個細胞，按Ctrl N= 11 AEA N=15)浴讯。統(tǒng)計學分析采用t檢驗分析朵夏。*， p < 0.05榆纽。

實驗性治療對HCT116斑馬魚異種移植腫瘤生長的影響

用共聚焦顯微鏡觀察HCT116細胞熒光仰猖，測定腫瘤體積。有趣的是奈籽，在暴露于AEA的異種移植物中饥侵，腫瘤大小明顯小于Ctrl(圖1A,B)。這一結果表明衣屏，AEA可以通過影響正常細胞增殖來影響腫瘤生長躏升。這一假設進一步得到了暴露于1-(2,4-二氯苯基)-5-(4-碘苯基)-4-甲基-n-1-哌啶基-1h-吡唑-3-羧酰胺(AM251)，大麻素1(CB1)受體1逆激動劑/拮抗劑[16]/或AEA+AM251的異種移植物的證據(jù)的支持狼忱，其中腫瘤大小與Ctrl幼蟲相似(圖1B)膨疏。轉(zhuǎn)移性沉積是癌癥治療的主要問題之一，在異種移植物中得到了進一步的研究钻弄。在所有實驗組中都觀察到HCT116細胞微轉(zhuǎn)移佃却，但在暴露于AEA的魚中，與Ctrl魚(28%)相比窘俺，顯著減少(4%)饲帅，表明AEA對這一病理過程有積極作用。在Ctrl(28%)批销、AM251(28%)和AEA+AM251(24%)實驗組中洒闸，出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的魚的比例相似(圖1C)染坯。

圖1AEA暴露控制異種移植物的腫瘤大小和轉(zhuǎn)移發(fā)生

5dpf(3dpi)幼蟲的代表性共聚焦z疊圖像均芽，腫瘤細胞被紅色熒光標記(Dilvivid紅色染色)。比例尺100μm单鹿。B定量總Dilvivid紅色熒光掀宋。取Ctrl鍵下腫瘤大小的平均值為100%。誤差條表示SEM。C四種實驗條件下出現(xiàn)微轉(zhuǎn)移的幼蟲百分比劲妙。(按Ctrln=66;AEAn=73;AM251n=63;AEA+AM251n=69(5個獨立實驗)湃鹊。采用單因素ANOVA進行統(tǒng)計分析。*p<0.01镣奋。用Biorender.com創(chuàng)建的圖像币呵。

實驗處理對腫瘤血管生成的影響

使用Tg(fli1:EGFP)y1轉(zhuǎn)基因異種移植物可以可視化魚的血管形成(圖2A)。特別是侨颈，在這些異種移植物中余赢，重點關注靠近腫瘤區(qū)域的血管，直接參與其支持和生長哈垢。在暴露于AEA的魚中妻柒，腫瘤周圍的血管生成(圖2B)比其他實驗組更不發(fā)達。特別是耘分，與腸下區(qū)域產(chǎn)生的血管相關的信號強度低于Ctrl組举塔。同時，Ctrl組與單獨使用AM251組或與AEA聯(lián)合使用組之間無差異求泰。此外央渣，使用Tg(mpeg1:EGFP)gl22轉(zhuǎn)基因異種移植物獲得的更深入的研究提供了證據(jù)，證明血管化的減少不是由腫瘤區(qū)域周圍巨噬細胞募集的不同引起的拜秧，因為在所有實驗組中都發(fā)現(xiàn)了相似的數(shù)量(補充圖2)痹屹。

圖2 AEA減少了fl1-gfp陽性異種移植物的血管化

5dpf(3dpi)幼蟲的代表性共聚焦z疊圖像，腫瘤用紅色熒光(Dilvivid染色)突出枉氮，血管用綠色熒光(Tg(fli1:EGFP)y1線)標記志衍。比例尺100μm。白框表示選擇用于量化血管化的感興趣區(qū)域(ROI)聊替。B定量ROI的總綠色熒光與斐濟分析楼肪。Ctrl鍵中的平均值設為100%。誤差條表示SEM惹悄。采用單因素ANOVA進行統(tǒng)計分析*p<0.05;(Ctrln=18;AEAn=18;AM251n=19;AEA+AM251n=16(三個獨立實驗)春叫。用Biorender.com創(chuàng)建的圖像。

巨噬細胞量化

補充圖2 HCT116細胞注射后mpeg1:EGFP幼蟲(3 dpi)的巨噬細胞分析

定量巨噬細胞(gfp陽性細胞)在相似感興趣區(qū)域(ROI)大小的數(shù)量泣港。每個個體的熒光被歸一化以表示其腫瘤體積暂殖。對照組中巨噬細胞的平均數(shù)量設為100%。誤差條表示SEM (Ctrl N = 10;AEA N = 9;AM251 N = 8;Aea + am251 n =11)当纱。樣本量來源于三個獨立的實驗呛每。

異種移植物中HCT116細胞轉(zhuǎn)移潛能的評估

這些結果為更詳細地分析AEA對轉(zhuǎn)移發(fā)生的影響奠定了基礎。因此坡氯，HCT116腫瘤細胞被直接注射到居維葉靜脈晨横，從而迫使轉(zhuǎn)移出現(xiàn)洋腮。由于AEA作用特異性的證據(jù)是通過其抑制劑AM251進行實驗獲得的，因此本實驗只考慮兩個實驗組:Ctrl和AEA手形。此外啥供，由于精確控制居維葉靜脈注射的HCT116細胞數(shù)量有時非常具有挑戰(zhàn)性，因此在注射后3小時(3hpi)库糠，根據(jù)注射的循環(huán)細胞數(shù)量將動物分為兩個亞組:小組和大組(圖3A)伙狐。各組異種移植物隨機分為按Ctrl處理和AEA處理兩種實驗條件。在3dpi時瞬欧，動物體內(nèi)存在的轉(zhuǎn)移細胞數(shù)量(以可檢測到的紅色熒光數(shù)量為單位)鳞骤。如圖3C和D所示，當腫瘤細胞直接進入血液循環(huán)時黍判，AEA治療可以減少轉(zhuǎn)移的生長豫尽。

圖3 AEA暴露降低HCT116轉(zhuǎn)移能力

將HCT116細胞直接注射到48hpfWT幼蟲的居維葉靜脈中。圖中顯示了考慮到HCT116循環(huán)細胞數(shù)為3hpi的實驗過程和異種移植物的分裂顷帖。圖片由Biorender.com制作美旧。B立體顯微鏡3dpiCtrl-(左)和AEA暴露的異種移植物(右)的代表性圖像。白色箭頭指向轉(zhuǎn)移中的HCT116細胞贬墩。C,D注射少量(C)和大量(D)細胞的3dpi斑馬魚幼魚HCT116轉(zhuǎn)移瘤細胞的綜合密度榴嗅。Ctrl鍵下的綜合密度均值設為100%。誤差條表示SEM陶舞。

斑馬魚和HCT116RNA-seq和RT-PCR驗證

從上述共聚焦顯微鏡研究獲得的結果開始嗽测，進行RNA測序分析，揭示參與腫瘤細胞增殖肿孵、血管生成和免疫反應的分子標記唠粥。由于觀察到重復之間存在很強的可變性，因此每個實驗組一個重復被丟棄停做。丟棄樣本的選擇是基于主成分分析后所有樣本的總體聚類晤愧，而不僅僅是特定比較中的聚類。在Ctrl組中蛉腌，AEA組中有38個差異表達基因(DEGs)官份，8個上調(diào)，30個下調(diào);AEA+AM251組中有6個DEGs,2個上調(diào)烙丛，4個下調(diào)舅巷。AM251與Ctrl幼蟲之間未發(fā)現(xiàn)DEGs(見熱圖，圖4)河咽。對于智人基因組钠右，不同實驗組之間沒有發(fā)現(xiàn)DEGs。RNAseq數(shù)據(jù)可通過NCBIBioproject-IDPRJNA911178獲取库北。然而爬舰，RNA測序結果的準確性和可靠性得到了一系列Real-Timepcr的支持，無論是DEGs寒瓦，假發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05情屹，還是考慮到它們在細胞增殖，血管生成和免疫系統(tǒng)中的作用(vegfaa,vegfab,vegfd,mep1b,socs3,csf3b,il11a,mhcIuba,pcnp,casp3)選擇不具有統(tǒng)計學意義的基因(FDR≥0.05)杂腰。有關所選基因描述的詳細信息見補充表1垃你。不同實驗組間的PCR結果見補充資料。如補充圖3和4所示喂很，逆轉(zhuǎn)錄定量的相對豐度聚合酶鏈反應(RT-qPCR)結果與RNA-Seq結果一致惜颇，表明兩種技術的轉(zhuǎn)錄物鑒定和定量高度一致。從RNASeq分析中選擇的基因與RT-qPCR的表達強度一致少辣。

圖4 熱圖顯示了暴露于AEA和AEA+AM251的斑馬魚異種移植物中DEG的列表

AEAvsCtrl凌摄。BAEA+AM251vsCtrl。顏色刻度表示兩組之間的折疊變化漓帅，如所述(綠色=下調(diào)锨亏，紅色=上調(diào))。僅納入顯著DEGs(FDR<=0.05)忙干。箭頭表示本研究中分析的DEGs器予。

補充表2 引物列表

補充表1基因鑒定、描述及相關Kegg通路

RT-PCR驗證rna序列通過Real Time PCR對感興趣的基因進行定量捐迫，以驗證RNA測序結果乾翔。在AEA處理的異種移植物中，csf3b施戴、il11反浓、socs3、mhcluba和pcnp mRNA的表達顯著下調(diào)赞哗。AM251組和AEA+AM251組的mRNA水平與對照組相似勾习。在所選擇的基因中，只有meplb的表達在AEA暴露的魚中顯著上調(diào)(補充圖3 a-f)懈玻。根據(jù)RNA序列分析巧婶，casp3 (Supplementary Figure 4a)、vegfaa涂乌、vegfab和vegfc mRNA水平?jīng)]有明顯變化艺栈。然而，盡管沒有統(tǒng)計學意義湾盒，AEA處理導致vegfs mRNA下調(diào)(補充圖4 b-d)湿右。

補充圖3所選基因的實時PCR分析

Soc3 (a)， csf3b (b)罚勾， mhcluba (c)毅人， meplb (d)吭狡， pcnp (e)， illa (f)mRNA水平異種移植物丈莺，對rplp0和rpll3a歸一化划煮。數(shù)據(jù)以平均SD (N-5)表示。各列上方星號*表示實驗組間差異顯著(P<0.05)缔俄，采用單因素方差分析弛秋，并進行Tukley多重比較檢驗。

補充圖4異種移植物中casp3 (a)俐载， vegfaa (b)蟹略， vegfab (c)， vegfd(d) mRNA水平遏佣，與rplp0和rpll3a歸一化

數(shù)據(jù)以平均SD (N-5)表示挖炬。各列上方星號表示各實驗組間差異顯著(P<0.05)，采用單因素方差分析后再進行Tukey多重比較檢驗状婶。

參與腫瘤細胞存活/生長的生物標志物分子分析

Westernblot分析Lc3A/B和Casp3WT異種移植物在實驗組間無明顯變化茅茂。相反，Vegf-C和Il6蛋白分析顯示太抓，暴露于AEA的異種移植物顯著減少空闲。單獨暴露于AM251或與AEA聯(lián)合暴露的異種移植物沒有引起明顯的變化(圖5)。

圖5AEA對血管生成和炎癥相關分子靶點的影響

插圖顯示了不同實驗組中具有代表性的Il6走敌、Vegf-C碴倾、Casp3、Lc3A/B和β-ActWesternBlot掉丽。三個獨立實驗的密度分析跌榔，a.u(任意單位)aIl6,bVegf-C,cLc3A/b,dCasp3。每列上方不同字母表示組間統(tǒng)計差異(單因素方差分析捶障，P<0.05)僧须。

體外AEA對HCT116細胞增殖的影響

為了研究AEA暴露對細胞活力和增殖的影響，將HCT116細胞培養(yǎng)在0.005~5μM范圍內(nèi)的5種不同濃度的AEA中项炼。體外試驗在低血清濃度(即0.5%血清)下進行担平，以限制細胞生長并增加細胞對該化合物的反應性。事實上锭部，大麻素的作用是細胞環(huán)境依賴的暂论，受生長因子的存在調(diào)節(jié)。72h后使用CCK-8測定法評估細胞活力拌禾，但與之前在動物模型中觀察到的結果相反取胎，所有AEA濃度都沒有抗增殖活性。下圖為不同濃度AEA對細胞體外活力的影響(補充圖5)

補充圖5 AEA不影響HTC116細胞的體外活力

條形圖顯示不同AEA濃度下HCT116細胞的增殖情況。各列上方同字母(a)表示實驗組間差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)闻蛀。

多變量統(tǒng)計分析

計算PCA以可視化整個基因表達數(shù)據(jù)集匪傍。該技術允許將組內(nèi)樣本可視化為單個點，繪制在用計算的PC1構建的二維空間中觉痛。PC分數(shù)用于確定樣本在二維空間中的位置役衡。PC的順序表明它們在數(shù)據(jù)集中的重要性，PC1占最大的變化量秧饮。從PCA中發(fā)現(xiàn)Ctrl與AM251和AEA+AM251基團重疊，而AEA基團單獨聚集(圖6A)泽篮，總的累積解釋方差(68.8%)令人滿意盗尸，表明AM251在與AEA聯(lián)合給藥時能夠恢復Ctrl狀態(tài)。生成雙標圖帽撑，顯示加載分析和PCA(圖6B)泼各。該分析允許理解變量在構建模型中的貢獻。每個變量的加載顯示為紅色箭頭亏拉，并顯示每個變量的名稱(圖6C)扣蜻。箭頭的長度與模型中的貢獻成正比，箭頭點與中軸線的距離反映了它們對PC1或PC2的貢獻及塘。為該模型提供最大變異的兩個基因是soc3和mhcluba莽使，前者對兩種PC1的貢獻幾乎相同，而后者對PC1的貢獻大于PC2笙僚。csf3b和il11a對PC1的貢獻幾乎相同芳肌，對PC2的貢獻很小，而pcnp對PC1的貢獻從圖中可以看出肋层，對PC2的貢獻很小亿笤。此外，vegfc和mep1b僅顯示出對PC1的輕微影響栋猖，同時IL-6對PC1內(nèi)部構建的模型的貢獻很小净薛。

圖6PCA顯示AEA異種移植物明顯分離，Ctrl蒲拉、AM251和AEA+AM251基團重疊

Ctrl(紅色)肃拜、AEA(綠色)、AM251(藍色)和AEA+AM251(淺藍色)的評分圖A有95%置信區(qū)域或B沒有95%置信區(qū)域雌团。坐標軸顯示PC1(63%)和PC2(19.3%)的分數(shù)爆班。CBiplot顯示了加載分析，紅色箭頭表示變量辱姨。下軸和左軸表示PC1和PC2的得分柿菩，上軸和右軸表示加載值。

討論

從宏觀證據(jù)出發(fā)雨涛，AEA暴露使異種移植物腸道亞血管化減少枢舶，從而影響腫瘤生長懦胞，綜合本多學科方法獲得的結果，強烈提示AEA能夠改變腫瘤環(huán)境凉泄，使腫瘤細胞增殖條件變差躏尉，其生存能力不受直接影響。在這些異種移植物中后众，RNAseq確實揭示了這一點無論治療方式如何胀糜，HCT116細胞轉(zhuǎn)錄本之間沒有差異，這一證據(jù)通過體外癌細胞暴露于AEA進一步觀察到蒂誉。事實上教藻，AEA暴露在每個測試濃度下都不影響細胞活力，更深入的分析右锨，集中在10nM濃度下括堤，顯示暴露不影響細胞增殖和凋亡(數(shù)據(jù)未顯示)。

RNAseq分析可以鑒定出一組轉(zhuǎn)錄本绍移，這些轉(zhuǎn)錄本合作創(chuàng)建適合HCT116細胞增殖和腫瘤血管化的適當微環(huán)境悄窃。在DEGs中，考慮到socs3蛋白在結直腸癌蹂窖、乳腺癌和卵巢癌中的致癌作用轧抗，我們選擇了細胞因子信號3的抑制因子socs3蛋白。一些研究描述了它通過激活Il-6/Jak/Stat3通路瞬测，在調(diào)節(jié)炎癥鸦致、血管生成和細胞存活的關鍵蛋白，包括Vegf涣楷、Il-6和Bcl-2中的作用分唾。因此，本研究的結果表明狮斗，AEA通過下調(diào)斑馬魚社會mRNA可能導致暴露于AEA的異種移植物中Il6和Vegf蛋白的減少绽乔，通過Westernblot分析，可能影響Il6/Jak/Stat3信號傳導碳褒。該信號在觀察結果中的關鍵作用也得到了PCA的證實折砸。然而，RNA-seq顯示jak1和stat3mRNA呈下降趨勢沙峻，盡管不顯著睦授，這與報道AEA抗增殖作用的研究一致。對于Vegf家族成員摔寨，研究報道Vegf因子的低表達與影響血管生成的腫瘤體積減小一致去枷。因此，正如之前在體外觀察到的那樣，在小鼠異種移植模型中删顶，可以假設AEA可能通過降低VEGF水平來調(diào)節(jié)腫瘤增殖竖螃，從而影響內(nèi)皮細胞和HCT116細胞之間VEGF/VEGFR2-的結合。此外逗余，腫瘤相關巨噬細胞(tumorassociatedmacrophages,tam)在缺氧條件下也能產(chǎn)生VEGF特咆，分泌VEGF。因此录粱，雖然沒有觀察到巨噬細胞數(shù)量的變化腻格，但可以認為，AEA可能不會影響TAM的遷移啥繁，從而增加了它們的數(shù)量菜职，而只是VEGF的分泌，從而造成了對腫瘤細胞生長不利的環(huán)境输虱。事實上些楣，已知HCT116細胞表達高水平的VEGF脂凶，通過旁分泌/自分泌血管內(nèi)皮信號保證其生長宪睹。

事實上，在結直腸癌中蚕钦，Vegf的高表達與預后不良相關亭病，Vegf-c的下調(diào)導致腫瘤啟動細胞減少和轉(zhuǎn)移抑制，這支持了我們在異種移植中觀察到的無轉(zhuǎn)移嘶居。在aea誘導的DEGs中罪帖，集落刺激因子3(粒細胞)b(csf3b)是一種促進單核細胞和巨噬細胞活化的多效細胞因子，通過合成VEGF促進血管生成邮屁，特別是在原始內(nèi)皮小管形成的早期整袁。因此，其下調(diào)可能導致觀察到的Vegf-C蛋白減少佑吝。

一些研究報道坐昙，AEA治療可以通過調(diào)節(jié)炎癥靶基因和激活炎性小體成分來減輕炎癥。在這項競賽中芋忿，RNA-seq分析和Westernblot數(shù)據(jù)均報告Il6水平下降炸客，支持AEA抗炎活性。Il6的高產(chǎn)量確實會導致豐富的炎癥環(huán)境戈钢，并能促進癌細胞的惡性轉(zhuǎn)化痹仙，支持癌細胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移傳播殉了。已知IL6通過作用于抗凋亡开仰、血管生成、增殖和免疫反應因子，包括BCL-2抖所、BCL-xL梨州、VEGF和MMP2/9的轉(zhuǎn)錄，導致STAT3磷酸化和二聚化田轧。

在這方面暴匠，在本研究中，人類和斑馬魚的轉(zhuǎn)錄組均顯示bcl-2下調(diào)傻粘，盡管沒有統(tǒng)計學意義每窖，但可能與Il6減少有關，這與先前在IL6?/?小鼠中的研究結果一致弦悉。本研究中觀察到的bcl2水平缺乏顯著變化窒典，表明細胞凋亡在腫瘤生理或幼蟲生長中的作用都很微弱。這一結果得到了Caspase3分析的支持稽莉，實驗組之間的mRNA和蛋白水平?jīng)]有變化瀑志，這表明細胞凋亡在異種移植物生理的這一特定階段起著邊緣作用。

最近污秆，一種新的參與細胞周期調(diào)控劈猪、轉(zhuǎn)錄和凋亡的核因子被發(fā)現(xiàn)，即含有pest的核蛋白(PCNP)良拼。該因子以組織特異性的方式降解與腫瘤細胞生長和分化相關的殘留蛋白战得。因此，我們測量的斑馬魚pcnp的下調(diào)可能與stat3和stat5的減少(盡管不顯著)有關庸推，影響了上述Il6/Jak/Stat3信號傳導常侦。

除了Il6,AEA處理也影響il11轉(zhuǎn)錄水平。Il11是與Il6細胞因子家族相關的細胞因子贬媒，控制抑制核因子NF-kB的釋放聋亡，NF-kB是促炎細胞因子的轉(zhuǎn)錄激活因子。它已在包括胃腸道和肝臟在內(nèi)的許多器官中被檢測到际乘，并已被證明可促進CRC和前列腺癌的進展坡倔。第一次，在我們的模型中蚓庭，Cel結果表明致讥，AEA誘導il-11顯著下調(diào)，可能影響Il11/Stat3通路器赞。這一結果與先前的數(shù)據(jù)一致垢袱，這些數(shù)據(jù)描述了內(nèi)源性大麻素對JAKs和STAT家族成員以及白細胞介素的抑制作用，并表明其作為一種具有強大抗腫瘤潛能的分子實體的作用港柜。另一個分析的過程是自噬请契，自噬被認為是一把雙刃劍咳榜，因為它可以調(diào)節(jié)腫瘤抑制和腫瘤細胞存活。

在本研究中爽锥，LC3蛋白水平在實驗組之間沒有明顯變化涌韩。然而，在我們的異種移植物中氯夷，可以假設自噬調(diào)節(jié)的兩種可能情況:在對照組和暴露于AM251的組中臣樱，自噬調(diào)節(jié)代謝物攝取，有利于HCT116增殖腮考，正如之前在不同的癌細胞系中觀察到的那樣雇毫。而在暴露于AEA的異種移植物中，可以假設自噬發(fā)揮細胞保護踩蔚、組織保護和抗炎作用棚放，這得到了促炎趨化因子減少的支持，并與暴露于AEA的人角質(zhì)形成細胞的結果一致馅闽。此外飘蚯，主要組織相容性復合體(MHC)是所有有核細胞的免疫反應和非自我表達的膜識別的主角之一。MHC-I的主要功能是向CD8+T細胞呈遞肽抗原福也，觸發(fā)其分化局骤，從而輔助免疫應答。對斑馬魚轉(zhuǎn)錄組的RNA-seq分析顯示mhcIuba轉(zhuǎn)錄下調(diào)拟杉，其與哺乳動物MHC具有高度的同一性庄涡，表明AEA處理激活了自然殺手介導的免疫反應量承，從而促進腫瘤細胞死亡搬设。然而，由于AEA對MHC-I對非自體識別的控制有待深化撕捍，因此還需要進行一些研究拿穴。根據(jù)我們的轉(zhuǎn)錄結果，我們可以推測其減少可能與il11mRNA水平的降低有關忧风，正如最近在HD11細胞系中所證明的那樣默色。研究內(nèi)源性大麻素如何減輕抗原免疫反應可能會很有趣，不僅關注炎癥的控制狮腿，還關注自我和非自我之間的調(diào)節(jié)腿宰。

我們的研究結果證實了金屬蛋白酶家族基因表達的變化。金屬蛋白酶(ADAMs)是參與結締組織穩(wěn)態(tài)缘厢、腸道屏障功能和免疫過程的細胞外蛋白酶吃度。其中，meprins具有特殊的結構和功能特征:meprinα是一種促血管生成酶贴硫，促進腫瘤進展椿每，而meprinin主要與某些疾病有關伊者。金屬蛋白酶的底物是許多跨膜蛋白，如TNF-a间护、IL6R等促炎細胞因子亦渗。此外，meprins通過調(diào)節(jié)IL1B汁尺、IL18和IL6的活性來平衡免疫環(huán)境法精，IL1B、IL18和IL6是組織損傷和炎癥反應中釋放的主要產(chǎn)物痴突。當細胞因子和單核細胞在機械應力或ROS產(chǎn)生的反應中發(fā)生不平衡時亿虽，meprins也參與ECM重塑。令人驚訝的是苞也，在本研究中洛勉，RNA-seq分析顯示mep1b基因表達增加，據(jù)一些研究報道如迟，mep1b基因表達增加可能與白細胞內(nèi)流促進和腫瘤細胞遷移導致細胞因子增加有關收毫。相反，在DEG中殷勘，Ils導致下調(diào)此再，這表明在我們的異種移植物模型中，mep1b可能僅參與幼蟲發(fā)育玲销，可能控制早期幼蟲典型的活躍細胞進展输拇。

結論

總的來說，我們的數(shù)據(jù)表明贤斜，AEA在細胞間腫瘤-內(nèi)皮細胞通訊的抗血管生成策吠、抗增殖和抗炎過程中起著關鍵作用，從而抑制腫瘤瘩绒，并證明斑馬魚幼蟲異種移植物是一種有前途的精準醫(yī)學快速檢測方法猴抹，在體內(nèi)環(huán)境中彌合了基因型和表型之間的差距。

基金：該項目由泰國國家研究委員會資助锁荔，并在清邁大學(HVD)和馬爾凱理工大學(OC)“內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)對癌癥治療的操縱:以斑馬魚為模型”的資助協(xié)議下實現(xiàn)蟀给。

本文章原文 Sella F, Giommi C, Facchinello N, ;   Cell Death Dis (2022);   PMID: 36564370

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