原名：Zebrafsh xenograft model for studying mechanism and treatment of non-small cell lung cancer brain metastasis

雜志：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research

影響因子： 11.3（2022）

年份：2021

通訊作者： Ming-Fang He

通訊作者單位：Institute of Translational Medicine, College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University

摘要

背景：腦轉(zhuǎn)移（BM）被認(rèn)為與非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的死亡率和不良預(yù)后有關(guān)拜姿。盡管NSCLC治療的發(fā)展前景光明烙样，但由于存在阻止藥物滲透的血腦屏障（BBB），以及離開治療的患者中位生存時(shí)間較短蕊肥，NSCLC BM的治療仍不樂觀谒获。在此背景下，NSCLC BM治療需要進(jìn)一步開發(fā)快速壁却、有效的臨床前模型批狱。在這里，我們報(bào)道了一個(gè)使用斑馬魚促進(jìn)NSCLC BM患者藥物開發(fā)的模型系統(tǒng)展东。

方法：采用3種不同的NSCLC細(xì)胞系（H1975赔硫、A549和H1299）建立斑馬魚BM模型。對(duì)注射用胚齡和細(xì)胞數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化盐肃。在斑馬魚的腦血管中觀察到轉(zhuǎn)移細(xì)胞爪膊，并用蘇木精-伊紅（HE）染色證實(shí)。然后砸王，我們還研究了通過操縱microRNA-330-3p（miR-330-3p）表達(dá)的H1975和A549的轉(zhuǎn)移潛能推盛。最后，檢測(cè)了H1975和A549對(duì)奧西替尼和吉非替尼的敏感性谦铃。

結(jié)果：該斑馬魚BM模型可以區(qū)分具有不同BM潛能的NSCLC細(xì)胞系耘成。過表達(dá)miR330-p顯著提高了A549細(xì)胞的BM潛能，而敲低miR-330-p則降低了H1975細(xì)胞的BM能力荷辕。奧西替尼和吉非替尼在斑馬魚BM模型中均有抑制效果凿跳，抑制率均高于50%。H1975細(xì)胞在體內(nèi)和體外對(duì)奧西替尼的敏感性均遠(yuǎn)高于吉非替尼疮方。

結(jié)論：我們建立了斑馬魚腦轉(zhuǎn)移模型控嗜，以研究NSCLC BM的治療機(jī)制和治療方法。本研究為NSCLC腦轉(zhuǎn)移提供了一個(gè)有用的模型骡显，可用于研究驅(qū)動(dòng)NSCLC細(xì)胞進(jìn)入大腦的機(jī)制疆栏，并確定潛在的治療方案。

關(guān)鍵詞：斑馬魚惫谤，腦轉(zhuǎn)移壁顶，異種移植物，非小細(xì)胞肺癌

前言

盡管靶向治療和生物標(biāo)志物的發(fā)展是有前途的溜歪，但非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）仍然是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一若专。大多數(shù)NSCLC相關(guān)的死亡是由于對(duì)常規(guī)治療（手術(shù)切除、放療蝴猪、化療或這些方法的聯(lián)合治療）有耐藥性的轉(zhuǎn)移调衰，最常見的轉(zhuǎn)移是腦轉(zhuǎn)移（BM）膊爪。30-43% 的NSCLC患者單獨(dú)發(fā)生BM，在其他地方?jīng)]有轉(zhuǎn)移性疾病嚎莉，30%-54% 的NSCLC患者在治療后會(huì)發(fā)生BM米酬。NSCLC BM患者的中位生存時(shí)間為7-8個(gè)月。BM還與預(yù)后不良相關(guān)趋箩，并預(yù)示著有限的有效治療選擇赃额。

對(duì)于多發(fā)性腦轉(zhuǎn)移的NSCLC患者，全腦放療仍是主要的方法叫确。雖然全腦放療目前在腦脊髓瘤中具有不可替代的地位跳芳，但其毒性缺陷，如認(rèn)知能力下降和癥狀性放射性壞死启妹。由于NSCLC BM的低血腦屏障（BBB）通透性和側(cè)面缺陷筛严，因此對(duì)NSCLC BM的化療通常不是一種有效的方法。在NSCLC的治療中饶米，EGFR和間變性淋巴瘤激酶（ALK）/met原癌基因酪氨酸激酶抑制劑的成功應(yīng)用強(qiáng)調(diào)了基于基因型的個(gè)體化靶向治療的重要性桨啃。然而，由于廣泛的分子和功能異質(zhì)性檬输，BM患者從靶向治療中獲益有限照瘾。一方面，并非所有靶向藥物都具有良好的血腦屏障通透性丧慈，靶點(diǎn)的奇異性限制了其在多突變腦脊髓中的作用析命。另一方面，雖然一些具有良好血腦屏障滲透性的靶向藥物逃默，如奧西替尼鹃愤，在治療早期在BM患者中表現(xiàn)出良好的活性，對(duì)突變體EGFR（T790M）的獲得性耐藥性可以在奧西替尼治療后進(jìn)化完域。此外软吐，盡管有令人鼓舞的數(shù)據(jù)，但只有少數(shù)患者對(duì)免疫治療有反應(yīng)吟税“及遥總的來說，無論采用何種治療方法肠仪，NSCLC BM患者的療效都存在著巨大的個(gè)體差異肖抱，這迫切需要一個(gè)臨床前動(dòng)物模型來輔助精確的藥物治療。

斑馬魚（Danio rerio）是一個(gè)強(qiáng)大的和基因可管理的模型异旧，可用于研究人類惡性腫瘤意述。它與哺乳動(dòng)物具有高度的生理和遺傳相似性，非常接近于臨床環(huán)境，并允許監(jiān)測(cè)腫瘤的自然進(jìn)程荤崇。此外镐依，斑馬魚胚胎是透明的，可以在體內(nèi)動(dòng)態(tài)觀察癌細(xì)胞的增殖天试、侵襲和轉(zhuǎn)移。斑馬魚異種移植模型被用于各種癌癥研究然低。在胃癌研究中喜每，斑馬魚患者來源的異種移植物模型表現(xiàn)出臨床相似的病理表型和藥物敏感性。也有報(bào)道稱雳攘，斑馬魚異種移植物是一種快速带兜、高靈敏度的檢測(cè)方法，可用于顯示多種生物腫瘤特征和評(píng)估腫瘤對(duì)結(jié)腸直腸癌治療的反應(yīng)吨灭。由于其血腦屏障的結(jié)構(gòu)和功能與人類高度相似刚照，斑馬魚原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤異種移植模型被用于篩選血腦屏障穿透藥物。雖然有許多斑馬魚模型用于癌癥轉(zhuǎn)移的研究喧兄，目前還缺乏斑馬魚異種移植模型來研究腦轉(zhuǎn)移无畔，特別是NSCLC腦轉(zhuǎn)移。

在此吠冤，我們利用不同的NSCLC細(xì)胞系（H1975浑彰、A549和H1299）建立了斑馬魚BM模型，并驗(yàn)證了其在NSCLC BM的機(jī)制研究和治療中的可行性和可靠性拯辙。我們證明了這個(gè)斑馬魚NSCLC BM模型可以模擬人類NSCLC BM郭变。它可能是一個(gè)有用的模型來研究驅(qū)動(dòng)NSCLC細(xì)胞進(jìn)入大腦的機(jī)制，并確定潛在的治療選擇涯保。

方法

試劑

奧西替尼（Osi诉濒，純度> 99%）和吉非替尼（Gefi，純度> 99%）夕春，購自塞勒克化學(xué)公司（上海未荒，中國(guó)），用DMSO溶解撇他，獲得100 mM和20 mM的庫存濃度茄猫。實(shí)驗(yàn)前配制稀釋溶液。以胚胎培養(yǎng)基或細(xì)胞培養(yǎng)基中添加0.1%的DMSO作為溶劑對(duì)照困肩。胎牛血清（FBS）划纽、磷酸鹽生理鹽水（PBS）、羅斯威爾公園紀(jì)念研究所基礎(chǔ)培養(yǎng)基1640（RPMI 1640）锌畸、青霉素和鏈霉素購自基礎(chǔ)培養(yǎng)基技術(shù)公司（上海勇劣，中國(guó)）。

細(xì)胞系和培養(yǎng)

人NSCLC肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1975比默、H1299幻捏，最初來自美國(guó)型培養(yǎng)收集，按照標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行培養(yǎng)命咐。人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7購自Procell（武漢篡九，中國(guó)）。A549在添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)醋奠。H1299和H1975在添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640中培養(yǎng)榛臼。MDA-MB-231在添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的L15中培養(yǎng)。MCF-7在添加10%胎牛血清窜司、0.01 mg/mL胰島素和1%青霉素-鏈霉素的MEM中培養(yǎng)沛善。所有細(xì)胞在含有5%二氧化碳的潮濕氣氛中以37℃進(jìn)行培養(yǎng)。

斑馬魚系和維護(hù)

斑馬魚和胚胎按照標(biāo)準(zhǔn)程序飼養(yǎng)塞祈。成魚經(jīng)歷一個(gè)14小時(shí)(h) /10小時(shí)(h)的光暗循環(huán)金刁。將3個(gè)月至2歲的成魚雜交產(chǎn)生胚胎和幼蟲。本研究使用了允許可視化斑馬魚的血管系統(tǒng)Tg（fi-1： EGFP）斑馬魚议薪，以及野生型AB斑馬魚尤蛮。胚胎和幼魚在28℃ E3培養(yǎng)基中培養(yǎng)（5 mM氯化鈉，0.17 mM氯化鉀笙蒙，0.33 mM氯化鈣抵屿，0.33 mM硫酸鎂），從受精后1天開始（dpf）捅位，添加0.2mM N-phenylthiourea（PTU轧葛；Sigma）抑制色素形成以不干擾成像。斑馬魚的研究得到了南京科技大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)（IACUC）的批準(zhǔn)艇搀。

體外細(xì)胞侵襲能力試驗(yàn)

使用跨孔培養(yǎng)系統(tǒng)（細(xì)胞培養(yǎng)插入物尿扯，8 μm，24孔焰雕；中國(guó)康寧）來評(píng)估細(xì)胞侵襲能力衷笋。將稀釋后的基質(zhì)基質(zhì)與無血清培養(yǎng)基分散，放入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中矩屁，使其凝固辟宗。細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基預(yù)饑餓24 h達(dá)到一定密度，加入200 μL細(xì)胞懸液加入上室吝秕，下室加入500μL完全培養(yǎng)基泊脐，將平板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱24 h。將下腔室底部的細(xì)胞用中性甲醛攪拌40 min烁峭，然后用PBS洗滌兩次容客。將腔室置于0.5% 結(jié)晶紫溶液中秕铛，放置30 min，標(biāo)記細(xì)胞缩挑，然后用顯微鏡拍照但两，用Image Pro Plus計(jì)數(shù)。

細(xì)胞標(biāo)記

根據(jù)制造商的說明供置，細(xì)胞系被濃度為0.5μL/mL CM-Dil谨湘，以及濃度為8μL/mL的CM-DiO（伊利學(xué)生物科技，中國(guó)）標(biāo)記芥丧。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染

在確定適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染濃度后悲关，將細(xì)胞饑餓24小時(shí)，然后按照制造商的說明娄柳，用轉(zhuǎn)染試劑培養(yǎng)24小時(shí)。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用qPCR進(jìn)行驗(yàn)證艘绍。所有RNA寡核苷酸均由GenePharma（中國(guó)）提供赤拒。

斑馬魚異種移植

在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，指定發(fā)育階段的斑馬魚胚胎用0.003%三卡因（Sigma-Aldrich诱鞠，美國(guó)密蘇里州）麻醉挎挖，并放置在涂有1%瓊脂糖的10 cm培養(yǎng)皿上。將單細(xì)胞懸液配制每毫升密度為2×107個(gè)細(xì)胞航夺，微注射至卵黃周間隙蕉朵。每個(gè)胚胎會(huì)留下大約100個(gè)細(xì)胞來引起腦轉(zhuǎn)移。注射后2h后選擇合適的注射胚胎（hpi）阳掐。根據(jù)我們之前的報(bào)道始衅，選擇的胚胎被放置在32個(gè)℃中進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

斑馬魚異種移植藥物給藥

注射后1天（dpi）斑馬魚腦轉(zhuǎn)移大小相似的異種移植物隨機(jī)分布在治療組：對(duì)照E3培養(yǎng)基缭保，E3奧西替尼（1μM）和E3吉非替尼（13μM）汛闸，連續(xù)3天。所有給藥方法均為心內(nèi)注射艺骂。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）

從胚胎中分離并收集腦組織诸老，并根據(jù)制造商的說明，使用RNA提取試劑盒（伊利學(xué)生物技術(shù)）從胚胎中提取RNA钳恕。使用實(shí)時(shí)定量PCR定量miR-330-3-3p别伏，mfsd2aa，mfsd2ab和Claudin-5忧额。

蘇木精伊紅（HE）染色

在4 dpi時(shí)厘肮，患有NSCLC腦轉(zhuǎn)移的胚胎在4%多聚甲醛中固定，然后脫水宙址，石蠟包埋并切片（6-8μm）轴脐。切片用HE染色。使用生物病理顯微鏡（BX45-DP72，奧林巴斯大咱，日本）獲得圖像恬涧。

成像

采用倒置熒光顯微鏡（IX71，奧林巴斯碴巾，日本）或共聚焦顯微鏡（LSM710溯捆，蔡司，德國(guó)）在1 dpi和4 dpi條件下監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞在腦內(nèi)的遷移厦瓢。

統(tǒng)計(jì)分析

所有的統(tǒng)計(jì)分析均使用Image-Pro Plus 6.0和GraphPad Prism 8.0進(jìn)行提揍。所有統(tǒng)計(jì)分析均以平均± SEM表示。采用單因素方差分析變化的減少/增加煮仇，然后采用Dunnett多重比較檢驗(yàn)劳跃。當(dāng)P值低于0.05時(shí)，則考慮其意義浙垫。（***）表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：P<0.005刨仑，（**）P < 0.01，（*）P < 0.05夹姥。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次杉武，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

結(jié)果

斑馬魚NSCLC BM異種移植模型的建立

如圖所示辙售，紅色的虛線框表示斑馬魚的大腦（圖1 A）,紅色團(tuán)塊代表注射位置（圖1 B）轻抱。采用Tg（fli-1：EGFP）斑馬魚觀察不同發(fā)育階段（2-6 dpf）大腦血管的發(fā)育情況。斑馬魚血腦屏障的結(jié)構(gòu)主要由腦血管組成旦部。我們觀察到祈搜，在4 dpf時(shí)，腦內(nèi)血管密度顯著增加（圖1 C）士八。mfsd2aa和mfsd2ab表達(dá)表明（圖1 D）夭问，斑馬魚的血腦屏障可能在3 dpf時(shí)開始功能發(fā)育，在4 dpf時(shí)基本發(fā)育曹铃，在5 dpf時(shí)完全發(fā)育缰趋。因此，選擇了3個(gè)時(shí)間點(diǎn)：2dpf（BBB未發(fā)育）陕见、3dpf（BBB正在發(fā)育）和4dpf（BBB基本發(fā)育）來評(píng)估BBB的存在是否影響了NSCLC細(xì)胞系的BM潛能秘血。通過注射不同細(xì)胞數(shù)對(duì)斑馬魚存活率和BM影響（圖1 E），選擇100個(gè)作為注射細(xì)胞的數(shù)量來準(zhǔn)確地觀察和量化斑馬魚的BM评甜。為了確定最佳注射時(shí)間灰粮，用紅色熒光染料CM-DiI標(biāo)記癌細(xì)胞注射到不同發(fā)育階段（2,3,4 dpf）的斑馬魚胚胎卵周隙（PVs）中（圖1 F-H）,發(fā)現(xiàn)2 dpf作為注射時(shí)間可以更好地量化斑馬魚中NSCLC細(xì)胞系的腦轉(zhuǎn)移情況（圖1 I-K）。

圖1 斑馬魚NSCLC BM異種移植模型的建立

(A) 斑馬魚腦成像及采集示意圖忍坷。從垂直視圖（藍(lán)色箭頭）對(duì)斑馬魚的大腦進(jìn)行成像粘舟，并切除（紅色虛線框）以提取RNA熔脂。(B)示意圖為2 dpf時(shí)的斑馬魚胚胎。紅點(diǎn)表示注射到卵黃周圍空間（PVs）的癌細(xì)胞柑肴。(C)Tg（fli-1：EGFP）斑馬魚（2-6 dpf）不同發(fā)育階段的大腦圖像霞揉。白色的短虛線表示斑馬魚的中腦，白色的長(zhǎng)虛線表示斑馬魚的眼睛和后腦晰骑。(D)mfsd2aa和mfsd2ab在斑馬魚大腦中不同發(fā)育階段的表達(dá)（2-6 dpf）适秩。(E)2dpf斑馬魚在PVs中的生存曲線。將約50-400個(gè)H1975細(xì)胞（紅色熒光）注入2 dpf斑馬魚PVs中硕舆，計(jì)算死亡數(shù)目直至8 dpi秽荞。（F-H）共涉及3種人NSCLC細(xì)胞系： H1975、A549和H1299抚官。在不同的發(fā)育階段扬跋，將約100個(gè)細(xì)胞注入斑馬魚的PVs中，并在1 dpi時(shí)成像斑馬魚的大腦凌节。白色箭頭表示斑馬魚腦血管中的癌細(xì)胞胁住。（I-K）斑馬魚在1 dpi時(shí)BM細(xì)胞數(shù)量的定量分析。當(dāng)P值低于0.05時(shí)刊咳，則考慮其意義。（ns）表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義儡司，（*）表示P < 0.05娱挨，（**）P < 0.01和（***）P < 0.001. dpf：受精后天數(shù)，dpi：注射后天數(shù)

注射4天（4 dpi）NSCLC BM斑馬魚蘇木精尹紅染色（HE）

將約100個(gè)H1975細(xì)胞注射到2 dpf斑馬魚的PVs中捕犬，將4 dpi的胚胎按軌跡（藍(lán)色直線）切片（圖2 A）跷坝，然后進(jìn)行HE染色。HE染色主要通過細(xì)胞核的形態(tài)和大小來區(qū)分正常細(xì)胞和異常細(xì)胞碉碉。H1975細(xì)胞在斑馬魚的大腦中幾乎是單細(xì)胞分辨率（白色箭頭）柴钻。這些個(gè)體癌細(xì)胞又長(zhǎng)又窄，其形態(tài)與體外培養(yǎng)的H1975細(xì)胞相似垢粮。此外贴届，聚集的細(xì)胞核較大，形狀不均勻（白色虛線框）蜡吧，而正常細(xì)胞的細(xì)胞核規(guī)則且均勻毫蚓。垂直切片顯示斑馬魚大腦中有明顯的癌細(xì)胞簇（白色虛線框）和病變（白色箭頭）（圖2 B）。三個(gè)斑馬魚腦橫向切片顯示昔善，從表層到內(nèi)膜都有H1975細(xì)胞（圖2 C-E）元潘。HE染色結(jié)果證明了NSCLC癌細(xì)胞在斑馬魚腦內(nèi)可向多層轉(zhuǎn)移。

圖2 注射4天（4 dpi）NSCLC BM斑馬魚蘇木精尹紅染色（HE）

(A)NSCLC BM的斑馬魚胚胎在4 dpi按軌跡（藍(lán)色直線）切片君仆。(B)垂直切片顯示斑馬魚腦內(nèi)有明顯的癌細(xì)胞簇（白色虛線）和病變（白色箭頭）翩概。（C-E）圖片顯示了同一斑馬魚大腦的三個(gè)水平切片牲距，從表層到內(nèi)層。切片顯示钥庇，在斑馬魚大腦的不同水平中有癌細(xì)胞（白色箭頭）牍鞠。

NSCLC細(xì)胞在4 dpi時(shí)在斑馬魚中腦不能增殖

前面研究顯示將NSCLC癌細(xì)胞注射到2 dpf斑馬魚的PVs中，在4 dpi時(shí)上沐，斑馬魚的大腦中數(shù)量會(huì)增加皮服。然而，我們不能確定觀察到的癌細(xì)胞是來自細(xì)胞外滲還是外滲細(xì)胞的增殖参咙。為評(píng)估癌細(xì)胞是否能在4 dpi時(shí)增殖龄广，將癌細(xì)胞注射到2 dpf Tg（fi-1：EGFP）斑馬魚的中腦（圖3 A）。根據(jù)斑馬魚生存曲線及NSCLC細(xì)胞在卵黃囊中增殖速度選擇了100個(gè)細(xì)胞作為注射細(xì)胞數(shù)（圖3 B）蕴侧。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞系在斑馬魚中腦沒有增殖（圖3 H-M）择同，和具有高侵襲性可在斑馬魚中轉(zhuǎn)移和增殖陽性對(duì)照細(xì)胞MDA-MB-231相似、H1975净宵、A549和H1299在4 dpi時(shí)有擴(kuò)散趨勢(shì)（圖3 C-G）敲才。因此，NSCLC癌細(xì)胞不會(huì)在4dpi內(nèi)在斑馬魚的大腦中增殖择葡，斑馬魚大腦中NSCLC細(xì)胞的增加是由循環(huán)轉(zhuǎn)移而不是局部細(xì)胞增殖產(chǎn)生的紧武。

圖3在4 dpi時(shí) NSCLC細(xì)胞在斑馬魚中腦不能增殖

(A)示意圖為2 dpf時(shí)的斑馬魚胚胎，紅點(diǎn)表示被注射到斑馬魚中腦的癌細(xì)胞敏储。(B)中腦含瘤量不同的斑馬魚生存曲線阻星。將2 dpf Tg約50-400個(gè)H1975細(xì)胞（紅色熒光）注入（fli-1：EGFP）斑馬魚的中腦，計(jì)算死亡人數(shù)至8 dpi已添。（C-G）涉及5種人癌細(xì)胞系：人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231（陽性對(duì)照）和MCF-7（陰性對(duì)照）妥箕、人NSCLC癌細(xì)胞株H1975、A549和H1299更舞。在2 dpf時(shí)注射到斑馬魚中腦約100個(gè)細(xì)胞畦幢，在1 dpi和4 dpi時(shí)對(duì)斑馬魚中腦進(jìn)行成像。（H-M）對(duì)斑馬魚在1 dpi和4 dpi時(shí)的中腦細(xì)胞增殖進(jìn)行定量分析缆蝉。將1 dpi和4 dpi的測(cè)量值除以1 dpi的平均值宇葱，確定中腦細(xì)胞的倍數(shù)變化。（ns）表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義刊头，（*）表示P < 0.05贝搁，（**）P < 0.01和（***）P < 0.001

斑馬魚NSCLC BM異種移植模型區(qū)分了不同細(xì)胞系的BM潛能

體外采用Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)評(píng)估細(xì)胞侵襲能力。圖像和定量分析顯示芽偏，MDA-MB-231雷逆、H1975、A549和H1299在體外具有較強(qiáng)的侵襲能力污尉，而MCF-7幾乎沒有侵襲能力（圖4 A-B）膀哲。H1975的侵襲能力略強(qiáng)于H1299往产，H1975和H1299在體外的侵襲能力均強(qiáng)于A549。體內(nèi)利用斑馬魚模型中評(píng)估了5種癌細(xì)胞系的BM的能力某宪。在2 dpf時(shí)仿村，將約100個(gè)細(xì)胞（紅色熒光）注射到Tg（fli-1： EGFP）斑馬魚的PVs中，4 dpi時(shí)進(jìn)行斑馬魚腦成像（圖4 C）兴喂。以4 dpi時(shí)的BM細(xì)胞數(shù)量和1 dpi時(shí)的BM細(xì)胞數(shù)量比值計(jì)算BM勢(shì)蔼囊。如果BM電位大于1，則認(rèn)為斑馬魚有腦轉(zhuǎn)移衣迷。與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致畏鼓，H1975在4 dpi時(shí)的BM率和BM電位均高于A549（圖4 D,J）。而H1299的BM率高于A549壶谒，但其BM電位并不高于A549（圖4 D,J）云矫。通過對(duì)BM細(xì)胞的定量分析發(fā)現(xiàn)注射H1299的斑馬魚中有BM細(xì)胞數(shù)量減少的個(gè)體，而注射A549和MCF-7的斑馬魚中也出現(xiàn)了這種情況（圖4 B-I）汗菜。幾乎所有注射MCF-7個(gè)體的BM細(xì)胞數(shù)量都減少了让禀，而只有部分A549個(gè)體的BM細(xì)胞數(shù)量減少。我們認(rèn)為陨界，與MCF-7相比巡揍，A549在體內(nèi)具有更高的BM潛能。因此菌瘪，我們認(rèn)為斑馬魚BM模型可以區(qū)分不同的NSCLC細(xì)胞系的BM潛能腮敌。

圖4 斑馬魚NSCLC BM異種移植模型可以區(qū)分不同細(xì)胞系的BM潛能

(A)采用 Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)評(píng)估體外細(xì)胞侵襲能力，其中包括5種癌細(xì)胞系： MDA-MB-231麻车、MCF-7、H1975斗这、A549和H1299动猬。入侵的細(xì)胞用結(jié)晶紫（0.5%）染色，孵育24 h后成像表箭。(B)體外入侵細(xì)胞的定量及比較赁咙。菌落使用Image Pro Plus進(jìn)行定量。(C)共涉及5種癌細(xì)胞系： MDA-MB-231免钻、MCF-7彼水、H1975、A549和H1299极舔。在2 dpf時(shí)凤覆，將約100個(gè)細(xì)胞（紅色熒光）注射到Tg（fli-1：EGFP）斑馬魚的PVs中，在4 dpi時(shí)對(duì)斑馬魚的大腦進(jìn)行成像拆魏。白色箭頭表示斑馬魚腦血管中的癌細(xì)胞盯桦。(D)4 dpi時(shí)BM率定量分析慈俯。同一斑馬魚在4 dpi時(shí)的BM細(xì)胞數(shù)除以在1 dpi時(shí)的BM細(xì)胞數(shù)。這兩者的比值被命名為BM勢(shì)拥峦。如果BM電位大于1贴膘，則認(rèn)為斑馬魚有腦轉(zhuǎn)移。（E-I）在1 dpi和4 dpi時(shí)對(duì)BM細(xì)胞定量分析略号。用直線連接的兩個(gè)點(diǎn)代表同一斑馬魚在1 dpi和4 dpi時(shí)的BM細(xì)胞數(shù)量刑峡。(J)細(xì)胞BM電位的定量和比較。通過將同一斑馬魚中4 dpi時(shí)的BM細(xì)胞數(shù)量除以1 dpi時(shí)的BM細(xì)胞數(shù)量來確定BM電位玄柠。（ns）表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義突梦，（*）表示P < 0.05，（**）P < 0.01和（***）P < 0.001

斑馬魚NSCLC BM異種移植模型同時(shí)區(qū)分了不同細(xì)胞系的BM潛能

已知斑馬魚BM模型可以區(qū)分不同的NSCLC細(xì)胞系的BM電位随闪，為了解這種BM電位的差異是否可以同時(shí)顯示出來阳似，分別將H1975細(xì)胞用CM-DiI（紅色熒光）或CM-DiO（綠色熒光）標(biāo)記，然后以相同的比例混合以消除不同染料對(duì)細(xì)胞系BM電位影響铐伴，在2 dpf時(shí)共注射到（共約100個(gè)細(xì)胞）野生斑馬魚PVs中（圖5 A）撮奏。在4 dpi時(shí)對(duì)斑馬魚腦成像（圖5 B），并在1 dpi和4 dpi時(shí)定量測(cè)量BM細(xì)胞數(shù)量（圖5 D-E）当宴。結(jié)果顯示染料對(duì)細(xì)胞系的BM電位沒有影響（圖5 H）畜吊。當(dāng)CM-DiI標(biāo)記H1975細(xì)胞和CM-DiO標(biāo)記A549細(xì)胞共注射（約100個(gè)細(xì)胞）到2 dpf的斑馬魚PVs中時(shí)（圖5 C），H1975表現(xiàn)出比A549更高的BM電位户矢，但是和單一注射相比玲献，H1975和A549的BM電位均降低。H1975細(xì)胞數(shù)量也高于A549細(xì)胞（圖5 I）梯浪。我們推測(cè)A549的共存可能占據(jù)了H1975的轉(zhuǎn)移空間捌年，反之亦然。

圖5 斑馬魚NSCLC BM異種移植模型同時(shí)區(qū)分了不同細(xì)胞系的BM潛能

(A)示意圖為2 dpf時(shí)的斑馬魚胚胎挂洛。紅點(diǎn)和綠點(diǎn)表示用兩種不同染料標(biāo)記的癌細(xì)胞共注射到斑馬魚的pv中礼预。(B)將約50 H1975細(xì)胞（紅色熒光）和50 H1975細(xì)胞（綠色熒光）共注入野生斑馬魚的PVs中，在4 dpi時(shí)對(duì)斑馬魚的大腦進(jìn)行成像虏劲。白色的長(zhǎng)虛線表示斑馬魚的大腦托酸。(C)將約50 H1975細(xì)胞（紅色熒光）和50 A549細(xì)胞（綠色熒光）共注射到野生斑馬魚的PVs中，在4 dpi時(shí)對(duì)斑馬魚的大腦進(jìn)行成像柒巫。（D-G）在1 dpi和4 dpi共注射時(shí)對(duì)BM細(xì)胞的定量分析励堡。用直線連接的兩個(gè)點(diǎn)代表同一斑馬魚在1 dpi和4 dpi時(shí)的BM細(xì)胞數(shù)量。（H和I）斑馬魚大腦中含有兩種不同染料的細(xì)胞的百分比堡掏。將1 dpi時(shí)的BM細(xì)胞數(shù)（紅/綠細(xì)胞）除以BM細(xì)胞總數(shù)应结，測(cè)定細(xì)胞系（紅/綠細(xì)胞）的百分比。（ns）表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義泉唁，（*）表示P < 0.05摊趾，（**）P < 0.01和（***）P < 0.001

microRNA3303p（miR3303p）的表達(dá)影響了斑馬魚異種移植模式下的NSCLC BM潛能

MiRNAs在許多癌癥的發(fā)展發(fā)展中起著重要的作用币狠。有研究表明miR-330-3p表達(dá)升高可以促進(jìn)體外癌細(xì)胞增殖、存活砾层、遷移和侵襲漩绵，并可能是識(shí)別NSCLC腦轉(zhuǎn)移潛在生物標(biāo)志物。因此肛炮，我們使用miR-330-3p操作來驗(yàn)證斑馬魚BM模型止吐。用anti-miR-330-3p抑制劑敲除m1975細(xì)胞系中miR-330-3p的表達(dá)，用過miR-330-3p mimics過表達(dá)A549細(xì)胞系中miR-330-3p侨糟。根據(jù)制造商的說明碍扔，在1 nM和50 nM之間確定了適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染濃度。對(duì)miRi-330-3p體外表達(dá)的定量分析表明秕重，50 nM為合適濃度（圖6 A-B）不同。采用Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)評(píng)價(jià)體外轉(zhuǎn)染的效果。敲除miR-330-3p表達(dá)的H1975細(xì)胞系的侵襲能力弱于原H1975細(xì)胞系（圖6 C,E）溶耘。過表達(dá)miR-330-3p的A549細(xì)胞系比原表達(dá)的A549細(xì)胞系具有更強(qiáng)的侵襲能力（圖6 D,F）二拐。H1975，敲除miR-330-3p的H1975凳兵，A549百新，miR-330-3p過表達(dá)的A549參與了斑馬魚的研究。將約100個(gè)細(xì)胞注射到Tg（fli-1：EGFP）斑馬魚的PVs中庐扫，以評(píng)估體內(nèi)轉(zhuǎn)染的有效性饭望。在4 dpi時(shí)對(duì)斑馬魚腦進(jìn)行成像（圖6G和H），在1 dpi和4 dpi時(shí)定量測(cè)量BM細(xì)胞的數(shù)量（圖6I-L）形庭。數(shù)據(jù)顯示铅辞，低表達(dá)miR-330-3p的H1975細(xì)胞系的BM潛能顯著降低，而過表達(dá)miR-330-3p的A549比原A549細(xì)胞系具有更高的BM潛能（圖6 M-N）萨醒。

圖6 microRNA-330-3p（miR-330-3p）的表達(dá)影響了斑馬魚異種移植模型中的NSCLC BM潛能

（A和B）miR-330-3p在體外的定量表達(dá)斟珊。根據(jù)說明，在1nM~50nM之間測(cè)定適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染濃度验靡。（C和D）用anti-miR-330-3p抑制劑敲除m1975細(xì)胞系中miR-330-3p的表達(dá)卒密，用過miR-330-3p minics過表達(dá)A549細(xì)胞系中miR-330-3p妄讯。采用Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)評(píng)價(jià)體外轉(zhuǎn)染的效果。入侵的細(xì)胞用結(jié)晶紫（0.5%）染色次坡，孵育24 h后成像钩乍。（E和F）體外被入侵細(xì)胞的定量分析辞州。使用Image Pro Plus對(duì)菌落進(jìn)行定量。（G和H）miR-330-3p過表達(dá)的H1975寥粹、H1975变过、miR-330-3p過表達(dá)的A549和A549參與其中埃元。將H1975，敲除miR-330-3p H1975媚狰，A549和過表達(dá)miR-330-3p A549細(xì)胞系的約100個(gè)細(xì)胞（紅色熒光）注射到2 dpf的Tg（fli-1：EGFP）斑馬魚PVs中岛杀，以評(píng)估體內(nèi)轉(zhuǎn)染的有效性，并以4 dpi對(duì)斑馬魚的大腦進(jìn)行成像崭孤。白色箭頭表示斑馬魚腦血管中的癌細(xì)胞类嗤。（I-L）1dpi和4 dpi的BM細(xì)胞定量。用直線連接的兩個(gè)點(diǎn)代表同一斑馬魚在1 dpi和4 dpi時(shí)的BM細(xì)胞數(shù)量辨宠。（M和N）轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系和原始細(xì)胞系的BM電位的定量和比較遗锣。（ns）表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（*）表示P < 0.05嗤形，（**）P < 0.01和（***）P < 0.001

斑馬魚NSCLC BM異種移植模型在4天內(nèi)區(qū)分出不同的化學(xué)敏感性

奧西替尼是第三代表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFRTKIs）之一精偿，在NSCLC中具有既定的療效和安全性，它可以穿透血腦屏障赋兵，在腦轉(zhuǎn)移患者中表現(xiàn)出比吉非替尼更好的療效笔咽。采用跨孔培養(yǎng)系統(tǒng)評(píng)價(jià)奧西替尼（1μM）和吉非替尼（2μM）對(duì)體外細(xì)胞侵襲的有效性（圖7 A-B）。盡管奧西替尼對(duì)H1975的細(xì)胞侵襲抑制作用強(qiáng)于吉非替尼毡惜，兩者在A549上無明顯差異（圖7 C-D）拓轻。人NSCLC細(xì)胞系H1975和A549參與評(píng)估奧西替尼（1μM）和吉非替尼（13μM）在體內(nèi)的有效性。約100個(gè)細(xì)胞注射到2 dpf時(shí)Tg（fli-1：EGFP）斑馬魚PVs中经伙，有腦轉(zhuǎn)移的胚胎在1 dpi心內(nèi)注射奧西替尼和吉夫替尼扶叉。在4 dpi時(shí)對(duì)斑馬魚腦成像（圖7 E-F），在1 dpi和4 dpi時(shí)定量測(cè)量BM細(xì)胞的數(shù)量（圖7 G-H）帕膜。與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致枣氧，奧西替尼在體內(nèi)對(duì)H1975的BM電位抑制作用強(qiáng)于吉非替尼的抑制作用（圖7 C, G）。與體外實(shí)驗(yàn)不同垮刹，奧西替尼在體內(nèi)對(duì)A549的BM電位的抑制作用強(qiáng)于吉非替尼（圖7 D, H）达吞。

圖7 斑馬魚NSCLC BM異種移植模型在4天內(nèi)區(qū)分了不同的化學(xué)敏感性

（A和B）NSCLC細(xì)胞系H1975和A549參與其中。采用跨孔培養(yǎng)系統(tǒng)評(píng)價(jià)奧西替尼（1μM）和吉非替尼（2μM）在體外抗細(xì)胞侵襲的有效性荒典。入侵的細(xì)胞用結(jié)晶紫（0.5%）染色酪劫，孵育24 h后成像。（C和D）體外被入侵細(xì)胞的定量分析寺董。菌落使用Image Pro Plus進(jìn)行定量覆糟。（E和F）NSCLC細(xì)胞系H1975和A549參與其中。將Tg（fli-1：EGFP）斑馬魚胚胎在2 dpf時(shí)注射約100個(gè)細(xì)胞（紅色熒光）到PVs中遮咖，并通過心內(nèi)注射給予奧西替尼（1μM）和吉非替尼(13μM）滩字。（G和H）4dpi時(shí)細(xì)胞腦轉(zhuǎn)移的定量分析。將同一斑馬魚中的BM細(xì)胞數(shù)量除以1 dpi時(shí)的BM細(xì)胞數(shù)量，確定BM細(xì)胞數(shù)量的倍變化麦箍。（ns）表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義漓藕，（*）表示P < 0.05，（**）P < 0.01和（***）P < 0.001

討論

在NSCLC患者中挟裂，腦脊髓炎的發(fā)病率增加享钞，預(yù)后不佳，這促進(jìn)了了解腦脊髓炎的病理生理學(xué)和對(duì)這些患者測(cè)試有效的治療策略的緊迫性诀蓉。雖然NSCLC患者的治療取得了許多進(jìn)展嫩与，但BM患者的預(yù)后仍然令人沮喪。用于治療NSCLC BM的靶向藥物受到血腦屏障進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)的限制交排，從而減少了血流速度划滋。耐藥性也是NSCLC BM的一個(gè)常見問題，特別是奧西替尼耐藥后缺乏第四代藥物酪氨酸激酶抑制劑埃篓。此外处坪，肺癌腦轉(zhuǎn)移的治療時(shí)間較短，中位生存時(shí)間通常為3~8個(gè)月架专。在目前的情況下同窘，有必要進(jìn)行更多的機(jī)制相關(guān)研究和驗(yàn)證NSCLC BM的新治療策略。

動(dòng)物模型正逐漸成為癌癥研究的重要輔助工具部脚。目前癌癥研究的主流動(dòng)物模型是小鼠模型想邦。然而，由于植入腫瘤和擴(kuò)大菌群所需要的時(shí)間委刘，以及它們所需要的成本丧没，小鼠模型對(duì)于臨床建議并不實(shí)用。畢竟锡移，BM是晚期癌癥中常見的一種轉(zhuǎn)移灶呕童，而小鼠模型通常需要一個(gè)月或更長(zhǎng)的時(shí)間才能達(dá)到晚期癌癥。在這里淆珊，我們采用了一種中間的方法——一種快速和可靠的斑馬魚NSCLC BM模型夺饲。

我們的模型可以很好地模擬血腦屏障和NSCLC BM之間的關(guān)系。斑馬魚的血腦屏障在結(jié)構(gòu)和功能上與哺乳動(dòng)物相似施符。在我們的研究中往声，2 dpf時(shí)注射的H1975、A549和H1299的BM電位明顯高于4 dpf時(shí)注射的戳吝，這意味著血腦屏障的發(fā)展可能會(huì)削弱腫瘤細(xì)胞的BM潛能浩销。我們的數(shù)據(jù)還顯示，功能和結(jié)構(gòu)更完整的血腦屏障對(duì)癌細(xì)胞具有更高的屏障效應(yīng)骨坑，但不能完全阻斷肺癌細(xì)胞的腦侵襲撼嗓。雖然5 dpf的斑馬魚血腦屏障比斑馬魚血腦屏障有更多的臨床價(jià)值，但出于某些原因欢唾，我們?nèi)匀贿x擇2 dpf作為注射時(shí)間且警。首先，從2 dpf到6 dpf礁遣，斑馬魚的主要先天免疫細(xì)胞是巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞斑芜，它們可能在腫瘤清除過程中發(fā)揮重要作用。在我們的實(shí)驗(yàn)中祟霍，我們發(fā)現(xiàn)杏头，當(dāng)100個(gè)癌細(xì)胞在2 dpf時(shí)被移植到斑馬魚卵黃囊中時(shí)，細(xì)胞在5 dpf（3 dpi）后生長(zhǎng)減慢沸呐。將100個(gè)癌細(xì)胞注射到2 dpf斑馬魚PVs中醇王，也發(fā)生了同樣的情況。在5 dpf（3 dpi）后崭添，BM的增加也減慢了寓娩。我們推測(cè)，這可能是由于5 dpf后先天免疫系統(tǒng)的發(fā)展呼渣，并開始排斥異種移植的癌細(xì)胞棘伴。第二，PVs是斑馬魚卵黃囊周圍的一個(gè)空腔屁置，沒有器官或血管PVs的上部與斑馬魚的人靜脈管（通常稱為居維葉管）相連焊夸，前部與心包（心包中的主動(dòng)脈血管）相連。因此蓝角，PVs與斑馬魚的血管系統(tǒng)相連阱穗，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。盡管注射到PVs中使鹅，癌細(xì)胞不僅可以轉(zhuǎn)移到大腦颇象，也可以轉(zhuǎn)移到尾部。許多基于斑馬魚模型的癌癥轉(zhuǎn)移研究都使用PVs作為注射部位并徘。我們觀察到斑馬魚PVs在5 dpf時(shí)幾乎完全消失遣钳，這將影響顯微注射部位的準(zhǔn)確性。

在確定我們的模型可以建立NSCLC BM后麦乞，我們對(duì)NSCLC BM的機(jī)制和藥物敏感性進(jìn)行了相關(guān)驗(yàn)證蕴茴。畢竟，建立斑馬魚BM模型的目的是為NSCLC BM機(jī)制的研究和驗(yàn)證新的治療策略提供幫助姐直。我們驗(yàn)證了已報(bào)道的miR-330-3p對(duì)NSCLC BM的影響倦淀，以及EGFR靶向藥物吉非替尼和奧西替尼在NSCLC BM 治療中的應(yīng)用。根據(jù)臨床報(bào)道声畏，在NSCLC-BM-+患者中撞叽，miR-330-3p的表達(dá)略有升高姻成，而miR-330-3p在NSCLC-BM-+患者中的表達(dá)明顯降低，這意味著miR-330-3p可能是BM標(biāo)記物愿棋。

在大多數(shù)斑馬魚異種移植模型中科展，藥物暴露通常是經(jīng)皮吸收（浸泡）。我們最初試圖通過經(jīng)皮吸收給藥糠雨，但這種給藥方法沒有區(qū)分奧西替尼和吉非替尼對(duì)NSCLC BM細(xì)胞的影響才睹。我們推測(cè)，經(jīng)皮吸收使吉非替尼可以繞過血腦屏障的存在甘邀，并直接作用于轉(zhuǎn)移到斑馬魚大腦的癌細(xì)胞琅攘。從這方面來看，抗腦轉(zhuǎn)移藥物應(yīng)該有滲入血腦屏障的能力松邪。在我們的斑馬魚BM模型中坞琴，它需要在注射藥物之前等待一個(gè)功能完整的血腦屏障。我們通過3 dpf（1 dpi）的心內(nèi)注射藥物逗抑，藥物直接進(jìn)入血液置济，它們必須通過血腦屏障到達(dá)中腦，并直接作用于轉(zhuǎn)移到大腦的癌細(xì)胞锋八。

在本研究中浙于，我們發(fā)現(xiàn)NSCLC細(xì)胞系H1975在體內(nèi)和體外對(duì)奧西替尼的敏感性均高于吉非替尼。這與臨床報(bào)道一致挟纱，即在EGFR突變的NSCLC BM患者中羞酗，奧西替尼由于其更好的血腦屏障通透性和更好的療效，比其他EGFR-TKIs表現(xiàn)出更大的療效紊服。然而檀轨，在A549中并沒有出現(xiàn)類似的情況。雖然A549對(duì)奧西替尼和吉非替尼都敏感欺嗤，但不能像H1975一樣明顯反映奧西替尼和吉非替尼之間的體外差異参萄。奧西替尼是T790的靶向抑制劑，而H1975有T790M和L858R突變煎饼，而A549沒有讹挎。這一確切靶點(diǎn)的缺失可能使奧西替尼在H1975中比在A549中更有效。吉非替尼靶向EGFR 19/21外顯子突變吆玖。EGFR 19/21外顯子突變常伴隨著EGFR表達(dá)的增加筒溃，而A549中EGFR的表達(dá)高于H1975，這可能促進(jìn)吉非替尼在A549中具有比H1975中更強(qiáng)的藥效影響沾乘。該結(jié)果可能導(dǎo)致吉非替尼和奧西替尼之間的療效差異怜奖，這只能在H1975中重現(xiàn)，而在A549中不能重現(xiàn)翅阵⊥崃幔總之迁央，這證明了我們的BM模型可以區(qū)分NSCLC BM對(duì)靶向藥物的化學(xué)敏感性。此外滥崩，這種差異表現(xiàn)得很快——僅給藥三天岖圈，滿足了快速的臨床需求。

斑馬魚BM模型最大的缺點(diǎn)是腫瘤不能在斑馬魚的大腦中長(zhǎng)期存在夭委。斑馬魚胚胎在受精后一個(gè)月有一個(gè)完整的免疫系統(tǒng)。在斑馬魚中無法長(zhǎng)時(shí)間攜帶腫瘤意味著在斑馬魚異種移植模型中無法研究腫瘤進(jìn)化募强、抗性克隆的出現(xiàn)和疾病的整體進(jìn)展株灸。在這一點(diǎn)上，需要一個(gè)小鼠模型來補(bǔ)充它擎值。斑馬魚NSCLC BM模型可以用于快速篩選或快速驗(yàn)證靶點(diǎn)慌烧，而小鼠BM模型可以提供實(shí)體BM腫瘤來研究腫瘤的進(jìn)展和復(fù)發(fā)。

隨著越來越多的研究使用斑馬魚作為患者來源的異種移植物（zPDX）的模型鸠儿，斑馬魚已被證明是一種快速和準(zhǔn)確的模型屹蚊，可用于顯示多種生物腫瘤特征和評(píng)估腫瘤對(duì)治療的反應(yīng)。該模型不僅可用于基礎(chǔ)研究进每，也可用于臨床精準(zhǔn)醫(yī)療汹粤。為了更好地了解NSCLC的生物學(xué)和惡性過程，使用患者來源的原代培養(yǎng)是很重要的田晚。雖然3D培養(yǎng)和生物反應(yīng)器在體外表現(xiàn)良好嘱兼，但基于體內(nèi)模型的驗(yàn)證對(duì)于患者來源的原代培養(yǎng)是必不可少的。模式的選擇對(duì)于保證原代培養(yǎng)的最大優(yōu)勢(shì)至關(guān)重要贤徒。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明芹壕，斑馬魚模型能夠很好地保留和顯示NSCLC細(xì)胞系的腦轉(zhuǎn)移特征，這為斑馬魚模型在原代培養(yǎng)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)接奈。我們希望我們可以進(jìn)一步使用我們的斑馬魚BM模型用于患者來源的異種移植物踢涌，以驗(yàn)證其在臨床實(shí)踐中的潛在應(yīng)用。

結(jié)論

綜上所述序宦，我們首次建立了斑馬魚NSCLC BM模型睁壁，結(jié)果表明斑馬魚NSCLC BM模型是對(duì)細(xì)胞異質(zhì)性敏感的快速、可靠的模型互捌。我們用NSCLC細(xì)胞系進(jìn)行了驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)堡僻，為NSCLC BM的研究提供了新的平臺(tái)。我們甚至可能為臨床快速篩選個(gè)性化NSCLC BM治療提供新的可能性疫剃。

基金：本項(xiàng)目由江蘇省先進(jìn)生物制造協(xié)同創(chuàng)新中心（XTE1835）钉疫、中國(guó)博士后科學(xué)基金（2020M681574）、江蘇省自然科學(xué)基金（BK20210546）巢价、江蘇省重點(diǎn)研發(fā)專項(xiàng)基金（BE2018758）資助牲阁。

本文章原文：Fan et al. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research (2021) 40:371

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