編輯：田陽娜

原文地址：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0378874120333833?via%3Dihub

前言

1. 斑馬魚作為研究炎癥反應(yīng)的理想體內(nèi)模型原因

斑馬魚(Danio rerio)具有體積小变隔、繁殖率高、生長迅速和易于維護(hù)的特點(diǎn)蟹倾，是模擬人類疾病和篩選有效藥物的理想體內(nèi)工具匣缘，吸引了相當(dāng)大的吸引力。特別是大量的研究表明鲜棠，斑馬魚的先天免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)與人類極其相似孵户。斑馬魚體內(nèi)已鑒定出中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞岔留，以及IL-6夏哭、TNF-α、NF-κB等大量炎癥基因献联，因此斑馬魚已被充分驗(yàn)證為研究炎癥反應(yīng)的理想體內(nèi)模型竖配。此外，斑馬魚的全透明體和轉(zhuǎn)基因熒光報(bào)告系的產(chǎn)生使得在整個(gè)炎癥過程中無創(chuàng)里逆、動(dòng)態(tài)地觀察和跟蹤白細(xì)胞趨化性成為可能进胯，這是其他脊椎動(dòng)物無法實(shí)現(xiàn)的。

2. 斑馬魚炎癥模型建立

脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)又稱內(nèi)毒素原押，是一種存在于革蘭氏陰性菌外膜的糖綴合物胁镐。它可以作用于宿主細(xì)胞，在細(xì)菌死亡時(shí)直接或間接地觸發(fā)病理生理過程诸衔。特別是盯漂，循環(huán)中LPS濃度的升高可誘發(fā)全體性炎癥反應(yīng)綜合征，其特征是巨噬細(xì)胞分泌過多的促炎細(xì)胞因子笨农，甚至導(dǎo)致組織和血管損傷就缆。因此，LPS已成為最常見的炎癥模型谒亦。由于斑馬魚具有體積小竭宰、繁殖力強(qiáng)空郊、光學(xué)透明、維護(hù)成本低切揭、實(shí)驗(yàn)周期短以及與哺乳動(dòng)物特別是人類高度同源性等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)狞甚，在過去十年中，斑馬魚已成為一種流行的人類疾病模型和藥物發(fā)現(xiàn)工具廓旬。斑馬魚疾病模型廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域哼审，如免疫學(xué)、腫瘤學(xué)嗤谚、神經(jīng)科學(xué)等。尤其值得注意的是怔蚌，斑馬魚具有與人類相似的免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)巩步，被認(rèn)為是尋找抗炎新藥的理想炎癥模型。除LPS外桦踊，其他常用的建立斑馬魚炎癥模型的誘導(dǎo)劑包括CuSO4椅野、tail橫截、Poly IC籍胯、二氧化硅納米顆粒等竟闪。

3. 引出語 

生脈飲(SMY)是一種著名的中藥配方，在中國被廣泛使用了幾個(gè)世紀(jì)杖狼，用于治療各種疾病炼蛤，如炎癥相關(guān)疾病。然而蝶涩，SMY的抗炎活性及其潛在機(jī)制尚不清楚理朋。在本研究中，旨在確定SMY對(duì)RAW 264.7細(xì)胞和斑馬魚的抗炎作用绿聘，并探討其潛在機(jī)制嗽上。

體外實(shí)驗(yàn)的第一部分通過首先測(cè)定了lps誘導(dǎo)的RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞中促炎因子IL-6和TNF-α的水平。SMY可顯著降低IL-6和TNF-α的分泌熄攘，提示SMY具有體外抗炎作用兽愤。NF-κB是調(diào)控炎癥發(fā)生和發(fā)展的最經(jīng)典途徑之一。一旦激活挪圾，NF-κB p65亞基與抑制亞基i -κB結(jié)合釋放浅萧，隨后易位到細(xì)胞核中參與多個(gè)靶基因的轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致促炎因子的釋放哲思。此外惯殊，大量研究證實(shí)，活化的STAT3從細(xì)胞質(zhì)易位到細(xì)胞核也殖，并驅(qū)動(dòng)編碼促炎介質(zhì)的靶基因的表達(dá)土思，這表明STAT3在介導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的重要性务热。更有趣的是，活化的NF-κB通路可產(chǎn)生炎癥因子IL-6直接刺激STAT3信號(hào)己儒，活化的STAT3可通過促進(jìn)其核保留進(jìn)一步提高NF-κB活性崎岂。體外研究表明，五味子甲素A和人參皂苷Rk1是SMY中的兩種成分闪湾，可以通過阻斷NF-κB和STAT3信號(hào)通路的激活來緩解炎癥冲甘。因此，第二部分測(cè)試SMY是否通過NF-κB和STAT3通路發(fā)揮其抗炎作用途样。重要的是江醇，在lps刺激的巨噬細(xì)胞中，SMY顯著抑制了i -κB α和STAT3的磷酸化何暇，并減少了NF-κB p65從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的易位陶夜，提示SMY部分抗炎活性可能與抑制NF-κB和STAT3激活有關(guān)。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的第一部分觀察了中性粒細(xì)胞在CuSO4和尾斷誘導(dǎo)炎癥模型中的行為裆站，以證實(shí)SMY的體內(nèi)抗炎作用条辟。結(jié)果表明，SMY明顯減少位于受損神經(jīng)肥大或尾部的中性粒細(xì)胞宏胯，提示其治療炎癥相關(guān)疾病的潛力羽嫡。第二部分進(jìn)一步研究SMY的體內(nèi)抗炎機(jī)制，檢測(cè)了lps刺激斑馬魚中IL-6肩袍、TNF-α杭棵、NF-κB p65、i -κB α和STAT3的基因表達(dá)氛赐。與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致颜屠，SMY通過抑制NF-κB和STAT3信號(hào)通路的激活發(fā)揮抗炎作用。

正文

1. 體外第一部分

首先采用MTT法鑒定SMY對(duì)RAW 264.7巨噬細(xì)胞的無毒劑量鹰祸。3-[4,5-二甲基噻唑-2-醺撸基]-2,5-二苯基四唑溴化物即(MTT)法被廣泛用于檢測(cè)細(xì)胞活力。簡單地說蛙婴，將細(xì)胞以5×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中粗井，在37℃下培養(yǎng)過夜。然后用不同濃度的SMY(3.125街图、6.25浇衬、12.5、25餐济、50耘擂、100、200絮姆、400和800 μg/mL)處理細(xì)胞24 h醉冤，再用30μL MTT (5 mg/mL)孵育4 h秩霍，抽吸上清，加入100 μL DMSO溶解甲酰胺晶體蚁阳。490 nm處的吸光度用微孔板讀取儀讀取铃绒。結(jié)果表明，SMY在100-400 μg/mL濃度下無細(xì)胞毒性螺捐，用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)(圖2)颠悬。

促炎細(xì)胞因子，如IL-6和TNF-α定血，在炎癥的發(fā)生和傳播中發(fā)揮關(guān)鍵作用赔癌。因此，我們通過ELISA試劑盒檢測(cè)了lps誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞中IL-6和TNF-α的蛋白水平澜沟。采用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-6和TNF-α的蛋白水平灾票，如前所述。簡單地說倔喂，用指定濃度的SMY預(yù)處理細(xì)胞2小時(shí)铝条，然后用LPS (100 ng/mL)刺激24小時(shí)靖苇。之后席噩，根據(jù)制造商的說明測(cè)定IL-6和TNF-α的產(chǎn)量。如圖3所示贤壁，SMY能有效抑制IL-6和TNF-α的釋放悼枢，表明SMY通過抑制促炎細(xì)胞因子的分泌在體外具有顯著的抗炎作用。

2. 體外第二部分

為了進(jìn)一步闡明SMY抗炎作用的機(jī)制脾拆，分別采用Western blot和共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測(cè)lps誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞中i -κB α馒索、p -κB α (Ser32)、STAT3和p-STAT3 (Tyr705)蛋白水平和NF-κB p65核易位名船。RAW 264.7細(xì)胞分別以5 × 105的密度在60 mm培養(yǎng)皿中或以1 × 105 /孔的共聚焦培養(yǎng)皿中接種24 h绰上。然后用SMY (400 μg/mL)預(yù)處理2 h，再與LPS (100 ng/mL)共孵育24 h渠驼。Western blotting檢測(cè)i - κ b α蜈块、p- κ b α (Ser32)、STAT3和p-STAT3 (Tyr705)的表達(dá)迷扇。用共聚焦顯微鏡檢測(cè)NF-κB p65的核易位百揭。Western blotting數(shù)據(jù)顯示，LPS在RAW 264.7巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)i - κ b α Ser32位點(diǎn)和STAT3 Tyr705位點(diǎn)磷酸化蜓席，而SMY處理后這些現(xiàn)象明顯被阻止(圖4A)器一。此外，在lps刺激的RAW 264.7細(xì)胞中厨内，NF-κB p65易位到細(xì)胞核中祈秕。SMY處理后渺贤，NF-κB p65主要分布在細(xì)胞質(zhì)中(圖4B)。綜上所述踢步，這些發(fā)現(xiàn)表明SMY減弱了lps誘導(dǎo)的NF-κB和STAT3的激活癣亚。

3. 體內(nèi)第一部分

為檢測(cè)SMY對(duì)斑馬魚的毒性潛勢(shì)，每天監(jiān)測(cè)不同濃度SMY處理后斑馬魚幼魚的形態(tài)變化和死亡率获印。在中性粒細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(MPO:GFP) (Renshaw et al .述雾， 2006)在鹽度為0.03%-0.04%的循環(huán)水生境系統(tǒng)中，以14 h光照/10 h暗光照周期培養(yǎng)兼丰。將受精后第1天的斑馬魚胚胎隨機(jī)分為24孔板(n = 20)玻孟，然后浸泡在不同濃度的SMY (0 ~ 250 μg/mL)中。每天更換培養(yǎng)基鳍征。記錄死胚黍翎，每隔24 h取出一次，直至第6天艳丛。如圖5所示匣掸，選擇存活率大于95%的濃度(12.5 ~ 50 μg/mL)作為無毒劑量進(jìn)行后續(xù)使用。

為了觀察SMY在體內(nèi)的防御作用氮双，我們將LPS (2 nL)微注射到3dpf幼魚的卵黃囊中碰酝，誘導(dǎo)其致死性炎癥。隨后戴差，將這些幼蟲隨機(jī)分為24孔板(n = 20/孔)送爸，分別用不同濃度的SMY(12.5、25暖释、50 μg/mL)浸泡袭厂。微量注射PBS (2 nL)作為對(duì)照，陽性藥物為Dex (5 μg/mL) 球匕。12 h后纹磺，在熒光顯微鏡下拍攝幼魚，觀察熒光中性粒細(xì)胞的行為亮曹，并取樣進(jìn)行存活分析橄杨。結(jié)果表明SMY可以提高lps刺激的斑馬魚的存活率，最大可提高40%乾忱，這一趨勢(shì)與Dex治療相似(圖6)讥珍。

炎癥細(xì)胞向炎癥部位浸潤是炎癥反應(yīng)發(fā)生過程中的關(guān)鍵事件，因此采用H&E染色觀察幼蟲的組織病理學(xué)變化窄瘟。簡單地說衷佃，將12 hpi的幼魚轉(zhuǎn)移到1.5 mL無菌管中，用PBS洗滌兩次蹄葱，然后在4% 多聚甲醛中固定過夜氏义。將固定的幼蟲在升序乙醇中脫水锄列，在分級(jí)二甲苯中透明，然后包埋石蠟惯悠。然后制備4 μm厚的載玻片邻邮，進(jìn)行H&E染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察卵黃囊的病理變化克婶。結(jié)果顯示筒严，在LPS刺激的斑馬魚中，許多炎癥細(xì)胞浸潤到卵黃囊中情萤，而這些浸潤被SMY處理抑制(圖7)鸭蛙，這進(jìn)一步表明SMY可以保護(hù)LPS刺激的斑馬魚。

中性粒細(xì)胞是先天免疫防御病原體的第一道防線筋岛，在炎癥反應(yīng)的進(jìn)展和消除中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用娶视，而中性粒細(xì)胞向炎癥部位的遷移是炎癥的最重要特征之一。在這里睁宰，研究了SMY是否在體內(nèi)調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的募集肪获。將在中性粒細(xì)胞上表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg (MPO:GFP)應(yīng)用于lps刺激的炎癥模型。接下來柒傻，為了證實(shí)SMY孝赫、CuSO4和尾巴橫斷誘導(dǎo)的炎癥模型對(duì)中性粒細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，我們?cè)?/span>3只dpf斑馬魚幼魚中構(gòu)建了化學(xué)或物理損傷側(cè)線神經(jīng)肥大或尾巴以刺激炎癥反應(yīng)的模型诅愚。將3dpf斑馬魚幼魚隨機(jī)置于24孔板(n = 20/孔)中寒锚，在不同濃度SMY存在或不存在的情況下暴露于20 μM的CuSO4中2 h劫映，以Dex (5 μg/mL)為陽性對(duì)照违孝，在熒光顯微鏡下觀察中性粒細(xì)胞的募集情況。采用SZX7立體顯微鏡(Olympus, Tokyo, Japan)對(duì)3dpf斑馬魚幼魚進(jìn)行麻醉泳赋，用手術(shù)刀切尾損傷雌桑，然后用不同濃度的SMY(12.5、25祖今、50 μg/mL)或Dex (5 μg/mL)浸泡6 h校坑，在熒光顯微鏡下觀察損傷尾部募集的熒光中性粒細(xì)胞。結(jié)果表明千诬，與未處理的幼蟲相比耍目，CuSO4攻擊或截尾均明顯增加了傷區(qū)中性粒細(xì)胞的數(shù)量。然而徐绑，用50 μg/mL的SMY處理導(dǎo)致中性粒細(xì)胞募集的急劇減少(圖8)邪驮，提示SMY在體內(nèi)具有抗炎作用。對(duì)照組中性粒細(xì)胞分布于腹主動(dòng)脈區(qū)傲茄。而中性粒細(xì)胞在LPS的作用下明顯被招募到幼蟲的卵黃囊中毅访。有趣的是沮榜，這種招募被SMY劑量依賴性地顯著抑制，這意味著SMY治療抑制了炎癥反應(yīng)(圖8)喻粹。

4. 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)第二部分

為了闡明SMY在體內(nèi)發(fā)揮抗炎作用的原因蟆融，首先通過qRT-PCR分析確定了SMY對(duì)lps刺激的斑馬魚促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α表達(dá)的影響。結(jié)果顯示守呜，SMY在體內(nèi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上抑制IL-6和TNF-α的釋放(圖9)型酥。要進(jìn)一步探索NF-κB和STAT3是否參與SMY體內(nèi)抗炎作用，檢測(cè)其基因表達(dá)水平查乒。研究發(fā)現(xiàn)冕末，SMY可有效抑制lps誘導(dǎo)的斑馬魚NF-κB p65、i -κB α和STAT3的上調(diào)(圖10)侣颂，表明SMY調(diào)節(jié)IL-6和TNF-α表達(dá)的抗炎活性至少部分是通過抑制lps刺激的斑馬魚NF-κB和STAT3信號(hào)的激活來介導(dǎo)的档桃。

結(jié)語：綜上所述，研究首次證明了SMY在體外(RAW 264.7巨噬細(xì)胞)和體內(nèi)(斑馬魚幼魚)均具有顯著的抗炎特性憔晒。我們進(jìn)一步闡明了SMY可能抑制NF-κB和STAT3通路的激活藻肄，從而減弱促炎細(xì)胞因子的表達(dá)的潛在機(jī)制(圖11)【艿＃總之嘹屯，這些發(fā)現(xiàn)為SMY治療炎癥相關(guān)疾病的臨床應(yīng)用提供了證據(jù)，并支持斑馬魚在炎癥中的關(guān)鍵作用从撼。