編輯：孫惠敏
原文地址：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0378874119330843?via%3Dihub

前言

涼膈散（LGS）是一種傳統(tǒng)的中藥配方，起源于中國(guó)宋朝的《太平惠民合劑局方》传货，被廣泛應(yīng)用于臨床感染的治療屎鳍，包括咽炎、扁桃體炎问裕、急性肺炎和急性肺損傷逮壁。然而，LGS的抗炎作用及其潛在機(jī)制尚未得到充分的研究粮宛。脂多糖（LPS）窥淆，又稱(chēng)內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分巍杈。作為最有效的促炎激動(dòng)劑之一忧饭，可引起發(fā)熱、多器官功能障礙綜合征筷畦、內(nèi)毒素休克甚至死亡词裤。

斑馬魚(yú)（Danio rerio）近年來(lái)已成為研究先天免疫功能的一種強(qiáng)大的動(dòng)物模型。這種脊椎動(dòng)物具有體積小、生長(zhǎng)快吼砂、產(chǎn)量高和胚胎透明性等優(yōu)點(diǎn)作媚，可以在體內(nèi)實(shí)時(shí)可視化熒光蛋白。斑馬魚(yú)的先天免疫系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物非常相似帅刊，與大多數(shù)人類(lèi)免疫細(xì)胞類(lèi)型都相同。斑馬魚(yú)的先天免疫系統(tǒng)早在受精后24小時(shí)（hpf）就開(kāi)始發(fā)育漂问，有原始巨噬細(xì)胞赖瞒，在32-48hpf時(shí)出現(xiàn)中性粒細(xì)胞，這為研究幼蟲(chóng)的先天免疫提供了機(jī)會(huì)蚤假。

在研究中栏饮，作者利用顯微注射LPS斑馬魚(yú)模型和和LPS刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)LGS具有顯著抗炎作用。LGS介導(dǎo)的抗炎作用可能通過(guò)抑制p-JNK（Thr183/Tyr185）和p-Nur77（Ser351）的激活磷仰。因此袍嬉，LGS可能是一種很有前途的治療急性炎癥性疾病的藥物。

圖1 LGS對(duì)LPS刺激下3-dpf斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)的保護(hù)作用

首先檢測(cè)了LGS對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的毒性（毒理研究）灶平，發(fā)現(xiàn)在62.5 μg/mL伺通、125 μg/mL和250 μg/mL劑量下對(duì)幼魚(yú)沒(méi)有任何毒性作用。對(duì)3dpf幼魚(yú)隨機(jī)分為6組逢享，進(jìn)行0.5 mg/mL LPS 或 PBS卵黃囊顯微注射罐监，隨后用DEX (5 μg/mL)或LGS(62.5、125瞒爬、250 μg/mL)處理弓柱。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在注射72小時(shí)（72 hpi）時(shí)，LPS卵黃微注射斑馬魚(yú)100%死亡侧但，而PBS卵黃顯微注射斑馬魚(yú)完全存活矢空。LGS劑量依賴(lài)性地增加了LPS感染幼蟲(chóng)的存活率，DEX對(duì)脂多糖感染的幼蟲(chóng)也有保護(hù)作用禀横。接著對(duì)不同處理斑馬魚(yú)進(jìn)行包埋切片屁药，蘇木精和伊紅（H&E）染色顯示LGS/DEX處理顯著降低了LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。IL-6和TNF-α是先天免疫反應(yīng)系統(tǒng)中重要的促炎細(xì)胞因子燕侠，LPS顯著提高了IL-6和TNF-α的mRNA水平者祖，LGS（250 μg/ mL）可顯著抑制了LPS誘導(dǎo)的IL-6和TNF-α的上調(diào)，DEX對(duì)IL-6和TNF-α的表達(dá)也有抑制作用绢彤。綜上所述七问，這些結(jié)果表明LGS對(duì)LPS卵黃囊顯微注射斑馬魚(yú)具有保護(hù)作用，并抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥茫舶。

圖2 LGS抑制LPS卵黃顯微注射斑馬魚(yú)中中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的募集

采用雙轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg（coro1a:GFP械巡；lyz:Dsred）系研究LPS感染后中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在卵黃囊中的募集。蘇丹黑（SB）染色可以用于檢測(cè)嗜中性粒細(xì)胞的存在，因此采用SB染色法觀察斑馬魚(yú)體內(nèi)的中性粒細(xì)胞讥耗。在12 hpi時(shí)有勾，卵黃囊中出現(xiàn)大而清晰的細(xì)胞淋巴脂滴，使用LGS處理導(dǎo)致中性粒細(xì)胞招募減少古程。中性紅（NR）可被巨噬細(xì)胞溶酶體內(nèi)吞蔼卡，形成一個(gè)大的紅色空泡聚集物。我們通過(guò)NR染色檢測(cè)巨噬細(xì)胞的募集挣磨，在12 hpi時(shí)雇逞，注射LPS的幼魚(yú)NR標(biāo)記的巨噬細(xì)胞顯著增加，而LGS以劑量依賴(lài)的方式顯著減少了巨噬細(xì)胞的募集茁裙。DEX處理組也有類(lèi)似的現(xiàn)象塘砸。這些結(jié)果表明，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞都參與LPS誘導(dǎo)的急性炎癥晤锥，LGS顯著減少了斑馬魚(yú)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的募集掉蔬。

圖3 LGS通過(guò)抑制抑制p-JNK和p-Nur77激活抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞的炎癥反應(yīng)

接下來(lái)測(cè)定了LPS和LGS對(duì)RAW 264.7細(xì)胞影響。結(jié)果顯示矾瘾，LPS處理顯著增加了TNF-α和IL-6的表達(dá)水平女轿，而LGS顯著恢復(fù)LPS誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6增加。蛋白印記（WB）實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)壕翩，LGS通過(guò)劑量依賴(lài)方式抑制了LPS誘導(dǎo)的Nur77磷酸化谈喳，上調(diào)了細(xì)胞中Nur77的表達(dá)。LGS也抑制了LPS誘導(dǎo)的JNK磷酸化戈泼，而不影響JNK的表達(dá)婿禽。這些結(jié)果表明，LGS在LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中具有抗炎作用大猛，并通過(guò)抑制Nur77和JNK的激活來(lái)減輕LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)扭倾。

圖4 LGS抑制CuSO₄和斑馬魚(yú)剪尾誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞募集

CuSO₄可通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和細(xì)胞死亡，迅速破壞側(cè)線系統(tǒng)的毛細(xì)細(xì)胞挽绩。斑馬魚(yú)尾鰭損傷模型是一種身體創(chuàng)傷模型膛壹，通常也用于抗炎研究。CuSO₄暴露和尾鰭損傷分別代表化學(xué)損傷和物理?yè)p傷唉堪，接著用這兩種方式驗(yàn)證LGS對(duì)炎癥的作用模聋。結(jié)果顯示，暴露在CuSO₄中后唠亚，大量的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集在神經(jīng)丘周?chē)捶剑?/span>LGS則顯著抑制了CuSO₄對(duì)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的遷移。在剪尾4 h后灶搜，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在剪尾部位明顯積累祟蚀，LGS以劑量依賴(lài)的方式顯著抑制中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的募集工窍，和DEX表現(xiàn)出相同效果。這些結(jié)果證實(shí)了LGS的抗炎活性前酿。

結(jié)語(yǔ)：綜上所述患雏，我們首次證明了著名的中藥配方LGS在三種斑馬魚(yú)炎癥模型中具有顯著的抗炎特性。我們探討了LGS可能抑制JNK和Nur77激活的潛在機(jī)制罢维。這些發(fā)現(xiàn)為應(yīng)用LGS成為一種治療急性炎癥疾病的有效藥物提供了基礎(chǔ)淹仑。