前言

在過去的幾十年里芍碧，肝病逐漸成為世界范圍內(nèi)死亡和患病的主要原因之一煌珊。盡管人類已經(jīng)開發(fā)出了疫苗和抗病毒藥物，但由于人們的預(yù)期壽命延長泌豆、久坐不動(dòng)的生活方式和營養(yǎng)過度等因素定庵，全球肝病負(fù)擔(dān)仍將進(jìn)一步加重。我國是世界上肝炎第一大國踪危，根據(jù)2018年國際癌癥研究中心的一份報(bào)告蔬浙，中國的肝癌發(fā)病率位居第9，中國的肝癌患者人數(shù)是全球最多的贞远。據(jù)估計(jì)畴博，在中國，約有五分之一的人口受到某種形式的肝臟疾病困擾蓝仲，包括乙型肝炎病毒(HBV)俱病、丙型肝炎病毒(HCV)官疲、肝硬化、肝癌亮隙、非酒精脂肪肝(NAFLD)途凫、酒精肝病(ALD)、藥物誘導(dǎo)肝損等溢吻。

隨著肝膽相關(guān)疾病發(fā)病率的增加维费，深入理解肝病發(fā)展過程中分子、細(xì)胞和生理因素在臨床診斷和治療中的作用顯得尤為重要促王。合適的動(dòng)物模型能夠幫助針對(duì)性的識(shí)別相關(guān)疾病的可能機(jī)制犀盟。近些年，在肝臟發(fā)育蝇狼、再生阅畴、癌癥、損傷题翰，以及相關(guān)藥物篩選和評(píng)價(jià)等方面的研究進(jìn)展使得斑馬魚模式生物在生物醫(yī)學(xué)研究中得到研究學(xué)者的廣泛認(rèn)可恶阴。接下來，本文將從斑馬魚模型在肝臟疾病研究中的優(yōu)勢(shì)及應(yīng)用對(duì)其進(jìn)行介紹豹障。

01 斑馬魚模型在肝臟疾病研究中的優(yōu)勢(shì)

斑馬魚肝臟的細(xì)胞表型與哺乳動(dòng)物相似，除了肝臟免疫細(xì)胞(即Kupffer細(xì)胞) 之外焦匈，斑馬魚肝臟還包含哺乳動(dòng)物肝臟中的其他細(xì)胞類型血公，擁有許多相同的細(xì)胞功能，包括膽汁分泌缓熟、糖原和脂質(zhì)儲(chǔ)存累魔、胰島素反應(yīng)、異種物質(zhì)和氨代謝以及血清蛋白的分泌够滑，如補(bǔ)體和凝血因子垦写、轉(zhuǎn)鐵蛋白和白蛋白樣蛋。此外彰触，斑馬魚與人類基因的同源性高達(dá)87%梯投，基因信號(hào)傳導(dǎo)通路、代謝通路也與哺乳動(dòng)物高度相似况毅。研究人員利用斑馬魚和哺乳動(dòng)物在肝細(xì)胞組成分蓖、功能以及遺傳學(xué)方面的相似性可深入了解主要肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制。且斑馬魚的肝臟功能發(fā)育完成于5d之內(nèi)尔许，藥物的肝毒性評(píng)價(jià)結(jié)果往往在1周之內(nèi)么鹤。

斑馬魚的基因組序列完整，易于操作味廊。目前通過基因敲除或者敲入已經(jīng)產(chǎn)生了超過1萬個(gè)突變體蒸甜，這些變化創(chuàng)造了新的生物醫(yī)學(xué)模型棠耕，并且已經(jīng)培育了幾種斑馬魚轉(zhuǎn)基因系來研究人類疾病。斑馬魚幼魚尤其是胚胎具有光學(xué)透明性柠新，因此通過光學(xué)顯微鏡就能夠獲得體內(nèi)發(fā)育和多種病理過程的直觀影像窍荧。

斑馬魚肝組織結(jié)構(gòu)（→肝血竇，△肝細(xì)胞）

圖片素材來源于文獻(xiàn)《斑馬魚器官石蠟組織切片制作與觀察》

近些年登颓，斑馬魚研究中所需的分子遺傳技術(shù)也得到快速發(fā)展搅荞。通過控制熒光蛋白表達(dá)就能夠輕易的實(shí)現(xiàn)對(duì)肝細(xì)胞、肝內(nèi)膽道細(xì)胞框咙、內(nèi)皮細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞的在體觀察咕痛，更加有助于研究人員使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)器官發(fā)育、臟器大小喇嘱、不同類型細(xì)胞之間相互作用以及對(duì)傷害反應(yīng)的詳細(xì)研究茉贡。不僅如此，研究者還可以利用這些轉(zhuǎn)基因斑馬魚和熒光激活細(xì)胞分選術(shù)來分離不同類型的肝細(xì)胞者铜，用于下游的組學(xué)和生物指標(biāo)分析腔丧。

目前，商業(yè)上可用的熒光脂類類似物旨在用來觀察活魚體內(nèi)脂質(zhì)的攝取和處理作烟，而且在檢測(cè)肝膽損傷方面具有極高的敏感性愉粤。由于斑馬魚肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能與哺乳動(dòng)物相似，哺乳動(dòng)物肝毒性研究中常見的組織病理學(xué)切片和染色技術(shù)也同樣適用于評(píng)價(jià)斑馬魚肝病組織病理學(xué)的改變拿撩。此外衣厘，傳統(tǒng)的分子生物技術(shù)，比如RT-PCR压恒，Western blot技術(shù)影暴，免疫組化，基因編輯和組學(xué)技術(shù)也都適用于斑馬魚肝毒性評(píng)價(jià)中探赫。

02 斑馬魚模型在肝臟疾病研究中的應(yīng)用

非酒精性脂肪肝

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease型宙，NAFLD)是近年來發(fā)病率不斷上升的一種疾病，其特點(diǎn)是肝細(xì)胞內(nèi)脂肪的過度積累伦吠，而與過量飲酒無關(guān)妆兑。傳統(tǒng)上，嚙齒動(dòng)物模型被廣泛用于NAFLD的機(jī)制和測(cè)試候選藥物研究讨勤。然而箭跳，使用嚙齒動(dòng)物模型往往涉及到研究者較大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此嚙齒動(dòng)物不適合大樣本篩選潭千。斑馬魚的肝臟在細(xì)胞結(jié)構(gòu)谱姓、功能和遺傳學(xué)上與人類肝臟相似，且具有高通量刨晴，經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較低的特性屉来。這一發(fā)現(xiàn)促使研究人員使用斑馬魚來研究與人類肝臟發(fā)育相關(guān)的胚胎學(xué)和遺傳學(xué)細(xì)節(jié)路翻，以及肝臟疾病和潛在的肝病治療方法。

NAFLD是一個(gè)廣泛的分類茄靠，包含了單純性脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)茂契。NASH可能會(huì)從非酒精性脂肪性肝炎發(fā)展為纖維化，最終可能引發(fā)更嚴(yán)重的疾病慨绳。最近研究表明掉冶，斑馬魚的脂質(zhì)代謝過程和NAFLD的發(fā)生機(jī)制與人類相似，肝臟代謝紊亂會(huì)引起人類和斑馬魚的脂肪肝脐雪，比如高脂肪或高糖的飲食厌小、禁食、毒素暴露战秋、蛋氨酸消耗和遺傳因素璧亚。在極少數(shù)情況下，先天性代謝紊亂和其他遺傳病也可引起脂肪肝脂信。

最重要的是人類和斑馬魚FLD模型具有許多相似的特征癣蟋，包括肝細(xì)胞的增大和膨脹、甘油三酯的積累狰闪、激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response疯搅，UPR)的分泌通路功能障礙以及活性氧(reactive oxygen species，ROS)的增加等埋泵。此外秉撇，氧化應(yīng)激和脂肪因子超載可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加重肝細(xì)胞損傷秋泄、血管改變和纖維化。截止到目前规阀，研究者利用轉(zhuǎn)基因恒序、化學(xué)誘導(dǎo)和飲食誘導(dǎo)等方法建立的斑馬魚NAFLD模型被應(yīng)用于臨床研究和藥物評(píng)價(jià)中，而且斑馬魚在脂質(zhì)代謝研究方面的潛力得到了積極的報(bào)道谁撼。

酒精性脂肪肝

長期飲酒是世界范圍內(nèi)慢性肝病的主要原因歧胁，酒精對(duì)肝臟的急性影響尤其令人擔(dān)憂。幾十年來厉碟，研究人員一直在使用含乙醇的利伯-迪卡里液體飼料喂食來誘導(dǎo)嚙齒類動(dòng)物的ALD模型喊巍。然而，這種飲食只能誘導(dǎo)嚙齒類動(dòng)物出現(xiàn)輕度脂肪變性箍鼓，即使以接近人類正常醉酒狀態(tài)酒精喂養(yǎng)長達(dá)9個(gè)月后才會(huì)出現(xiàn)ALD特征崭参。近年來，斑馬魚幼魚已成為一種新的酒精性肝病脊椎動(dòng)物模型款咖。斑馬魚幼魚實(shí)驗(yàn)可以重復(fù)多次何暮，展現(xiàn)出較強(qiáng)統(tǒng)計(jì)功能和詳細(xì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的優(yōu)勢(shì)奄喂，目前最有效的研究主要集中在幼魚對(duì)乙醇的急性效應(yīng)上。然而海洼，由于年齡的顯著差異跨新，幼魚的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能不能準(zhǔn)確地概括人類酗酒的狀況。因此坏逢，研究者逐步開始將斑馬魚成魚作為研究酒精肝的模式生物域帐。

近期研究者發(fā)現(xiàn)，低濃度乙醇(0.2%) 處理成年斑馬魚4周能夠引起脂肪變性和肝細(xì)胞膨脹是整，促進(jìn)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性肖揣、血糖和三酰甘油顯著升高。且結(jié)果表明發(fā)現(xiàn)參與糖脂代謝贰盗、線粒體生物發(fā)生和功能许饿、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的基因表達(dá)水平顯著上調(diào)《嬗總之陋率，在低劑量慢性酒精暴露下，成年斑馬魚很好地再現(xiàn)了ALD患者的病理秽晚、代謝和應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)瓦糟。成年斑馬魚ALD模型可以作為研究人類慢性肝病的替代動(dòng)物模型。目前赴蝇，斑馬魚NAFLD模型已經(jīng)被廣泛的用于中藥中具有顯著NAFLD治療活性的化合物的篩選和評(píng)價(jià)菩浙。

在斑馬魚的遺傳學(xué)研究中，aft6是乙醇誘導(dǎo)脂肪變性的充分必要條件句伶，UPR活化可以引起乙醇誘導(dǎo)的肝臟疾病劲蜻。這些發(fā)現(xiàn)表明atf6是酒精誘導(dǎo)FLD的重要中介物質(zhì)。有趣的是考余，轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)乙醇誘導(dǎo)的UPR-ome與atf6過表達(dá)誘導(dǎo)的基因幾乎完全重疊先嬉。因此，atf6可能作為一種機(jī)制楚堤，感知和介導(dǎo)肝細(xì)胞蛋白分泌對(duì)酒精的反應(yīng)疫蔓，這有望能夠?qū)?/span>ALD與FLD的其他病因區(qū)分開來。IMRAN M 等最近的研究使用斑馬魚幼魚來測(cè)試膜重塑對(duì)肝臟毒性的影響身冬，結(jié)果表明將肥胖斑馬魚幼魚同時(shí)暴露于苯并［a］芘和乙醇能夠通過膜重塑誘導(dǎo)斑馬魚肝臟毒性衅胀。以上談到的研究結(jié)果都有助于促使科學(xué)家開發(fā)出一種治療脂肪肝疾病及其相關(guān)危險(xiǎn)因素的方法。

肝纖維化和肝硬化

慢性肝損傷和炎癥可導(dǎo)致膠原沉積和纖維化酥筝。肝纖維化和肝硬化(肝代謝和合成功能喪失)以及門脈高壓患者血流動(dòng)力學(xué)改變的血管匯合度是造成慢性肝病患者高發(fā)病率和高死亡率的原因滚躯。日益加重肝纖維化的負(fù)擔(dān)和有效的抗纖維化治療缺乏，突出了對(duì)肝纖維化途徑和互補(bǔ)模型系統(tǒng)識(shí)別的必要性。目前臨床上還沒有有效的治療方法來預(yù)防或逆轉(zhuǎn)肝硬化哀九，而任何新穎的治療方法都需要臨床前動(dòng)物模型進(jìn)行廣泛試驗(yàn)剿配。

眾所周知，肝星狀細(xì)胞(HSCs) 的活化是肝纖維化的核心阅束，也是抗纖維化藥物研究的主要焦點(diǎn)呼胚。有研究報(bào)道了斑馬魚胚胎肝纖維化模型。在水中加入乙醇后息裸，斑馬魚胚胎出現(xiàn)急性纖維化反應(yīng)蝇更，其特征是膠原蛋白和星狀細(xì)胞增殖標(biāo)記物(Hand-2)蛋白水平升高。在上述條件下呼盆，與人類一樣年扩，熒光蛋白標(biāo)記的肝星狀細(xì)胞被激活并能夠分泌與纖維化有關(guān)的細(xì)胞外成分。同時(shí)访圃，近期研究表明斑馬魚模型和人類在肝纖維化過程具有相似的轉(zhuǎn)化途徑厨幻。比如研究表明硫代乙酰胺(TAA)可能通過類似于人類和小鼠的作用機(jī)制可誘來導(dǎo)斑馬魚胚胎肝纖維化，同時(shí)腿时，充質(zhì)干細(xì)胞似乎可以阻止肝纖維化的發(fā)生况脆；斑馬魚體內(nèi)肝臟和培養(yǎng)的HSCs中MPI的缺失激活了纖維化反應(yīng)，添加甘露糖可以減弱HSCs的激活批糟，從而降低斑馬魚格了、培養(yǎng)激活的HSCs和乙醇激活的HSCs的纖維化激活。

以上研究結(jié)果都為未來的肝纖維化機(jī)制研究和改善肝纖維化程度治療研究提供了一個(gè)有效快速模型徽鼎。這種方法的一個(gè)局限性是盛末，在成年斑馬魚中既沒有觀察到晚期纖維化，也沒有觀察到肝硬化否淤。相反悄但，在急性乙醇誘導(dǎo)肝臟疾病中發(fā)現(xiàn)了星狀細(xì)胞活性的變化，這種變化可能被證明是一種有用的表型來篩選能夠調(diào)節(jié)星狀細(xì)胞活化的基因和化合物石抡、開發(fā)抗纖維化的新療法算墨。

藥物性肝損傷藥物性肝損傷 (drug induced liver injury，DILI) 可導(dǎo)致大量肝細(xì)胞死亡而引起急性肝功能衰竭汁雷。魚類肝細(xì)胞中能夠表達(dá)多種CYP酶，這些酶能夠通過與哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞相似的代謝途徑代謝外源物質(zhì)报咳。3日齡(dpf)斑馬魚的肝臟已具有完整的代謝功能侠讯，因此3dpf的幼魚通常被用于DILI相關(guān)研究。研究表明暴露于4-氯苯胺后斑馬魚肝臟首先出現(xiàn)的是修復(fù)過程暑刃，并且肝臟組織結(jié)構(gòu)改變和動(dòng)物存活率表現(xiàn)出明顯的劑量相關(guān)性厢漩。此后斑馬魚模型被用來評(píng)估許多化合物的潛在肝毒性。目前有關(guān)乙酰氨基酚(撲熱息痛) 和環(huán)境毒素對(duì)斑馬魚肝臟影響的研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展岩臣，利用斑馬魚來篩選肝毒性化合物的同時(shí)溜嗜，斑馬魚也可能被用來篩選具有拮抗 DILI 的新化合物宵膨。事實(shí)，上許多生物技術(shù)公司已經(jīng)利用斑馬魚的相對(duì)成本效益來評(píng)估大量化合物和藥物的毒性炸宵。

結(jié)語

基于斑馬魚肝臟發(fā)育和病理辟躏、生理發(fā)展中所表現(xiàn)出的巨大優(yōu)勢(shì)，利用斑馬魚研究肝臟病理和藥物誘導(dǎo)肝臟毒性的研究人員越來越多土全，斑馬魚肝膽疾病方面相關(guān)研究的文章數(shù)量也在同步增長捎琐。同時(shí)，新的工具和方法正在不斷得到開發(fā)裹匙，包括基因編輯技術(shù)瑞凑，大規(guī)模的化學(xué)篩選設(shè)備，先進(jìn)的成像方法概页，肝細(xì)胞標(biāo)記和跟蹤等相關(guān)技術(shù)籽御。斑馬魚的相關(guān)研究不僅能夠增加我們對(duì)肝病機(jī)制的了解，還能在對(duì)臨床患者進(jìn)行測(cè)試之前確定新的治療靶點(diǎn)惰匙，評(píng)價(jià)測(cè)試候選化合物的療效和安全性技掏。

總的來說，斑馬魚越來越被認(rèn)為是肝病研究中一個(gè)有價(jià)值的新模型徽曲，它是體外細(xì)胞評(píng)價(jià)模型和體內(nèi)嚙齒動(dòng)物模型系統(tǒng)的補(bǔ)充零截。對(duì)斑馬魚肝臟疾病模型的研究將為疾病發(fā)病機(jī)制相關(guān)的分子事件和細(xì)胞機(jī)制提供新的見解。通過斑馬魚進(jìn)行高通量的基因篩選和化學(xué)篩選秃臣，有望為識(shí)別新的治療目標(biāo)提供巨大的機(jī)會(huì)涧衙。

以上內(nèi)容參考自《中國中藥雜志》發(fā)表的李芝奇、徐玥奥此、趙霞弧哎、賈哲、王昭懿稚虎、馮丹撤嫩、李翠柏、馬志強(qiáng)蠢终、趙崇軍序攘、林瑞超等題為“斑馬魚作為一種重要的工具進(jìn)行肝臟疾病研究”的論文。