前言

血液系統(tǒng)是維持機(jī)體生命活動(dòng)重要的系統(tǒng)之一仰迁，為機(jī)體提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)甸昏，通過物質(zhì)交換維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，同時(shí)提供免疫防御與保護(hù)徐许。血液系統(tǒng)包含紅系細(xì)胞施蜜、髓系細(xì)胞以及淋系細(xì)胞等多種成熟血細(xì)胞，而這些血細(xì)胞均由造血過程產(chǎn)生雌隅。造血過程是造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells, HSCs)及各類血細(xì)胞產(chǎn)生翻默、分化及發(fā)育成熟的過程缸沃，開始于胚胎發(fā)育早期并貫穿整個(gè)生命過程。

血液病是原發(fā)于血液系統(tǒng)修械，或影響造血系統(tǒng)伴發(fā)血液異常的一類疾病趾牧。血液病種類繁多，且多數(shù)為難治性或惡性疾患肯污，近年來發(fā)病率有逐漸增高的趨勢(shì)翘单，其中白血病的發(fā)病率和死亡率更是居于我國(guó)惡性腫瘤前10位。因此蹦渣，針對(duì)疾病臨床需求深入開展基礎(chǔ)研究哄芜，解析疾病發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

應(yīng)用模式動(dòng)物柬唯，針對(duì)關(guān)鍵致病因子構(gòu)建疾病模型忠烛，對(duì)于人類疾病機(jī)制研究、治療及藥物評(píng)價(jià)至關(guān)重要权逗。斑馬魚造血過程及調(diào)控機(jī)制與哺乳動(dòng)物高度保守美尸，結(jié)合體外受精、早期胚胎透明斟薇、豐富的轉(zhuǎn)基因魚系等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)师坎，斑馬魚已成為造血發(fā)育以及人類疾病研究的常用模式動(dòng)物之一。在斑馬魚體內(nèi)模擬致病因子異常變化構(gòu)建相關(guān)血液疾病模型堪滨，可用于腫瘤發(fā)生發(fā)展可視化研究及高通量化學(xué)篩選胯陋。以下為大家系統(tǒng)的總結(jié)了斑馬魚模型在血液疾病研究中的應(yīng)用。

1.斑馬魚血液疾病模型

骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasm袱箱，MPNs）

可分為3個(gè)亞型：真性紅細(xì)胞增多癥（polycythemia vera遏乔，PV）、原發(fā)性血小板增多癥（essential thrombocythemia发笔，ET）和原發(fā)性骨髓纖維化（primary myelofibrosis盟萨，PMF），這些亞型均伴有血栓形成和出血等疾病相關(guān)并發(fā)癥了讨。JAK2捻激、MPL、CALR或CSF3R等基因的突變常見于MPNs患者前计。盡管存在治療策略胞谭，但對(duì)JAK2抑制劑等藥物的耐藥性仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。

在人類MPNs患者中JAK2基因的功能突變（V617F）是最為常見的男杈。為了在斑馬魚身上建立這種疾病的模型丈屹，通過位點(diǎn)定向誘變成功構(gòu)建了人類JAK2v617f的同源物。突變體與人類真性紅細(xì)胞增多癥具有高度相似性伶棒，主要表現(xiàn)為紅細(xì)胞增多旺垒。另一種常見的突變基因?yàn)?/span>CALR彩库，它編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白。通過mRNA注射在斑馬魚胚胎表達(dá)突變的人類CALR基因袖牙，可以導(dǎo)致血小板生成增加，類似于ET患者中觀察到的表型舅锄。這兩個(gè)品系都為篩選靶向Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子（the Janus kinase/signal transducer and activator of tran-ions鞭达，JAK/STAT）信號(hào)通路的治療藥物提供了可靠的模型。

急性髓系白血不史蕖（acute myeloid leukemia畴蹭，AML）

該病是成人最常見的急性白血病，是一個(gè)具有高度異質(zhì)性的疾病群鳍烁，其特征是白血病母細(xì)胞在骨髓叨襟、外周血等器官不受控制的增殖和積聚。常發(fā)生在老年人幔荒，并且在臨床過程中出現(xiàn)進(jìn)行性現(xiàn)象糊闽。AML治療的主要障礙是初期誘導(dǎo)治療的難度大，同時(shí)在緩解后復(fù)發(fā)的現(xiàn)象也非常常見爹梁。

最早的 AML模型是在斑馬魚胚胎中短暫表達(dá)人融合癌基因右犹，然而這些模型均存在早期致死現(xiàn)象，無法在成體期進(jìn)行研究姚垃。第一個(gè)成功的非胚胎致死AML模型是用spi1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)MYST3-NCOA2融合基因表達(dá)念链，該模型中髓系前體細(xì)胞廣泛侵襲斑馬魚腎臟，然而AML發(fā)病率低积糯、潛伏期長(zhǎng)掂墓。在時(shí)間上控制致癌基因的表達(dá)可以有效解決胚胎死亡問題。

在斑馬魚胚胎中熱激處理誘導(dǎo) AML1-ETO融合基因表達(dá)可模擬人AML部分癥狀看成，機(jī)制研究表明AML1-ETO通過scl影響紅-髓系祖細(xì)胞分化君编，促進(jìn)粒細(xì)胞產(chǎn)生。應(yīng)用轉(zhuǎn)基因魚系Tg(spi1-loxP-EGFP-loxP-NUP98-HOXA9)與 Tg (hsp70：Cre)雜交川慌，可以特異性地在髓系細(xì)胞中誘導(dǎo)致癌基因表達(dá)啦粹。胚胎期過表達(dá)NHA9可干擾早期造血發(fā)育，導(dǎo)致髓系前體占優(yōu)勢(shì)窘游；而在成體期過表達(dá)NHA9可導(dǎo)致23%的轉(zhuǎn)基因魚在19~23個(gè)月時(shí)出現(xiàn)骨髓增殖性腫瘤(myeloprolifera tive neoplasms, MPN)唠椭。

利用此模型，加拿大戴爾豪斯大學(xué)Jason Berma 團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑與組蛋白去乙跞淌危化酶抑制劑結(jié)合可恢復(fù)NHA9過表達(dá)胚胎的正常血液發(fā)育贪嫂，該發(fā)現(xiàn)揭示了NHA9與表觀遺傳調(diào)控之間的聯(lián)系，展示了協(xié)同藥物組合在NHA9誘導(dǎo)的髓系疾病中的治療潛力艾蓝。

急性淋巴細(xì)胞白血擦Τ纭（acute lymphocytic leukemia斗塘，ALL）

這是一種影響兒童和成人的淋巴祖細(xì)胞的惡性腫瘤性疾病，可分為急性T淋巴細(xì)胞白血病和急性B淋巴細(xì)胞白血病亮靴。近40年來馍盟，對(duì)兒童ALL的基礎(chǔ)和臨床研究取得了巨大成就。目前存在著聯(lián)合藥物化療方案茧吊，兒童的治愈率可>90%贞岭，成人為40%。

急性T淋巴細(xì)胞白血病（T-ALL）的特征是未成熟的T細(xì)胞祖細(xì)胞異常增殖搓侄，在兒童ALL病例中占15%瞄桨，在成人ALL病例中占25%。許多急性T淋巴細(xì)胞白血病病例中讶踪，Myc表達(dá)上調(diào)芯侥。Langenau等使用特異性的淋巴細(xì)胞啟動(dòng)子rag2來驅(qū)動(dòng)癌基因c-Myc表達(dá)，首先構(gòu)建了斑馬魚急性T淋巴細(xì)胞白血病模型乳讥。c-Myc是常用的致癌基因柱查，將其與淋巴細(xì)胞啟動(dòng)子rag2融合表達(dá)已經(jīng)成功構(gòu)建了多個(gè)急性T淋巴細(xì)胞白血病疾病模型。這些斑馬魚疾病模型和哺乳動(dòng)物之間具有很高的相似性云石，使得進(jìn)一步研究白血病轉(zhuǎn)化機(jī)制成為可能物赶。

急性B淋巴細(xì)胞白血病是一種由未成熟B細(xì)胞前體異常增殖引起的血液惡性腫瘤，在人類ALL病例中約占75%留晚。目前已報(bào)道一種前B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病疾病模型酵紫，它是通過融合癌基因TEL-AML1整體表達(dá)來誘導(dǎo)疾病產(chǎn)生。然而错维，該模型還有白血病發(fā)病率低奖地、潛伏期長(zhǎng)等缺陷，表明誘發(fā)白血病可能還需要其他基因的突變赋焕。

Diamond-Blackfan綜合征（DiamondBlackfan syndrome, DBA）

為遺傳性疾病参歹，僅不足10%患者有家族史，其余多數(shù)患者呈散發(fā)性隆判∪樱患者的主要特征是通常在1歲前出現(xiàn)紅細(xì)胞發(fā)育不良，同時(shí)還伴有各種體型異常侨嘀，如骨骼變形和身材矮小臭挽。超過50%的DBA患者攜帶編碼核糖體蛋白基因的突變。Danilova等通過MO敲低rps19咬腕，構(gòu)建出了DBA的第1個(gè)斑馬魚模型欢峰。此外，其他的核糖體蛋白功能缺失也能引起DBA，如rps14纽帖、rpl11宠漩、rps29。這些基因最初是通過MO敲低構(gòu)建了模型懊直，后來通過轉(zhuǎn)錄激活因子樣效物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases扒吁，TALENs）建立了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系。

此外室囊，斑馬魚還可應(yīng)用于骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes雕崩，MDS）、重癥先天性中性粒細(xì)胞減少癥（severe congenital neutropenia, SCN）波俄、Shwachman綜合征（Shwachman syndrome, SDS）晨逝、遺傳性貧血等血液相關(guān)疾病的研究蛾默，隨著基因敲除技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展懦铺，疾病模型的數(shù)量正在增加，性能也更加穩(wěn)定支鸡。以上研究皆表明冬念，可以利用斑馬魚作為研究人類病因復(fù)雜血液疾病的理想模型。

2.移植評(píng)價(jià)

應(yīng)用斑馬魚進(jìn)行血液腫瘤細(xì)胞移植可以用來定義和量化白血病增殖細(xì)胞以及探究其啟動(dòng)白血病的潛能牧挣。斑馬魚的移植評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)具有諸多優(yōu)勢(shì)：使用受精后4周內(nèi)的斑馬魚胚胎進(jìn)行移植不需要免疫抑制急前，因?yàn)樵摃r(shí)期斑馬魚缺乏成熟的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)；透明的胚胎或成體魚Casper與多種熒光轉(zhuǎn)基因品系相結(jié)合瀑构，促進(jìn)了活體成像技術(shù)在腫瘤發(fā)生發(fā)展研究中的應(yīng)用裆针。

斑馬魚移植受體的免疫系統(tǒng)可被地塞米松或γ射線短暫抑制，卻無法進(jìn)行長(zhǎng)期移植寺晌；且僅可用于同源移植世吨，限制了移植模型的廣泛應(yīng)用。為了解決這些問題呻征，美國(guó)哈佛大學(xué) David Langenau 團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了免疫缺陷斑馬魚模型—rag2^E450fs突變體耘婚。該突變體中功能性T細(xì)胞和B細(xì)胞數(shù)量減少，但仍能存活和繁殖陆赋，并且可進(jìn)行多種組織與癌細(xì)胞長(zhǎng)期穩(wěn)定移植沐祷。但是該模型純合子斑馬魚不能繁殖，以及個(gè)體間B細(xì)胞缺陷差異極大攒岛，可能影響植入潛能赖临。

免疫缺陷斑馬魚模型 jak3^P369fs突變體和prkdc^D3612fs突變體，分別導(dǎo)致T細(xì)胞與NK細(xì)胞灾锯、成熟T細(xì)胞和B細(xì)胞的缺失思杯，兩種突變體均具有植入能力，但只有prkdc純合突變體可以繁殖，并且在細(xì)胞移植后存活色乾。斑馬魚prkdc^–/–誊册，il2rg^–/–雙突變體中T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK 細(xì)胞缺陷暖璧，David Langenau 團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用該免疫缺陷突變體建立并評(píng)估了腫瘤移植模型案怯，能夠重現(xiàn)多種病人來源的腫瘤生長(zhǎng)遷移等情況，并可在單細(xì)胞水平進(jìn)行活體實(shí)時(shí)研究澎办。

3.藥物篩選

斑馬魚模型是進(jìn)行高通量藥物篩選的理想選擇嘲碱，主要基于兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)：(1)整體動(dòng)物模型，可以針對(duì)特定生物學(xué)事件發(fā)現(xiàn)活性化合物和藥物靶標(biāo)局蚀；(2)全面評(píng)估化合物的活性和副作用麦锯，排除具有明顯毒副作用的化合物，縮短藥物研發(fā)周期琅绅。

美國(guó)猶他大學(xué) Nikolaus Trede 團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用淋系轉(zhuǎn)基因斑馬魚進(jìn)行藥物篩選扶欣，確定小分子化合物 Lenaldekar(LDK)可以有效消除不成熟的T細(xì)胞而不影響正常細(xì)胞的細(xì)胞周期，且可延長(zhǎng)大部分T-ALL成魚的生存期千扶。同時(shí)對(duì)于直接取自臨床原發(fā)性白血病（包括難治性B-ALL和慢性粒細(xì)胞白血病）患者的樣本料祠，LDK可以殺死其中大部分的白血病細(xì)胞。這項(xiàng)工作證明了使用斑馬魚篩選抗腫瘤藥物的實(shí)用性澎羞，同時(shí)LDK的發(fā)現(xiàn)也為白血病靶向治療提供了新方向髓绽。

接受異種移植的斑馬魚也是藥物篩選的一個(gè)重要模型。將人類白血病細(xì)胞移植到斑馬魚胚胎中用于篩選非致畸的白血病治療藥物妆绞，結(jié)果顯示伊馬替尼和奧沙福林可消除白血病細(xì)胞顺呕，且對(duì)受體胚胎無毒性；而全反式維甲酸和4EGI-1表現(xiàn)出致畸作用括饶，不能作為抗白血病藥物株茶。

結(jié)語(yǔ)

斑馬魚和哺乳動(dòng)物的血液系統(tǒng)是高度保守的，在斑馬魚中的研究成果有可能適用于人類巷帝。斑馬魚的高繁殖力忌卤，體外胚胎產(chǎn)生、發(fā)育以及胚胎和幼體的透明性楞泼，為斑馬魚的非侵入性體內(nèi)分析提供便利驰徊，使多種遺傳和藥物篩選方法的應(yīng)用成為可能，并可以幫助我們理解疾病病理生理學(xué)堕阔、基因型和表型相關(guān)性棍厂，并最終發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和模式〕剑總之牺弹，斑馬魚具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)浦马，可以與哺乳動(dòng)物模型互補(bǔ)，幫助我們進(jìn)一步理解正常造血和血液疾病张漂，并有望極大地促進(jìn)新藥物的發(fā)現(xiàn)晶默。

以上內(nèi)容參考自《遺傳》雜志發(fā)表的郭佳妮、劉帆航攒、王璐題為”斑馬魚血液疾病模型及應(yīng)用”的論文磺陡；《發(fā)育醫(yī)學(xué)電子雜志》發(fā)表的明邦發(fā)、王歡漠畜、陳柳蓉币他、賈海波、王雅琴題為”斑馬魚血液疾病模型”的論文憔狞。